Искусственный ген N1new, кодирующий нуклеокапсидный белок коронавируса SARS-CoV-2, и рекомбинантная плазмида pET-28a-N1new, обеспечивающая экспрессию искусственного гена

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены ген, позволяющий продуцировать искусственный белок, обладающий иммуногенными свойствами в отношении SARS-CoV-2, плазмида, его содержащая, а также сам искусственный белок, полученный с помощью клеточной линии E. coli, модифицированной описанной плазмидой. Полученный рекомбинантный белок обладает иммуногенными свойствами в отношении SARS-CoV-2 и может быть использован в качестве активной субстанции для получения вакцины против SARS-CoV-2. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 6 пр.

1. Искусственный ген, используемый для получения рекомбинантного Nбелка коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представленный в SEQ ID NO:1 длиной 420 п.н.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК, используемая для получения рекомбинантной линии E.coli, продуцирующая рекомбинантный Nбелок-иммуноген коронавируса SARS-CoV-2, содержащая искусственный ген по п. 1 в составе плазмиды, использующей промоторбактериофаг T7 с соответствующей T7 полимеразой, такой как pET-28a(+).

3. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п. 2, используемая для получения рекомбинантной линии E.coli, продуцирующей рекомбинантный Nбелок-иммуноген коронавируса SARS-CoV-2 с SEQ ID NO: 2, имеющая молекулярную массу 4014050,88 дальтон, размер 6496 п.н. согласно карте плазмиды, представленной на Фиг. 1, содержащая:

f1 ori (f1 bacteriophage origin of replication) – участок инициации репликации ДНК бактериофага f1 (координаты 12-467);

KanR - ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 560-1375);

ori (ori, origin of replication) – участок инициации репликации (координаты 1497-2085);

bom (basis of mobility) – участок для конъюгации (координаты 2271-2413);

ROP – ген, регулирующий копийность плазмиды (координаты 2515-2706);

lacI – транскрипционный репрессор, lacI связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в E.coli (координаты 3515-4597);

lacI promoter – промотор для связывания РНК полимеразы, транскрибирующей ген lacI (координаты 4598-4695);

T7 promoter – промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 4984-5002);

RBS (ribosome binding site) – эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 5042-5064);

T7 terminator – терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 6424-6471);

NcoI/XhoI – фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO:1, используемый для получения нуклеокапсидного белка коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген (координаты 5069-6339);

уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRV - 3796, NcoI - 5069, XbaI - 5030, XhoI– 6334.

4. Рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, полученный с помощью клеток E.coli, трансформированных с помощью плазмиды по пп. 2, 3, в качестве иммуногена в отношении коронавируса SARS-CoV-2.

5. Рекомбинантный белок по п. 4, отличающийся тем, что способен формировать тетрамерную структуру, включающую 4 белка с SEQ ID NO:2.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложен ген, позволяющий продуцировать рекомбинантный искусственный белок, обладающий иммуногенными свойствами в отношении SARS-CoV-2, плазмида, его содержащая, а также сам искусственный белок, полученный с помощью клеточной линии E. coli, модифицированной предлагаемой плазмидой. Полученный рекомбинантный белок обладает иммуногенными свойствами в отношении SARS-CoV-2 и может быть использован в качестве активной субстанции для получения вакцины против SARS-CoV-2.

Описание предшествующего уровня техники

В настоящее время известно несколько способов получения иммуногенного белка для производства вакцины против коронавируса SARS-CoV-2. Так, патент RU 2733831 описывает ген для создания вакцины против коронавируса на основе штамма вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, модифицированного с помощью уникальной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, имеющей молекулярную массу 8,85×10⁶ дальтон, размер 14309 п.н. Данная плазмида кодирует получение искусственного белка-иммуногена RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, с определенной аминокислотной последовательностью. Белок S представляет собой спайковый (Spike, S) белок, который находится на поверхности вируса, в виде шипов на поверхности вируса. С их помощью коронавирус проникает в клетку, таким образом, S белок играет ключевую роль в распознавании рецептора в процессе слияния с мембраной клетки.

Техническим результатом изобретения по патенту RU 2373831 является улучшение фолдинга белка и повышение инфекционного титра рекомбинантного вируса, стабильности целевого трансгена, и иммуногенных/антигенных свойств заявляемого рекомбинантного вируса.

Помимо данного изобретения, известны другие клеточные линии и плазмиды для получения белков, содержащихся в структуре коронавируса SARS-CoV-2, и которые могут быть использованы в качестве активной субстанции для получения вакцины.

Так, согласно заявке CN111607003A, известна система экспрессии белка нуклеокапсида (N) белка и спайкового белка (S1) коронавируса SARS-CoV-2, при этом использована прокариотическая система экспрессии E. coli. Данная комбинация белков SARS-CoV-2N/S1(RBD) может быть использована для создания антигена вакцины против коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. В качестве плазмиды использована плазмида pET30a-SARS-CoV-2-N-S1, содержащая ген для экспрессии двух указанных белков.

Согласно описанной выше заявке CN111607003A, в результате использования данной системы, получается конструкция из 2 белков, которая может быть более аллергенной, не стабильной, а также - иметь значительные побочные действия при применении в качестве вакцины.

Также, из заявки CN112280794 известно получение N белка с помощью pet28a вектора и штамма E. coli BL21(DE3). Данный способ включает многоступенчатую трансформацию штамма E. coli указанным вектором, что в конечном итоге позволяет получить рекомбинантный N белок SARS-CoV-2, который может быть в дальнейшем использован для получения вакцины.

Однако, все указанные способы получения рекомбинантных белков коронавируса SARS-CoV-2 могут иметь свои недостатки, например, при получении белка образуется достаточное количество нецелевых белковых продуктов, что затрудняет очистку и выделение целевого белка и может вызывать аллергические реакции и нестабильность полученного белка. Кроме того, получаемые белки могут иметь неоптимальные показатели иммуногенности и сложности в выделении, очистке и хранении.

Настоящее изобретение предлагает искусственный ген, который может быть использован для получения нуклеокапсидного белка (белка N) вируса SARS-CoV-2, плазмиду, его содержащую, с помощью которой возможно трансформирование клеток E. coli для экспрессии белка N вируса SARS-CoV-2, сам рекомбинантный белок N, способный к формированию четвертичной структуры в виде гомотетрамеров, содержащей 4 рекомбинантных белка в одной единице. Использование искусственного гена для получения белка N, согласно изобретению, приводит к снижению риска неправильного фолдинга белка, снижению вероятности интерферирующих иммунных реакций на полигистидиновый мотив и снижению риска аллергенности при использовании полученного белка N в качестве антигена.

Описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает искусственный ген, который может быть использован для получения нуклеокапсидного белка (белка N) вируса SARS-CoV-2, плазмиду, его содержащую, с помощью которой возможно трансформирование клеток E. coli для экспрессии белка N вируса SARS-CoV-2, а также сам белок N, в т.ч. способный к формированию четвертичной структуры в виде гомотетрамеров, содержащей 4 белка в одной единице.

Согласно настоящему изобретению, предложен искусственный ген, используемый для получения белка N коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представленный в SEQ ID NO:1 длиной 1260 п.н.

Указанный ген может быть включен в состав любой из плазмид семейства pET, использующих промотор бактериофага T7 с соответствующей T7 полимеразой, таких как: pET-9a, pET-24a(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-33b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-42a(+), pET-47b(+), pET-48b(+), pET-49b(+), pET-50b(+) и другие. Указанные плазмиды используются для трансформации штаммов клеток E.coli для экспрессии N белка - иммуногена к коронавирусу SARS-CoV-2.

Также, согласно изобретению, предложена рекомбинантная плазмида pET-28a(+)-N1new, используемая для получения рекомбинантной линии E. сoli, продуцирующей рекомбинатный белок N коронавируса SARS-CoV-2, имеющая молекулярную массу 4014050,88 дальтон, размер 6496 п.н., согласно карте плазмиды, представленной на Фиг. 2, содержащая:

f1 ori (f1 bacteriophage origin of replication) - участок инициации репликации ДНК бактериофага f1 (координаты 12-467);

KanR - ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов E. coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 560-1375);

ori (ori, origin of replication) - участок инициации репликации (координаты 1497-2085);

bom (basis of mobility) - участок для конъюгации (координаты 2271-2413);

ROP ген, регулирующий копийность плазмиды (координаты 2515-2706);

lacI - транскрипционный репрессор lacI связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в E. coli (координаты 3515-4597). Это ингибирование можно снять, добавив лактозу или изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG).

lacI promoter - промотор для связывания РНК полимеразы, транскрибирующей ген lacI (координаты 4598-4695);

T7 promoter - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 4984-5002);

RBS (ribosome binding site) - эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 5042-5064);

T7 terminator - терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 6424-6471);

NcoI/XhoI фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO:1, используемый для получения нуклеокапсидного белка коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген (координаты 5069-6339). Нуклеотидная последовательность плазмиды pET-28a(+)-N1new включает последовательность SEQ ID NO:3.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 420 а.к.о., полученный с помощью предложенной плазмиды, в качестве иммуногена в отношении коронавируса SARS-CoV-2.

При этом, указанный рекомбинантный белок способен формировать четвертичную структуру гомотетрамера, включающую 4 белка с SEQ ID NO:2 длиной 420 а.к.о.

Описание фигур

На Фиг. 1 представлена карта плазмиды pET-28a(+)-N1new.

На Фиг. 2 представлены возможные структуры гомотетрамера белка N
(с тетрамерной структурой): с параллельным и анти-параллельным расположением полипептидных цепей.

На Фиг. 3 представлены гистологические картины легких животных из контрольных и исследуемых групп.

Подробное описание изобретения

Предложен искусственный ген с последовательностью SEQ ID NO:1, который можно использовать для продукции белка N коронавируса SARS-CoV-2, для получения профилактической вакцины против SARS-CoV-2. Данный искусственный ген кодирует рекомбинантный белок-иммуноген, представленный в SEQ ID NO:2 длиной 420 аминокислотных остатков (а.к.о.), который содержит последовательность белка N, белка нуклеокапсида коронавируса SARS-CoV-2. Указанный белок N может использоваться в качестве антигена для получения вакцины или иммуногенной композиции против SARS-CoV-2.

Данные свойства сохраняются у искусственных генов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 с гомологией 70% и выше.

Данный искусственный ген может быть помещен в рекомбинантную плазмиду pET-28a(+), которая в дальнейшем используется для трансформации клеток линии E. coli с целью получения рекомбинантного белка, обладающего иммуногенными свойствами в отношении коронавируса SARS-CoV-2. Данная плазмида имеет молекулярную массу 4014050,88 дальтон, размер 6496 п.н. Карта плазмиды представлена на Фиг. 1. Указанная плазмида содержит:

- f1 ori (f1 bacteriophage origin of replication) - участок инициации репликации ДНК бактериофага f1 (координаты 12-467);

- KanR - ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов E. coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 560-1375);

- ori (ori, origin of replication) - участок инициации репликации (координаты 1497-2085);

- bom (basis of mobility) - участок для конъюгации (координаты 2271-2413);

- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды (координаты 2515-2706);

- lacI - транскрипционный репрессор lacI связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в E. coli (координаты 3515-4597).

- lacI promoter - промотор для связывания РНК полимеразы, транскрибирующей ген lacI (координаты 4598-4695);

- T7 promoter - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 4984-5002);

- RBS (ribosome binding site) - эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 5042-5064);

- T7 terminator - терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 6424-6471);

- NcoI/XhoI фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO:1, используемый для получения нуклеокапсидного белка коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген (координаты 5069-6339).

- Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRV - 3796, NcoI - 5069, XbaI - 5030, XhoI - 6334.

Нуклеотидная последовательность плазмиды pET-28a(+)-N1new включает последовательность SEQ ID NO:3.

Указанная плазмида согласно изобретению позволяет получить трансформированные клеточные линии E. coli, экспрессирующие белок N с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2. Данный белок имеет существенное отличие от рекомбинантных белков, известных ранее. Получаемый в результате рекомбинантный белок N согласно изобретению не имеет His-Tag метки в начале, внутри или конце последовательности, что приводит снижению риска неправильного фолдинга белка, снижению вероятности интерферирующих иммунных реакций на полигистидиновый мотив и снижению аллергенности при использовании его в качестве антигена.

Таким образом, рекомбинантный белок согласно изобретению, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 420 а.к.о. и может быть получен с помощью плазмиды, содержащей искусственный ген, описанный выше. Полученный белок отличается стабильностью, высокой иммуногенностью, и может быть использован в качестве антигена в составе вакцины для профилактики SARS-CoV-2.

Дополнительно, экспериментальные данные динамического рассеяния света показали, что белок N, получаемый согласно изобретению, и не имеющий His-Tag метки, с последовательностью SEQ ID NO:2, имеет способность к самоорганизации в олигомерные структуры, т.е. структуры, включающие одинаковые цепи белка, с доминирующей структурой гомотетрамера. Как показано на Фиг. 2, полипептидные цепочки могут быть расположены параллельно или антипараллельно. Данная структура образует отдельную белковую единицу и также может быть использована в качестве антигена для получения вакцины. Более того, такая гомотетрамерная структура может являться более активной в отношении иммуногенных свойств, чем отдельный белок N с одной полипептидной цепочкой.

Описанный белок как в виде отдельного белка, так и в виде гомотетрамерной структуры может быть использован для получения вакцины в отношении SARS-CoV-2, в виде композиции, содержащей растворитель, а также адъювант, иные вспомогательные вещества, например, стабилизаторы или консерванты, буферные растворы, или в виде лиофилизата, например, с применением лиопротектора или без него.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые не носят ограничительный характер.

Примеры

Пример 1

Получение плазмиды, содержащей ген белка

Плазмиду, содержащую ген белка N (Genbank YP_009724397.2), использовали для получения модифицированной оптимизированной по кодонам нуклеотидной последовательности с использованием Codon Adaptation Index (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/). Кодоны выбраны таким образом, чтобы по возможности использовались наиболее часто встречающиеся у E. coli кодоны, а также содержание нуклеотидов гуанин и цитозин был в диапазоне 50-55%. Последовательность на 5' и 3' концах фланкировалась последовательностями для распознавания эндонуклеазами NcoI (CCATGG) и XhoI (CTCGAG), соответственно. Синтез гена и клонирование по указанным сайтам рестрикции в плазмиду без вставки pET-28a(+) были заказаны на коммерческой основе. Полученную плазмиду секвенировали с помощью праймеров T7_promotor (TAATACGACTCACTATAGGG), fwd_122 (GCCTTATGGTGCAAATAAGG) и fwd_300 (AAACATTGGCCGCAGATTGC) для подтверждения нуклеотидной последовательности и проверки на однонуклеотидные мутации.

Нуклеотидная последовательность соответствовала последовательности
SEQ ID NO:3.

Пример 2

Получение клеточной линии E. coli, модифицированной плазмидой

Клеточную линию E. coli трансформировали по следующему протоколу. Пробирку с компетентными клетками извлекали из морозильной камеры хранения на -80°C. Давали оттаять льду в течение 10 мин. Далее вносили 1 мкл, содержащий 1 пкг-100 нг плазмиды. Аккуратно перемешивали пробирку 4-5 раз. Полученную смесь помещали на лёд на 30 мин. Далее смесь подвергали тепловому шоку при 42°C на 30-60 c. Полученную обработанную смесь помещали на лёд на 5 мин. Вносили 950 мкл среды SOC при комнатной температуре. Инкубировали при 30°C-37°C в течение 1 - 2 ч при перемешивании 250 оборотов в минуту. Высевали 10-50 мкл на чашку с твердой селективной средой, содержащей антибиотик канамицин. Инкубировали при 30°C - 37°C в течение ночи. Выросшие колонии содержат клетки E. coli, трансформированные плазмидой, несущей искусственный ген белка N.

Таким образом получали клеточную линию E. coli с включением искусственного гена согласно изобретению.

Пример 3

Получение рекомбинантного белка N SARS-CoV-2

Биомассу E. coli, содержащую экспрессированный белок N, ресуспендировали в буфере для лизиса (Трис-HCl 50 мM, pH 9) и гомогенизировали с помощью лабораторного гомогенизатора, например, GEA Panda 1000. Все буферы, кроме буферов для хроматографии на третьей стадии очистки, содержали ингибиторы протеаз ЭДТА и ФМСФ. Затем нерастворимую фракцию биомолекул осаждали центрифугированием при 20000 x g, 4°C, 30 мин. Растворимую фракцию переносили в чистую посуду, и к ней добавляли 20% (по массе на объем) сульфата аммония для осаждения белка N. Осажденную фракцию собирали центрифугированием при 20000 x g, 4°C, 30 мин, с последующим растворением в буфере Трис-HCl 50 мM, pH 9. После фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм раствор использовали для хроматографической очистки. Первую стадию очистки на анион-обменной хроматографии проводили в режиме проскока (буфер Трис-HCl 50 мM, pH 9). Вторую стадию очистки на катион-обменной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом NaCl от 0 M до 1 M (буфер Трис-HCl 50 мM, pH 9). Третью стадию очистки на гидрофобной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом сульфата аммония от 1 M до 0 M (буфер NaH₂PO₄ 50 мM, pH 7,5). Идентификацию пиков белка на хроматограммах производили с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в редуцирующих и денатурирующих условиях путем обнаружения соответствующей по молекулярной массе полосе. Полученный после третьей стадии раствор белка диализировали относительно фосфатного буфера (NaCl 0,137 M, NaH₂PO₄ 0,010 M, KH₂PO₄ 0,0018 М, KCl 0,0027 М, pH 7,4).

Анализ аминокислотной последовательности полученного белка

Подтверждение аминокислотной последовательности белка осуществлялось с помощью масс-спектрометрии MALDI-MS пептидов после протеолитического расщепления ферментом трипсином. Спектры были зарегистрированы с использованием матрицы DHB в рефлекторном режиме регистрации положительных ионов. Последовательность SEQ ID NO:2 представляет собой итоговое покрытие последовательности с учетом трипсинолиза. Итоговое покрытие аминокислотной последовательности для образца белка N составило 97,8%.

Пример 4

Исследование иммуногенных свойств белка SARS-CoV-2

Исследование иммуногенных свойств полученного белка проводили на лабораторных животных. Исследование проводили на сирийских хомяках обоего пола в равных соотношениях. Возраст хомяков 8-10 недель к моменту иммунизации, 10-12 недель к моменту заражения вирусом SARS-CoV-2. Условия содержания: в условиях вивария с соблюдением основных зоогигиенических требований: температурный режим 18-22°С, 12-часовой световой день, воды давали вдоволь, кормление производили ежедневно, 2 раза в сутки.

Лабораторные животные, иммунизированные изучаемыми образцами вакцин и подвергнутые заражению возбудителем новой коронавирусной инфекции COVID-19 вирусом SARS-CoV-2 в дозе 4×10⁴ TCID50 (интраназально, 13 мкл вируссодержащего раствора в каждую ноздрю).

Интраназальное введение выполняли с помощью механического дозатора. Активность вируса SARS-CoV-2, полученного из клинического изолята, оценивали с помощью определения 50 % тканевой цитопатической дозы (ТЦД50 (TCID₅₀)) на культуре клеток Vero B в микропланшете.

Животных разделили на группы по 15 самцов и самок, группам вводили:

Контрольная группа 1 и 2 - растворитель (физиологический раствор), 1 мл.

Группа 3 и 4 - 0,5 мл антигена в 1 мл. растворителя.

Далее, хомяков из всех групп инфицировали:

Группа 1 и 3 - вводили коронавирусную инфекцией COVID-19 в виде вируса SARS-CoV-2 в дозе 4×104 TCID50 (интраназально, 13 мкл вируссодержащего раствора в каждую ноздрю).

Группа 2 и 4 - в качестве контрольного образца интраназально вводили аналогичный объем супернатанта культуральной жидкости (13 мкл в каждый носовой ход).

За 1 сут до введения вируса SARS-CoV-2 у лабораторных животных проводили прижизненный отбор крови для получения сыворотки в объёме 50-100 мкл. Кровь отбирали из ретроорбитального синуса в пробирки с активатором свертывания, которые далее центрифугировали. При выведении животных из эксперимента перед завершением эвтаназии проводили отбор венозной крови в пробирки с активатором свертывания и далее действовали также, как описано выше.

Исследование проводили в течение 14 суток, с ежедневным осмотром. Введение антигена и инфицирование проводили с разрывом в 7 дней, с последующим наблюдением в течение 7 дней. Далее, отбирали кровь, проводили эвтаназию животных и гистологию внутренних органов после вскрытия.

Анализировали по истечении 7 суток после инфицирования: температуру тела, массу тела, определяли количество вируса SARS-CoV-2 в легких и носовых ходах золотистого сирийского хомяка методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (далее - ПЦР-РВ). После эвтаназии и вскрытия определяли массовый коэффициент легких и проводили исследование патоморфологической картины, развившейся в тканях легких, трахеи, печени, селезенки, кишечника, сердца и головного мозга иммунизированных животных, подвергнутых заражению вирусом SARS-CoV-2.

Полученные результаты

У групп 1 и 3 не наблюдали признаков инфицирования. При этом у группы 3 у 4 животных из 15 наблюдали кратковременное повышение температуры (до 39°) в течение суток. Далее, температура становилась нормальной и более не повышалась.

У групп 2 и 4 наблюдали повышение температуры, вялость, отсутствие аппетита. При этом у животных группы 2 температура присутствовала в течение 7-8 дней, наблюдали статистически значимое снижение веса. У двух животных выявлен летальный исход.

После эвтаназии животных рассчитывали массовый коэффициент легких. Результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Массовый коэффициент легких.

* - в скобках указаны значения Me[Q1; Q3].

В ходе анализа полученных данных было установлено, что у хомяков в группах 2 и 4 динамика инфекционного процесса протекала аналогично и по показателю легочного коэффициента характеризовалась статистически значимым увеличением на 7 сут. по сравнении с таковыми на 3 сут и 14 сут. При этом также была прослежена характерная динамика нарастания выраженности поражения легких от 3 сут к 7 сут., и в группе 4 - полный регресс заболевания к 14 сут.

На фоне введения антигена у хомяков в группах 3 и 4 определяли статистически значимо меньшие значения массового коэффициента легких на 7 сут относительно группы 2.

Гистологические изменения, свидетельствующие об уменьшении тяжести поражения лёгких, характеризовались слабо выраженным полнокровием, небольшим количеством дислектазов, отсутствием проявлений цитопатического действия вируса. Просвет альвеол и бронхиол был незначительно заполнен слизистым содержимым. Отмечали слабо выраженные проявления интерстициального отёка, слабо выраженную очаговую инфильтрацию межальвеолярных перегородок клетками лейкоцитарного диферона. Признаки васкулита практически отсутствовали. Через 14 сут после заражения наблюдали остаточные проявления альвеолита и бронхиолита в виде незначительного утолщения стенок альвеол и бронхиол, местами покрытых тонким слоем слизи.

Результаты гистологии клеток легких животных приведены на Фиг. 3.

Пример 5

Определение титра антител

Титр антител, вырабатываемых после введения белка согласно изобретению, определяли по следующей методике.

Использовали следующие реактивы:

1. Посадочные антигены, 1 мкг/мл, 100 мкл/лунку, термостатирование.

2. Блокировка, 0,5 % молоко в отмывочном буфере (20 мM Tрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), термостатирование.

3. Отмывка: Слить содержимое планшета, планшет промыть отмывочным буфером (20 мM Tрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), с последующей просушкой.

4. Нанесение сывороток, подбирается титр для каждой отдельной сыворотки, 100 мкл/лунку, термостатирование.

5. Отмывка: Слить содержимое планшета, планшет промыть отмывочным буфером (20 мM Nрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), с последующей просушкой.

6. Нанесение вторичных антител, разведение 1:64000, 100 мкл/лунку, термостатирование.

7. Отмывка: Слить содержимое планшета, планшет промыть отмывочным буфером (20 мM Nрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), с последующей просушкой.

8. Добавление раствора хромогена, в защищенном от света месте.

9. Добавление стоп-раствора.

10. Съем результатов, длина волны 450 нм, референс 620 нм.

Дополнительное описание реактивов и приборов:

- Антитела кроличьи к антителам мыши (H+L), Goat Anti-Mouse IgG(H+L) (пероксидаза хрена конъюгированная);

- Белок N, полученный согласно настоящему изобретению, концентрация
3,5 мг/мл;

- Позитивная и негативные сыворотки (K+, позитивная сыворотка, сыворотка мышиная после вакцинации белком; K-, негативная сыворотка, интактная мышиная сыворотка № 4);

- Спектрофотометр микропланшентый MultiscanSky, Thermo Fisher.

Критерии приемлемости были подобраны в соответствии с рекомендацией Европейского медицинского агентства (Guideline on bioanalytical method validation). Результаты принимаются, если выполнены критерии пригодности и критерии приемлемости.

Согласно IUPAC, предел обнаружения рассчитывают по стандартному отклонению холостой пробы. Для этого измеряют величину аналитического сигнала для достаточного количества холостых проб и рассчитывают стандартное отклонение их значений.

Как правило, используется формула (Kaiser H. Zur definition der nachweisgrenze, der garantie grenze und der dabei benutzten begriffe, Дёрффель К. Статистика в аналитической химии): LOD = Ср. +k*SD, где k = 3, Ср - среднее значение, LOD - предел обнаружения.

Предел обнаружения (LOD) рассчитывают по оптической плотности блокирующего буфера по формуле: LOD = ср+10*SD,

Где Ср - среднее значение оптической плотности блокирующего буфера,
SD - среднеквадратичное отклонение оптической плотности блокирующего буфера.

Принимается, что в образце присутствуют специфичные антитела, если средняя оптическая плотность образца больше, чем Сut-off, при этом Сut-off = LOD + 20% (20% соответствуют критерию пригодности иммуноферментной системы для оптической плотности на уровне поглощения блокирующего буфера (бланка)): Cut-off = 1,2* LOD = 1,2*(Ср+10*SD).

Титром сыворотки считается крайнее разведение, при котором оптическая плотность превышает сигнал дискриминационного уровня (cut-off), используется усредненная оптическая плотность.

Ниже представлены данные по титрам антител, полученные для испытуемых образцов крови, взятых от группы мышей.

Мышам вводили белок, полученный согласно настоящему изобретению, в количестве 50 мг/мл, и спустя 7 дней отбирали кровь с получением сыворотки.

Далее, по рекомендациям, описанным выше, получали значение оптической плотности с пересчетом в титр антител, при этом использовали различное разведение. Результаты представлены в таблице ниже.

Таблица 2. Расчет оптической плотности испытуемых образцов.

Таблица 3. Расчет оптической плотности блокирующего раствора.

Все значения системы и полученных значений оптической плотности позитивной и негативной сыворотки соответствовали критериям приемлемости и пригодности.

Соответственно, титр для образца «мышь 1» составлял 1:64000, для образца «мышь 2» составлял 1:32000.

Далее, таким же образом были получены для других образцов.

Титр для образца «мышь 3» составлял 1:64000, для образца «мышь 4» составлял 1:64000, титр для образца «мышь 5» составлял 1:32000, для образца «мышь 6» составлял 1:32000.

Расчёт титра специфичных антител

Из 6 проанализированных сывороток у 3 сывороток титр составил 1:32000,
у трех - 1:64000.

Среднее геометрическое для данных образцов рассчитывали, как:

Среднегеометрический титр для образцов сывороток после вакцинации равен 1:45255.

Пример 6

Анализ стабильности белка SARS-CoV-2

Стабильность полученного рекомбинантного N белка проверяли в виде раствора в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе), при различных температурах: +4°С, -20°С, +25°С. Далее, по истечении 1, 2, 5, 6, 7 или 14 сут, в зависимости от температуры, исследовали изменения образца методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле, а также размеры частиц методом динамического рассеяния света.

Данные по размерам частиц при хранении представлены ниже.

Таблица 4. Снижение активности белка при хранении в различных условиях.

По данным электрофоретограмм, изменений в составе белка не выявлено.

Полученный белок N является стабильным при рассмотренных температурах.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ФГУП СПбНИИВС ФМБА России

<120> Искусственный ген N1new, кодирующий нуклеокапсидный белок

коронавируса SARS-CoV-2, и рекомбинантная плазмида pET-28a-N1new,

обеспечивающая экспрессию искусственного гена

<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 3

<210> SEQ ID NO 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> искусственная нуклеотидная последовательность

<400> SEQUENCE 1:

atgggcagcgataatggcccgcagaatcagcgtaatgcaccgcgtattacctttggcggc 60

ccgagtgatagtaccggtagtaatcagaatggtgaacgcagtggtgcacgtagcaaacag 120

cgccgcccgcagggcctgcctaataataccgccagttggtttaccgccctgacccagcat 180

ggcaaagaagatctgaaatttccgcgcggtcagggcgtgccgattaataccaatagcagt 240

ccggatgatcagattggctattatcgccgcgccacccgccgcattcgcggtggtgacggt 300

aaaatgaaagatctgagcccgcgttggtatttttattatctgggcaccggcccggaagcc 360

ggtctgccttatggtgcaaataaggatggtattatttgggtggcaaccgaaggtgcactg 420

aataccccgaaagatcatattggtacccgtaatccggcaaataatgcagcaattgttctg 480

cagctgccgcagggtaccaccctgccgaaaggcttttatgccgaaggcagtcgcggcggc 540

agtcaggctagtagccgtagcagtagccgtagtcgcaatagcagtcgcaatagtaccccg 600

ggcagcagccgtggcaccagtcctgctcgtatggcaggtaatggtggtgacgccgccctg 660

gcactgctgctgctggatcgcctgaatcagctggaaagcaaaatgagtggtaaaggccag 720

cagcagcagggccagaccgtgaccaaaaaatctgcagcagaagcaagcaaaaaaccgcgc 780

cagaaacgtaccgcaaccaaagcatataatgtgacccaggcctttggtcgtcgtggtccg 840

gaacagacccagggcaattttggcgatcaggaactgattcgccagggcaccgattataaa 900

cattggccgcagattgcccagtttgccccgagcgcaagcgcatttttcggcatgagtcgc 960

attggcatggaagttaccccgagcggtacctggctgacctataccggtgcaattaagctg 1020

gatgataaagatccgaattttaaagatcaggttattctgctgaacaaacatattgatgcc 1080

tataaaaccttcccgccgaccgaaccgaaaaaagataaaaagaaaaaggcagatgagacc 1140

caggcactgccgcagcgtcagaaaaaacagcagaccgtgacactgctgccggcagccgat 1200

ctggatgattttagtaaacagctgcagcagagtatgagtagcgcagatagtacccaggca 1260

<210> SEQ ID NO 2

<211> 420

<212> искусственная последовательность

<213> искусственная аминокислотная последовательность

<400> SEQUENCE 2:

MGSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQN 30

GERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQH 60

GKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRR 90

ATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEA 120

GLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTR 150

NPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGG 180

SQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPAR 210

MAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQ 240

QQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYN 270

VTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYK 300

HWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGT 330

WLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDA 360

YKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQ 3900

QTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA 420

<160> SEQ ID NO: 3

<210> 3

<211> 6496

<212> DNA

<213> искусственная последовательность

<400> искусственная нуклеотидная последовательность

tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcg 60

cagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttc 120

ctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagg 180

gttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttc 240

acgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgtt 300

ctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattc 360

ttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgattta 420

acaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttt 480

tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgta 540

tccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttat 600

tcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaa 660

actcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactc 720

gtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgaga 780

aatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttcc 840

agacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaac 900

cgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggac 960

aattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatat 1020

tttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcag 1080

tggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggca 1140

taaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctac 1200

ctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattg 1260

tcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatcca 1320

tgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacac 1380

cccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaa 1440

cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttga 1500

gatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcg 1560

gtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagc 1620

agagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaag 1680

aactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcc 1740

agtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcg 1800

cagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac 1860

accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggaga 1920

aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagctt 1980

ccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgag 2040

cgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg 2100

gcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtta 2160

tcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc 2220

agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg 2280

tattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagta 2340

caatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactg 2400

ggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtct 2460

gctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagag 2520

gttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtc 2580

gtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccag 2640

aagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgttt 2700

ggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaa 2760

acgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacg 2820

ttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcaggg 2880

tcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcc 2940

tgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagacttta 3000

cgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagca 3060

gcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaacc 3120

ccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgc 3180

catgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaa 3240

ggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgc 3300

gctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctac 3360

gagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgccca 3420

ccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgccta 3480

atgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaa 3540

cctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtat 3600

tgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttca 3660

ccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa 3720

aatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgt 3780

atcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattg 3840

cgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattca 3900

gcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgcta 3960

tcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccg 4020

agacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagat 4080

gctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtct 4140

ggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatgg 4200

catcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagat 4260

tgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgc 4320

tggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgca 4380

gggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg 4440

ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttt 4500

tcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccgg 4560

catactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactct 4620

cttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccggga 4680

tctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgagg 4740

ccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtccc 4800

ccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtgg 4860

cgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtg 4920

gcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcga 4980

aattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataa 5040

ttttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcgataatggcccgcagaatcag 5100

cgtaatgcaccgcgtattacctttggcggcccgagtgatagtaccggtagtaatcagaat 5160

ggtgaacgcagtggtgcacgtagcaaacagcgccgcccgcagggcctgcctaataatacc 5220

gccagttggtttaccgccctgacccagcatggcaaagaagatctgaaatttccgcgcggt 5280

cagggcgtgccgattaataccaatagcagtccggatgatcagattggctattatcgccgc 5340

gccacccgccgcattcgcggtggtgacggtaaaatgaaagatctgagcccgcgttggtat 5400

ttttattatctgggcaccggcccggaagccggtctgccttatggtgcaaataaggatggt 5460

attatttgggtggcaaccgaaggtgcactgaataccccgaaagatcatattggtacccgt 5520

aatccggcaaataatgcagcaattgttctgcagctgccgcagggtaccaccctgccgaaa 5580

ggcttttatgccgaaggcagtcgcggcggcagtcaggctagtagccgtagcagtagccgt 5640

agtcgcaatagcagtcgcaatagtaccccgggcagcagccgtggcaccagtcctgctcgt 5700

atggcaggtaatggtggtgacgccgccctggcactgctgctgctggatcgcctgaatcag 5760

ctggaaagcaaaatgagtggtaaaggccagcagcagcagggccagaccgtgaccaaaaaa 5820

tctgcagcagaagcaagcaaaaaaccgcgccagaaacgtaccgcaaccaaagcatataat 5880

gtgacccaggcctttggtcgtcgtggtccggaacagacccagggcaattttggcgatcag 5940

gaactgattcgccagggcaccgattataaacattggccgcagattgcccagtttgccccg 6000

agcgcaagcgcatttttcggcatgagtcgcattggcatggaagttaccccgagcggtacc 6060

tggctgacctataccggtgcaattaagctggatgataaagatccgaattttaaagatcag 6120

gttattctgctgaacaaacatattgatgcctataaaaccttcccgccgaccgaaccgaaa 6180

aaagataaaaagaaaaaggcagatgagacccaggcactgccgcagcgtcagaaaaaacag 6240

cagaccgtgacactgctgccggcagccgatctggatgattttagtaaacagctgcagcag 6300

agtatgagtagcgcagatagtacccaggcataactcgagcaccaccaccaccaccactga 6360

gatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaa 6420

taactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaagga 6480

ggaactatatccggat 6496

<---