[1]ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[2][0001] Настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза и его применению, в частности, к слитому белку, обладающему VEGF-ингибирующей активностью и FGF-ингибирующей активностью, а также к его применению в ингибировании вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной повышенным уровнем глюкозы пролиферации клеток, миграции клеток и/или формирования просвета, таком как ингибирование ангиогенеза в сетчатке, связанных с ангиогенезом заболеваний глаз, диабетической ретинопатии, возрастной макулодистрофии и т.п.
[4][0002] Неоваскуляризация глазного дна представляет собой серьезное осложнение различных заболеваний глаз. Неоваскуляризация может происходить практически во всех тканях глаза, таких как роговица, цилиарное тело радужной оболочки, сосудистая оболочка, сетчатка, желтое пятно и диск зрительного нерва, вызывая серию патологических изменений, таких как кровоизлияние в ткани, экссудацию и гиперплазию этих областей, нарушая, таким образом, структуру и функцию глазного яблока и вызывая серьезное нарушение зрительной функции. Эта серия заболеваний глазного дна включает диабетическую ретинопатию (ДР), ретинопатию недоношенных (РН), возрастную макулодистрофию (ВМД) и т.п., которые серьезно влияют на зрение и даже вызывают слепоту.
[5][0003] Исследования показали, что VEGF в настоящее время известен как наиболее специфический и эффективный фактор роста для ангиогенеза. С 1990-х годов лекарственные средства, направленно воздействующие на VEGF и ингибирующие ангиогенез в глазном дне путем блокирования сигнального пути VEGF, стали активным направлением для разработки. Ранибизумаб (торговое название Луцентис) может специфично связываться с VEGF-A, и был одобрен FDA США для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии и диабетического макулярного отека. VEGF Trap-Eye (афлиберцепт или Эйлеа) представляет собой рекомбинантный белок против VEGF, разработанный Regeneron Pharmaceuticals в США, и была подана дополнительная заявка на лечение ДМО, поскольку по результатам клинических исследований была продемонстрирована удовлетворительная эффективность при ДМО (диабетическом макулярном отеке). KH902 (конберцепт) представляет собой VEGFR-Fc рекомбинантный белок, разработанный компанией Chengdu Kanghong Company для лечения возрастной макулодистрофии (ВМД), который был одобрен для выпуска в продажу в декабре 2013 года. Успешное применение ранибизумаба с VEGF в качестве мишени в клинических исследованиях и клиническое применение при ДР показывает, что VEGF является одной из основных эффективных мишеней при ДР.
[6][0004] Хотя лекарственные средства, направленно воздействующие на VEGF, претерпели существенный клинический прогресс, регуляция ангиогенеза является очень сложным процессом с динамическим балансом, поскольку ангиогенез регулируется множеством факторов. Из-за значительных ограничений существующих лекарственных средств в клиническом лечении, способы дополнительного улучшения эффекта клинического лечения средствами против ангиогенеза не только представляют проблему, которую необходимо решить исследователям, но и являются предметом исследований и разработок следующего поколения антиангиогенных средств.
[7][0005] Фактор роста фибробластов (FGF), который представляет собой семейство факторов роста, которые связываются с гепарином, играет важную роль в различных биологических функциях, таких как пролиферация клеток, дифференцировка, миграция, ангиогенез и туморогенез. Он выполняет свои различные биологические функции при связывании и активации рецепторов FGF (FGFR) на клеточной поверхности. Рецептор фактора роста фибробластов (FGFR) представляет собой рецептор, который связывается с членами семейства факторов роста фибробластов (FGF), и часть которого участвует в патологическом процессе.
[8][0006] Заявители в патенте CN201110131029.X раскрыли биспецифический слитый белок, направленно воздействующий на VEGF и FGF (слитый белок 28# в патенте CN 201110131029.X, далее кратко обозначаемый как VF28), результаты исследований показали, что слитый белок VF28 обладает хорошей биологической активностью и может эффективно воздействовать на мишени VEGF и FGF, оказывая значимый эффект при лечении или профилактике опухолей и/или заболеваний, связанных с глазным ангиогенезом. Однако в ходе исследования было обнаружено, что активность полученного VF28 становилась нестабильной при увеличении времени хранения. В длительных тестах 3 партий стоковых растворов VF28 (в условиях длительного теста при -80°C±10°C) анализ активности связывания (метод ИФА) проводили после хранения в течение 0 часа, 1 месяца, 3 месяцев, 6 месяцев, при этом данные показали, что результаты тестов активности связывания 1 партии, 2 партий и 3 партий стоковых растворов VF28 соответственно не соответствовали требованиям критериев оценки в каждой точке времени мониторинга через 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев (из-за несоответствия активности связывания в конце FGF). В тесте на стабильность трех партий готовых продуктов VF28 в условиях ускоренного теста анализ клеточной активности проводили после помещения на один месяц в условия ускоренного теста при 25°C±2°C. Результаты показали, что результаты теста клеточной активности одной из трех партий готовых продуктов VF28 превышали критерии оценки и не соответствовали критериям оценки.
[10][0007] В ответ на вышеуказанные проблемы настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза с модифицированной структурой, RC28-05, направленно воздействующему на VEGF и FGF, который не только обладает хорошей биологической активностью и может эффективно ингибировать ангиогенез в сетчатке, оказывая заметное терапевтическое действие при заболеваниях глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулодистрофия, но также и продукты, полученные на его основе, являются стабильными при хранении, не разлагаются и имеют низкие требования к температуре при хранении и окружающей среде.
[11][0008] В частности, настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1.
[12][0009] Кроме того, бифункциональный ингибитор ангиогенеза имеет VEGF-ингибирующую активность и FGF-ингибирующую активность.
[13][0010] Кроме того, бифункциональный ингибитор ангиогенеза может ингибировать вызванную двумя факторами VEGF и FGF или вызванную высоким уровнем глюкозы пролиферацию клеток, миграцию клеток и/или формирование просвета.
[14][0011] Настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза в сетчатке.
[15][0012] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний глаз.
[16][0013] Предпочтительно связанные с ангиогенезом заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из: возрастной макулодистрофии, такой как сухая форма ВМД и влажная форма ВМД, диабетической ретинопатии, такой как непролиферативная ДР, пролиферативная ДР и ДМО, диабетического макулярного отека, ретинопатии недоношенных и окклюзии сосудов сетчатки.
[17][0014] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в лекарственном средстве для уменьшения повреждения сетчатки у субъекта с диабетом.
[18][0015] Предпочтительно повреждение сетчатки является кратковременным повреждением сетчатки.
[19][0016] Кроме того, кратковременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из сокращения количества апоптотических клеток в сосудистой сети сетчатки, уменьшения проникновения через гемато-ретинальный барьер, ингибирования реактивной пролиферации глиальных клеток сетчатки и улучшения ультраструктуры невральной сетчатки и кровеносных сосудов сетчатки.
[20][0017] Предпочтительно повреждение сетчатки является долговременным повреждением сетчатки.
[21][0018] Кроме того, долговременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из уменьшения проникновения через ретинальный барьер и ингибирования утолщения базальной мембраны капилляров.
[22][0019] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для улучшения области аваскулярной перфузии сетчатки или уменьшения количества ядер клеток ретинальной неоваскуляризации у субъекта с ретинопатией. Предпочтительно субъект с ретинопатией является недоношенным ребенком.
[23][0020] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для уменьшения пролиферации эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, миграции и/или формирования просвета у субъекта.
[24][0021] Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую бифункциональный ингибитор ангиогенеза, где аминокислотная последовательность бифункционального ингибитора ангиогенеза показана в SEQ ID NO: 1, а нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID NO:3.
[25][0022] Настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей вышеуказанный полинуклеотид, где полинуклеотид функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
[26][0023] Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему вышеуказанный полинуклеотид, предпочтительно вектор является вектором экспрессии, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
[27][0024] Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей вышеуказанную полинуклеотидную конструкцию или нуклеиновую кислоту, или вектор экспрессии, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида. Предпочтительно клетка является клеткой млекопитающего или гуманизированной клеткой. Более предпочтительно клетка является клеткой CHO.
[28][0025] Настоящее изобретение также относится к способу получения бифункционального ингибитора ангиогенеза, включающему культивирование клетки-хозяина, описанной в любом из предыдущих пунктов, при условиях, обеспечивающих экспрессию бифункционального ингибитора ангиогенеза, и выделение ингибитора.
[29][0026] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей полипептид и/или вектор, описанный в любом из предыдущих абзацев.
[30][0027] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему вышеуказанную композицию.
[31]КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[32][0028] Фиг. 1. Ингибиторные эффекты VF28 и RC28-05 в отношении пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165.
[33][0029] Фиг. 2. Ингибиторные эффекты VF28 и RC28-05 в отношении пролиферации клеток HUVEC, стимулированных bFGF.
[36][0031] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют свои обычные значения, известные средним специалистам в данной области. По поводу определений и терминов в уровне техники специалисты в данной области могут, в частности, обратиться к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Сокращенные обозначения аминокислотных остатков являются стандартными 3-буквенными и/или 1-буквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.
[37][0032] Хотя числовые диапазоны и приближенные значения параметров показаны в широком объеме настоящего изобретения, числовые значения, показанные в конкретных примерах, записаны с максимальной точностью. Однако любое числовое значение должно содержать некоторую ошибку, которая вызвана стандартным отклонением соответствующих измерений. Кроме того, следует понимать, что все раскрытые в настоящем изобретении диапазоны охватывают любые возможные поддиапазоны, входящие в них. Например, записанный диапазон "от 1 до 10" следует рассматривать как включающий любые возможные поддиапазоны между минимальным значением 1 и максимальным значением 10 (включая конечные точки); то есть все поддиапазоны, начинающиеся с минимального значения 1 или больше, например от 1 до 6,1, и поддиапазоны, заканчивающиеся максимальным значением 10 или меньше, например от 5,5 до 10. Кроме того, любую ссылку, указанную как "включенную в настоящий документ", следует понимать как включенную во всей своей полноте.
[38][0033] При использовании в настоящем изобретении термин "растворимый" белок относится к белку, который растворяется в водном растворе при биологических значениях температуры, уровня рН и осмотического давления. В некоторых конкретных технических решениях слитый белок согласно настоящему изобретению является растворимым слитым белком.
[39][0034] При использовании в настоящем изобретении термин "выделенный" относится к следующим веществам и/или соединениям, которые: (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, первоначально связанных с ним (в естественном окружении и/или в условиях теста), и/или (2) получены, изготовлены и/или произведены искусственно. Отделенные вещества и/или соединения могут быть отделены по меньшей мере от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, по существу 100% или 100% других компонентов, первоначально связанных с ними. В некоторых конкретных технических решениях слитый белок согласно настоящему изобретению является выделенным слитым белком.
[40][0035] Термин "VEGF" при использовании в настоящем изобретении относится к фактору роста эндотелия сосудов. Термин "VEGFR" при использовании в настоящем изобретении относится к рецептору фактора роста эндотелия сосудов, которым может быть VEGFR1, VEGFR2 и/или VEGFR3. Предпочтительно VEGFR в настоящем изобретении представляет собой VEGFR1 и/или VEGFR2, предпочтительно VEGFR человека.
[41][0036] Термин "FGF" при использовании в настоящем изобретении относится к фактору роста фибробластов. Термин "FGFR" при использовании в настоящем изобретении относится к рецептору фактора роста фибробластов, которым может быть FGFR1, FGFR2, FGFR3 и/или FGFR4. Предпочтительно FGFR в настоящем изобретении представляет собой FGFR1, более предпочтительно FGFR1 человека.
[42][0037] Термин "субъект" при использовании в настоящем изобретении включает млекопитающих, таких как человек, таких как домашние животные (такие как собаки, кошки и т.п.), домашних животных (таких как коровы, овцы, свиньи, лошади и т.п.) или лабораторных животных (таких как обезьяны, крысы, мыши, кролики, морские свинки и т.п.).
[43][0038] Слитый белок согласно настоящему изобретению может дополнительно включать посттрансляционные модификации. Такие модификации включают, без ограничения, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. В результате модифицированный белок может включить неаминокислотные компоненты, такие как полиэтиленгликоль, липиды, полисахариды или моносахариды и фосфорную кислоту. Влияние таких неаминокислотных компонентов на функцию белка можно тестировать, как описано в настоящем изобретении. В случае продукции белков в клетках, посттрансляционный процессинг также может быть важен для правильного фолдинга и/или функции слитого белка. Различные клетки (такие как CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или HEK293) имеют специфический клеточный аппарат и уникальные механизмы для такой посттрансляционной активности, и для обеспечения правильной модификации и процессинга белков могут быть выбраны разные клетки.
[44][0039] Белки, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены любым способом, известным в уровне техники. Например, они могут быть получены с помощью химического синтеза или при экспрессии нуклеиновой кислоты. Пептиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть легко получены в соответствии с хорошо известными стандартными методами жидкофазного или, предпочтительно, твердофазного пептидного синтеза, известными в данной области (см., например, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), в M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)). Слитый белок можно получить при использовании известных в данной области методик образования одной или более внутримолекулярных поперечных связей между остатками цистеина, расположенными в полипептидной последовательности, которая, как ожидается, будет включена в белок (см., например, патент США 5478925). Кроме того, слитый белок, описанный в настоящем изобретении, может быть стандартно модифицирован путем добавления цистеинов или биотинов на C-конец или N-конец гибридного белка.
[45][0040] Термин "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" при использовании в настоящем изобретении относится к дозе, достаточной для демонстрации своего действия субъекту, которому будут ее вводить. Фактическое количество, а также частота и график введения будут зависеть от собственного состояния субъекта и тяжести состояния. Назначение лечения (например, определение дозы и т.п.), в конечном счете, является сферой ответственности врачей общей практики и других врачей и зависит от принятия ими решения, обычно с учетом заболевания, подлежащего лечению, состояния отдельного пациента, участка доставки, способа введения и других факторов, известных врачам.
[46][0041] При использовании в настоящем изобретении термин "VF28" означает определенный слитый белок VEGFR-FGFR, включающий второй Ig-подобный домен VEGFR1, третий Ig-подобный домен VEGFR2 и часть, полученную из промежуточной функциональной области последовательности Ig-подобного домена FGFR, второго Ig-подобного домена FGFR, третьего Ig-подобного домена FGFR и Fc-фрагмента. VF28 является сокращенным обозначением 28# слитого белка в китайском патенте 201110131029.X, способ конструирования которого и другую соответствующую информацию можно найти в описании китайского патента 201110131029.X. В частности, аминокислотная последовательность VF28 показана в SEQ ID NO:2.
[47][0042] При использовании в настоящем изобретении термин "стоковый раствор" относится к раствору слитого белка, очищенному и фасованному в контейнере для промежуточного хранения. Стоковый раствор в настоящем изобретении получают с помощью афинной хроматографии, обработки с целью удаления вируса, грубой фильтрации и хроматографии, а также тонкой фильтрации раствора клеточной культуры. Термин "готовый продукт" при использовании в настоящем изобретении относится к раствору слитого белка, полученному путем стерилизации и фильтрации стокового раствора с его последующим фасованием в стерильный конечный контейнер и упаковкой. Готовый продукт в настоящем патенте получают путем стерилизации и фильтрации стокового раствора с добавлением в некотором соотношении вспомогательных материалов (дигидрофосфата натрия, хлорида натрия, сахарозы, полисорбата 80).
[48][0043] При использовании в настоящем изобретении термин "FGF-Trap" относится к слитому белку FGFR-Fc, который может использоваться в качестве ловушки (англ. trap) FGF, антагонистически воздействуя, таким образом, на FGF. В частности, FGF-Trap, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой слитый белок 26# FGFR, способ конструирования которого и другую соответствующую информацию можно найти в CN102219860A.
[49][0044] Термин "VEGF-Trap" при использовании в настоящем изобретении относится к слитому белку VEGFR-Fc, который может использоваться в качестве ловушки VEGF, антагонистически воздействуя, таким образом, на VEGF. В частности, VEGF-Trap, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой рекомбинантный белок против VEGF (EYLEA, Эйлеа), разработанный компанией Regeneron Pharmaceutical, США, который доступен в продаже.
[50][0045] Примеры используются для более подробного описания и пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться в качестве ограничения настоящего изобретения.
[51][0046] Пример 1: Выбор клеток-хозяев
[52][0047] Клетки яичника китайского хомячка (CHO/dhfr-), дефицитные по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR), были приобретены в ATCC, США под номером в каталоге CRL-9096 и номером партии 3916620. Клетки CHO/dhfr культивировали в полной среде IMDM с добавлением гипоксантина и тимидина (HT) и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки были полигональными и росли адгерентно. После 3 пассажей клетки замораживали в жидком азоте для хранения. Для получения клеток CHO/dhfr, адаптированных к бессывороточной суспензионной культуре, пробирку с замороженными клетками размораживали в водяной бане при 37°C и суспендировали в среде Ex-Cell 302 CHO (Sigma), содержащей 10% FBS и HT, затем адгерентно выращивали во флаконе для культур клеток. Если клетки росли хорошо, их суспендировали в 30 мл среды Ex-Cell 302 CHO, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, для культивирования во встряхиваемом флаконе. Когда клетки вырастали до 1-2×106/мл, клетки переносили в среду для культивирования клеток Ex-Cell 302 CHO, содержащую 2,5% фетальной бычьей сыворотки, для культивирования во встряхиваемом флаконе. Таким образом, поэтапно проводили адаптацию в среде Ex Cell 302, содержащей 1,5% и 0,5% фетальной телячьей сыворотки, соответственно, при культивировании во встряхиваемом флаконе. Наконец, клетки суспендировали в бессывороточной среде Ex Cell 302 CHO для культивирования во встряхиваемом флаконе. Если клетки росли хорошо, клетки собирали с помощью центрифугирования, суспендировали в среде Ex-Cell 302 CHO, содержащей 10% ДМСО, и замораживали в жидком азоте для хранения, получив банк исходных клеток CHO, адаптированных в бессывороточной культуре. Клетки СНО, адаптированные в бессывороточной культуре, были круглыми или почти круглыми в условиях суспензионной культуры.
[53][0048] Пример 2: Ген, представляющий интерес
[54][0049] Слитый белок RC28-05 является слитым белком с бифункциональной, ингибирующей ангиогенез активностью, который состоит из неполных аминокислотных последовательностей VEGFR и FGFR, слитых с Fc-фрагментом иммуноглобулина человека, аминокислотная последовательность которого показана ниже (как показано в SEQ ID NO:1):
[55]GRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG KRIIWDSRKG 60
[56]FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN 120
[57]CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY 180
[58]TCAASSGLMT KKNSTFVRVH EKPVAPYWTS PEKMEKKLHA VPAAKTVKFK CPSSGTPNPT 240
[59]LRWLKNGKEF KPDHRIGGYK VRYATWSIIM DSVVPSDKGN YTCIVENEYG SINHTYQLDV 300
[60]VERSPHRPIL QAGLPANKTV ALGSNVEFMC KVYSDPQPHI QWLKHIEVNG SKIGPDNLPY 360
[61]VQILKTAGVN TTDKEMEVLH LRNVSFEDAG EYTCLAGNSI GLSHHSAWLT VLEADKTHTC 420
[62]PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN 480
[63]AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 540
[64]QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL 600
[65]YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K 641
[66][0050] Нуклеотидная последовательность RC28-05 показана ниже (1923 пн) (как показано в SEQ ID NO: 3):
[67]ggtagaccat tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60
[68]agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120
[69]tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180
[70]ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240
[71]aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300
[72]gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360
[73]tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420
[74]aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480
[75]aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540
[76]acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600
[77]gaaaaacccg tagctccata ttggacatcc ccagaaaaga tggaaaagaa attgcatgca 660
[78]gtgccggctg ccaagacagt gaagttcaaa tgcccttcca gtgggacccc aaaccccaca 720
[79]ctgcgctggt tgaaaaatgg caaagaattc aaacctgacc acagaattgg aggctacaag 780
[80]gtccgttatg ccacctggag catcataatg gactctgtgg tgccctctga caagggcaac 840
[81]tacacctgca ttgtggagaa tgagtacggc agcatcaacc acacatacca gctggatgtc 900
[82]gtggagcggt cccctcaccg gcccatcctg caagcagggt tgcccgccaa caaaacagtg 960
[83]gccctgggta gcaacgtgga gttcatgtgt aaggtgtaca gtgacccgca gccgcacatc 1020
[84]cagtggctaa agcacatcga ggtgaatggg agcaagattg gcccagacaa cctgccttat 1080
[85]gtccagatct tgaagactgc tggagttaat accaccgaca aagagatgga ggtgcttcac 1140
[86]ttaagaaatg tctcctttga ggacgcaggg gagtatacgt gcttggcggg taactctatc 1200
[87]ggactctccc atcactctgc atggttgacc gttctggaag ccgacaaaac tcacacatgc 1260
[88]ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1320
[89]cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1380
[90]agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1440
[91]gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1500
[92]accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1560
[93]gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1620
[94]caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1680
[95]tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1740
[96]ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1800
[97]tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1860
[98]gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1920
[100][0051] Обычный вектор экспрессии встраивали после введения двух сайтов расщепления на оба конца последовательности гена-мишени RC28-05. Клетки CHO трансфицировали общим методом для отбора штамма клеток, экспрессирующих RC28-05, и проводили экспрессию слитого белка RC28-05.
[101][0052] Пример 3: Анализ аффинности слитого белка
[102][0053] VF28 и RC28-05 тестировали на аффинность при использовании ForteBio Octet (PALL). PBS (pH 7,4) добавляли в виде сбалансированного раствора в каждую лунку колонки 1 планшета для детектирования A-E, датчик погружали в раствор и активировали в течение 10 мин; RC28-05 и VF28 соответственно разбавляли PBS до концентрации 50 нМ и добавляли в колонку 2 рядов A-E 96-луночного планшета для анализа с помощью программы, установленной на нанесение, в течение 300 сек; PBS добавляли в качестве сбалансированного раствора в каждую лунку колонки 3 рядов A-E планшета для детектирования, с помощью программы, установленной на базовый уровень, в течение 180 сек; rhVEGF (R&D) и rhFGF (R&D) разбавляли соответственно до концентрации 500 нМ и 400 нМ при использовании PBS в качестве разбавителя, а затем серийно разводили в соотношении 1:2 для трех градиентов (всего четыре градиента) до концентрации 62,5 нМ и 50 нМ. Серийные разведения образцов добавляли в колонку 4 рядов A-D 96-луночного планшета, тогда как разведение добавляли в колонку 4 ряда E в качестве отрицательного контроля, с помощью программы, установленной на связывание, в течение 600 сек; PBS добавляли в качестве раствора для диссоциации в каждую лунку в колонке 5 рядов A-E с помощью программы, установленной на диссоциацию, в течение 1800 сек; добавляли 10 мМ глицина (pH 1,5) и PBS в качестве раствора для регенерации и раствора для нейтрализации в колонки 6 и 7 рядов A-E, соответственно, с помощью программ, соответственно установленных на регенерацию и нейтрализацию, по 15 сек каждая, с повтором 5 раз. Всего протестировали 3 цикла, данные анализировали с помощью программы Data analysis 7.0. Значение равновесной константы (KD) вычисляли с вычитанием фона при использовании соответствующего несвязанного с rhVEGF/rhFGF сенсора в качестве контроля. Результаты показаны в Таблице 1. Результаты показали, что RC28-05 и VF28 обладают хорошей аффинностью к rhVEGF и rhFGF.
[103]Таблица 1. Статистика результатов сравнения аффинности RC28-05 и VF28
[104]| Образцы | Факторы | Равновесная константа KD (M) | Константа связывания kon (1/Мс) | Константа диссоциации kdis (1/с) | N |
| RC28-05 | rhVEGF165 | 2,70E-10±1,28E-10 | 2,30E+05±0,64E+05 | 5,65E-05±0,75E-05 | 3 |
| VF28 | rhVEGF165 | 2,51E-10±5,65E-11 | 2,76E+05±7,94E+04 | 6,68E-05±1,31E-05 | 3 |
| RC28-05 | rhFGF2 | 3,28E-09±1,60E-09 | 2,66E+04±1,01E+04 | 7,96E-05±2,42E-05 | 3 |
| VF28 | rhFGF2 | 5,24E-09±2,07E-09 | 1,90E+04±1,74E+03 | 9,78E-05±3,26E-05 | 3 |
[105][0054] Пример 4: Исследование активности слитого белка в клетках
[106][0055] Клетки HUVEC после 10 пассажей инокулировали в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунка (т.е. 5000 клеток/лунка) при плотности, доведенной до 5×104 клеток/мл. После прикрепления клеток добавляли кондиционированную среду или фактор VEGF165 или bFGF (40 нг/мл), или VEGF165+различные концентрации лекарственных средств RC28-05 или VF28 (конечные концентрации 0, 0,0125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 5, 25 нМ) или bFGF+различные концентрации лекарственных средств RC28-05 или VF28 (конечные концентрации 0, 0,0156, 0,0625, 0,25, 0,5, 1, 2, 8, 32 нМ) в количестве 100 мкл/лунка с конечным объемом культуры 200 мкл/лунка, 3 экземпляра на образец; культивирование производили непрерывно при 37°C в инкубаторе с 5% CO2. Через 72 часа после добавления лекарственного средства культуральную среду в 96-луночном планшете удаляли досуха с помощью центрифугирования и в каждую лунку добавляли базальную среду для культивирования эндотелиальных клеток, содержащую 10% CCK-8, по 100 мкл/лунка. Инкубирование проводили при 37°C в течение 4 часов и определяли OD450 с помощью фотометра для микропланшетов. Степень ингибирования соответствующими лекарственными средствами пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF при каждой концентрации, вычисляли как уровень ингибирования пролиферации клеток % = (OD фактор - OD (фактор+лекарственное средство))/OD фактор ×100. Значения IC50 лекарственных средств вычисляли с помощью программы Prism, и уровни ингибирования максимальной концентрации лекарственного средства тестировали с применением измеренных значений. Сравнивали различия между RC28-05 и VF28 в ингибировании пролиферации клеток HUVEC при стимуляции VEGF165/bFGF. Результаты ингибирования VF28 и RC28-05 пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF, показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2, и статистика максимального уровня ингибирования и значений IC50 представлена в Таблице 2. Результаты показали, что RC28-05 и VF28 обладали значимым ингибирующим действием на пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF.
[107]Таблица 2. Ингибирующее действие RC28-05 и VF28 на пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF
[108]| Лекарственные средства | Стимулирующие факторы | IC50 (нМ) | Максимальный уровень ингибирования (%) |
| VF28 | VEGF165 | 0,48 | 82,34±1,83 |
| bFGF | 3,20 | 70,16±2,79 |
| RC28-05 | VEGF165 | 0,43 | 80,19±0,27 |
| bFGF | 1,50 | 70,40±1,05 |
[109][0056] Пример 5: Получение стоковых растворов RC28-05 и готовых продуктов
[110][0057] Способ получения стоковых растворов RC28-05 и готовых продуктов был таким же, как для VF28, который, в частности, был следующим:
[111]1) После центрифунгирования раствора клеточной культуры супернатант собирали для афинной хроматографии с белком A;
[112]2) После обработки всего собранного элюата органическими растворителями/детергентами (S/D), к элюату добавляли 1% полисорбата 80 (в/об) и 0,3% трибутилфосфата (в/об) и помещали на 20-25°C в течение 6 ч для инактивации вирусов с липидной оболочкой;
[113]3) После вышеуказанной обработки катионообменную хроматографию на сефарозе использовали для удаления сопутствующих примесей, таких как полимеры и продукты деградации;
[114]4) Анионообменную хроматографию проводили со всеми собранными элюатами для удаления небольшого количества агрегатов, белков клеток-хозяев (CHO), хозяйской ДНК и эндотоксинов и т.п.;
[115]5) Пермеат после вышеуказанной хроматографии собирали и затем фильтровали на наномембране для удаления вирусов, не имеющих липидной оболочки;
[116]6) После ультрафильтрации и концентрирования белкового раствора после наномембранной фильтрации до некоторой концентрации (10-15 мг/мл), буферный раствор в объеме 10-12 объемов концентрированного белка (0,02 моль/л дигидрофосфата натрия, 0,015 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л сахарозы, pH 6,8) использовали для диализа с заменой буфера, после чего белковый раствор концентрировали (40-45 мг/мл). После добавления 0,02% (в/об) полисорбата 80 и перемешивания до растворения, производили фильтрацию с использованием мембраны с порами 0,45+0,2 мкм и получаемый в результате белковый раствор представлял собой стоковые растворы RC28-05 с концентрацией белка 40-45 мг/мл.
[117][0058] 7) Получение готовых продуктов: Способ получения 1000 пробирок готовых продуктов с концентрацией 40 мг/мл (0,2 мл/пробирка) был следующим. Концентрацию белка RC28-05 в вышеуказанных стоковых растворах белка определяли и обозначали как C мг/мл, при этом в общей сложности требовалось получить 220 мл раствора белка с учетом 10% потери при заполнении. При этом общее требуемое количество белка составило 220 мл*40 мг/мл*0,2 мл=8,8 г белка, и требуемый объем стокового раствора белка составил V=8,8/C*1000 (мл). Буферный раствор (0,02 моль/л дигидрофосфата натрия, 0,015 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л сахарозы, 0,02% (в/об) полисорбата 80) добавляли к V мл стокового раствора белка до получения объема 220 мл и перемешивали до гомогенного состояния. Фильтрацию производили с использованием фильтрующей мембраны с размером пор не больше 0,22 мкм для стерилизации. После фасования, закатывания алюминиевой мембраной и упаковки получали готовые продукты RC28-05.
[118][0059] Пример 6: Исследование стабильности RC28-05 (стоковые растворы/готовые продукты)
[119][0060] 1. Анализ стабильности стоковых растворов RC28-05
[120][0061] (1) Анализ чистоты при различном времени хранения (-80°C±10°C)
[121][0062] 
метод ЭВЭЖХ
[122][0063] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного теста при -80°C±10°C на 0 часов, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев для анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ). Результаты анализа чистоты тестируемых образцов с помощью эксклюзионной хроматографии в каждой контрольной точке времени показали, что все основные пики составляли ≥95,0%. Для получения более подробной информации см. Таблицу 14.
[123]Таблица 14. Результаты анализа чистоты ЭХ стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
[124]Периоды
Партии | Чистота ЭХ % |
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-YY20160329 | 98,4 | 98,2 | 98,5 | 100,0 |
| RC28-05-YY20160330 | 98,0 | 97,9 | 98,1 | 99,8 |
| RC28-05-YY20160331 | 97,7 | 97,5 | 97,8 | 99,2 |
Примечание: Критерием оценки чистоты после ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;
"мес" означает "месяц". |
[125][0064] 
метод ДСН-ПААГЭ
[126][0065] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331) помещали в условия длительного теста при -80°C±10°C на 0 часов, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев для анализа чистоты (метод ДСН-ПААГЭ). Результаты показаны в Таблице 15. Данные показали, что при увеличении времени хранения все результаты анализа ДСН-ПААГЭ снижения чистоты стоковых растворов RC28-05 были выше 90%.
[127]Таблица 15. Результаты анализа чистоты ДСН-ПААГЭ стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
[128]Периоды
Партии | Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ % |
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-YY20160329 | 98,1 | 98,3 | 97,7 | 97,6 |
| RC28-05-YY20160330 | 98,1 | 98,1 | 97,8 | 97,5 |
| RC28-05-YY20160331 | 98,8 | 98,2 | 97,1 | 97,8 |
Примечание: Критерием оценки чистоты после ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"мес" означает "месяц". |
[129][0066] (2) Исследование активности в клетках стоковых растворов при разном времени хранения (-80°C±10°C)
[130][0067] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного тестирования при -80°C±10°C на 12 месяцев для анализа активности в клетках; результаты показали, что с помощью анализа активности в клетках стоковых растворов RC28-05, помещенных при -80°C±10°C на 12 месяцев, было обнаружено, что относительная активность клеток в каждую контрольную точку времени в период тестирования соответствовала требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 16.
[131]Таблица 16. Результаты тестов относительной активности в клетках стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
[132]Периоды
Партии | Относительная активность в клетках % |
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-YY20160329 | 85,1 | 92,8 | 81,8 | 103,3 |
| RC28-05-YY20160330 | 93,0 | 88,1 | 77,7 | 95,7 |
| RC28-05-YY20160331 | 86,7 | 100,5 | 92,7 | 106,0 |
Примечание: Критерием оценки активности в клетках являлось значение активности, которое должно было составлять 70-130%;
"мес" означает "месяц". |
[133][0068] (3) Эксперимент на активность связывания стоковых растворов при разном времени хранения (-80°C±10°C)
[134][0069] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного тестирования при -80°C±10°C на 12 месяцев для анализа активности связывания (метод ИФА); результаты показали, что с помощью анализа относительной активности связывания стоковых растворов RC28-05, помещенных при -80°C ±10°C на 12 месяцев, было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в период тестирования соответствует требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 17.
[135]Таблица 17. Результаты тестов относительной активности связывания стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
[136]Периоды
Партии | Относительная активность связывания |
| T0 | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| VEGF | FGF |
| RC28-05-YY20160329 | 87,6 | 97,4 | 101,4 | 114,6 | 92,9 |
| RC28-05-YY20160330 | 120,2 | 109,6 | 99,6 | 105,0 | 105,6 |
| RC28-05-YY20160331 | 103,0 | 94,5 | 101,5 | 103,6 | 118,9 |
Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось значение относительной активности связывания, которое должно было составлять 70-130%;
T0 являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе
"мес" означает "месяц". |
[137][0070] 2. Анализ стабильности готового продукта RC28-05
[138][0071] (1) Анализ чистоты при разном времени хранения
[139][0072] метод ЭВЭЖХ
[140][0073] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, в условия ускоренного тестирования при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ). Результаты эксперимента показали, что с помощью анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ) готового продукта, помещенного в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты испытаний чистоты ЭХ тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение экспериментального периода составляли приблизительно 95%; тогда как в случае, когда готовый продукт был помещен в условия ускоренного тестирования при 25°C±2°C на 1 месяц, результаты испытаний чистоты испытательных образцов с помощью ЭХ в каждой контрольной точке времени показали, что все основные пики были ≥95,0%. См. подробную информацию в Таблице 18 и Таблице 19.
[141]Таблица 18. Результаты тестов чистоты ЭХ готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
[142]Периоды
Партии | Чистота согласно ЭХ |
| T0 | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-20160401-1 | 98,4 | 98,4 | 97,4 | 96,9 | 97,9 |
| RC28-05-20160401-2 | 98,1 | 98,1 | 97,0 | 96,6 | 97,1 |
| RC28-05-20160401-3 | 97,7 | 97,7 | 96,7 | 96,4 | 96,9 |
Примечание: Критерием оценки чистоты ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;
"мес" означает "месяц". |
[143]Таблица 19. Результаты тестов чистоты ЭХ готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
[144]Периоды
Партии | Чистота согласно ЭХ |
| 0 д | 10 д | 20 д | 30 д |
| RC28-05-20160401-1 | 98,4 | 96,6 | 96,1 | 96,6 |
| RC28-05-20160401-2 | 98,1 | 96,3 | 95,8 | 96,1 |
| RC28-05-20160401-3 | 97,7 | 96,2 | 95,6 | 95,9 |
Примечание: Критерием оценки чистоты ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;
"мес" означает "месяц". |
[145][0074] метод ДСН-ПААГЭ
[146][0075] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3), помещали в условия длительного тестирования при 5°C ±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа чистоты (метод ДСН-ПААГЭ). Результаты показали, что с помощью анализа чистоты (ДСН-ПААГЭ) готового продукта RC28-05, помещенного при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты анализа снижения чистоты тестируемых образцов с помощью ДСН-ПААГЭ в каждой контрольной точке времени в течение теста были больше 90,0%; посредством анализа чистоты (ДСН-ПААГЭ) готового продукта RC28-05, помещенного при 25°C±2°C на 6 месяцев было обнаружено, что снижение чистоты тестируемых образцов согласно ДСН-ПААГЭ в каждой контрольной точке времени стремилось к уменьшению, тогда как результаты всех тестов были больше 90,0%. См. подробную информацию в Таблице 20 и Таблице 21.
[147]Таблица 20. Результаты тестов чистоты ДСН-ПААГЭ готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
[148]Периоды
Партии | Снижение согласно ДСН-ПААГЭ |
| 0 ч | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-20160401-1 | 98,9 | 97,7 | 97,0 | 96,9 | 95,7 |
| RC28-05-20160401-2 | 97,9 | 97,6 | 96,7 | 97,7 | 95,9 |
| RC28-05-20160401-3 | 98,0 | 97,6 | 97,0 | 96,9 | 96,3 |
Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"мес" означает "месяц". |
[149]Таблица 21. Результаты тестов снижения чистоты ДСН-ПААГЭ готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
[150]Периоды
Партии | Снижение согласно ДСН-ПААГЭ |
| 0 д | 10 д | 20 д | 30 д |
| RC28-05-20160401-1 | 98,9 | 96,3 | 97,5 | 97,8 |
| RC28-05-20160401-2 | 97,9 | 96,1 | 97,4 | 97,6 |
| RC28-05-20160401-3 | 98,0 | 96,0 | 96,8 | 98,1 |
Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"д" означает "день". |
[151][0076] (2) Исследование активности в клетках готовых продуктов при разном времени хранения
[152][0077] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа активности в клетках. Результаты показали, что с помощью анализа активности в клетках готового продукта, помещенного при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все относительные результаты активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение теста удовлетворяли требованиям критериев оценки; все результаты тестов относительной активности в клетках в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества согласно анализу активности в клетках готового продукта, помещенного при 25°C±2°C на 1 месяц. См. подробную информацию в Таблице 22 и Таблице 23.
[153]Таблица 22. Результаты тестов относительной активности в клетках готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
[154]Периоды
Партии | Относительная активность в клетках |
| 0 ч | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-20160401-1 | 120,8 | 125,1 | 111,8 | 85,4 | 100,2 |
| RC28-05-20160401-2 | 104,3 | 125,1 | 96,1 | 85,0 | 103,4 |
| RC28-05-20160401-3 | 105,2 | 111,7 | 100,5 | 93,7 | 100,3 |
Примечание: Критерием оценки относительной активности в клетках являлось то, что относительная активность в клетках должна была составлять 70-130%;
"мес" означает "месяц". |
[155]Таблица 23. Результаты тестов относительной активности в клетках готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
[156]Периоды
Партии | Относительная активность в клетках |
| 0 д | 10 д | 20 д | 30 д |
| RC28-05-20160401-1 | 120,8 | 103,4 | 88,7 | 110,0 |
| RC28-05-20160401-2 | 104,3 | 93,4 | 90,6 | 108,4 |
| RC28-05-20160401-3 | 105,2 | 94,4 | 88,0 | 104,1 |
Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;
"д" означает "день". |
[157][0078] (3) Исследование активности связывания готовых продуктов при разном времени хранения
[158][0079] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3), помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа активности связывания. Результаты показали, что с помощью анализа активности связывания готовых продуктов, помещенных при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты относительной активности связывания тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение теста удовлетворяли требованиям критериев оценки; посредством анализа активности связывания готовых продуктов при 25°C±2°C в течение 1 месяца, все результаты тестов относительной активности связывания (конец VEGF и конец FGF) в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 24 и Таблице 25.
[159]Таблица 24. Результаты тестов относительной активности связывания готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
[160]Периоды
Партии | Относительная активность связывания |
| 0 ч （VEGF; FGF) | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| RC28-05-20160401-1 | 72,8; 90,5 | 111,6 | 107,6 | 104,9 | 119,3 |
| RC28-05-20160401-2 | 76,9; 76,5 | 116,1 | 102,4 | 112,0 | 109,8 |
| RC28-05-20160401-3 | 85,5; 86,1 | 107,1 | 98,5 | 110,2 | 111,1 |
Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось то, что относительная активность связывания должна была составлять 70-130%;
0 ч являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе;
"мес" означает "месяц". |
[161]Таблица 25. Результаты тестов относительной активности связывания готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
[162]Периоды
Партии | Относительная активность связывания |
| 0 д （VEGF; FGF) | 10 д | 20 д | 30 д |
| RC28-05-20160401-1 | 72,8; 90,5 | 112,4 | 104,5 | 95,7 |
| RC28-05-20160401-2 | 76,9; 76,5 | 109,4 | 120,5 | 101,2 |
| RC28-05-20160401-3 | 85,5; 86,1 | 107,8 | 118,6 | 113,1 |
Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось то, что относительная активность связывания должна была составлять 70-130%;
0 ч являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе;
"д" означает "день". |
[163][0080] 3. Выводы из экспериментов
[164][0081] Было исследовано хранение 3 партий стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331) в условиях длительного тестирования при -80°C±10°C. Были получены следующие результаты:
[165] Чистота согласно ЭХ: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены в условия -80°C±10°C на 12 месяцев с их чистотой ЭХ ≥90%.
[166] Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены при -80°C±10°C на 12 месяцев со снжением их чистоты ≥90%.
[167]
Активность в клетках: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены при -80°C±10°C на 12 месяцев. С помощью анализа активности в клетках было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечала требованиям качества.
[168]
Активность связывания: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены при -80°C±10°C на 12 месяцев. С помощью анализа активности в клетках было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества.
[169][0082] Исследовали хранение 3 партий готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) при условиях 5°C±3°C, 25°C±2°C, соответственно. Были получены следующие результаты:
[170] Чистота согласно ЭХ:
[171]3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев с их чистотой ЭХ ≥90%;
[172]3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц с их чистотой ЭХ ≥90%.
[173] Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ:
[174]3 партии RC28-05 готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев со снижением их чистоты согласно ДСН-ПААГЭ ≥90%;
[175]3 партии RC28-05 готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц со снижением их чистоты согласно ДСН-ПААГЭ ≥90%.
[176] Активность в клетках:
[177]3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки;
[178]3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки.
[179] Активность связывания:
[180]3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены при 5°C±3°C на 12 месяцев, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки;
[181]3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены при 25°C±2°C на 1 месяц, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки.
[182][0083] Из этого могут быть сделаны следующие выводы:
[183] Стоковые растворы RC28-05 можно хранить в стабильном состоянии в течение по меньшей мере 12 месяцев при условиях -80°C±10°C, тогда как стоковый раствор VF28 не удовлетворяет требованиям активности после 6 месяцев при таких же условиях.
[184] Готовые продукты RC28-05 можно хранить в стабильном состоянии в течение по меньшей мере 12 месяцев при условиях 5°C±3°C, тогда как VF28 хранился в стабильном состоянии при таких же условиях в течение 6 месяцев.
[185] Готовые продукты RC28-05 можно хранить в стабильном состоянии при 25°C±2°C в течение по меньшей мере 1 месяца, тогда как 1/3 партий стокового раствора VF28 не удовлетворяли требованиям активности при таких же условиях.
[186]В заключение следует отметить, что стоковые растворы RC28-05 были стабильными при -80°C±10°C, тогда как готовые продукты RC28-05 стабильно хранились при условиях 5°C±3°C (в течение по меньшей мере 12 месяцев) и 25°C±2°C (в течение по меньшей мере 1 месяца), время хранения которых в стабильном состоянии было намного более длительным, чем у VF28 при таких же условиях.
[187][0084] Настоящее изобретение было проиллюстрировано различными конкретными примерами. Однако специалист в данной области техники сумеет понять, что настоящее изобретение не ограничивается каждым конкретным вариантом осуществления, при этом средний специалист в данной области сможет внести различные изменения или модификации в рамках объема настоящего изобретения, и любые технические признаки, указанные в каких-либо разделах настоящего описания, могут быть объединены друг с другом без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Такие изменения и модификации входят в объем настоящего изобретения.
