[1]Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию штамма каллусных культур клеток растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.), и может быть использовано для получения биомассы каллусных клеток.
[2]Штамм NEFU Dpalm-1 каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.), полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, регистрационный номер 101.
[3]Заявленное изобретение позволяет получить штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) из первичных каллусов листового происхождения. При этом получаемый штамм каллусной культуры клеток характеризуется стабильными ростовыми параметрами и может быть использован в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения). Кроме того, для культивирования штамма каллусной культуры клеток отсутствует сезонная зависимость.
[4]Культура клеток высших растений может служить альтернативным способом изготовления фитосырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии и пищевой промышленности.
[5]В ряде случаев биомасса клеток in vitro превосходит по свойствам полученную от природного или плантационного растения. Культура клеток также оказывается незаменимой в том случае, когда необходимо произвести сырье редких, исчезающих или тропических видов лекарственных растений (см. Решетников В.Н., Спиридович Е.В., Фоменко Т.И., Носов А.М. Растительная биотехнология - способ рационального использования биосинтетического потенциала в журнале Инженерный журнал: наука и инновации, издательство МГТУ им. Н.Э. Баумана (Москва), 2014, № 5 (135), С. 21-25).
[6]Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.
[7]Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'-O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov D.N., Chirikova N.K., Okhlopkova Z.M., Zulfugarov I.S. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules. 2013 Nov 14; 18(11):14105-21).
[8]Известен способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum (Steph.)) в условиях in vitro (см. RU №2718253, кл. C12N 5/04, опубл. 31.03.2020).
[9]При этом в открытых источниках технические решения в области культивирования клеток D. palmatum (Steph.) не выявлены.
[10]Задачей настоящего изобретения является получение штамма каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) с характерными морфологическими и ростовыми качествами и отсутствием сезонной зависимости их получения.
[11]Поставленная задача решена тем, что получен штамм каллусных культур клеток Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd. в условиях in vitro.
[12]Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм каллусных культур клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) впервые получен в условиях in vitro.
[13]Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, включая оптимизацию питательной среды, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик.
[14]Штамм NEFU Dpalm-1 каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd) идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, регистрационный номер 101.
[15]Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты 30-дневные первичные каллусы листового происхождения, индуцированные из асептических проростков in vitro, полученных из семян северо-восточной популяции (Оймяконский район Республики Саха (Якутия) («Полюс Холода»)) змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.).
[16]Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре показана графическая схема динамики роста каллусной культуры клеток D.palmatum при выращивании в стеклянных чашках Петри диаметром 90 мм (см. фигуру).
[17]Для получения первичного каллуса в качестве экспланта были использованы листья, полученные из стерильных проростков растения. Листовые экспланты, полученные из проростков, помещают в питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) c кинетином в концентрации 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) в концентрации 1 мг/л на стеклянные чашки Петри. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели. Через 4 недели культивирования первичные каллусные культуры пересаживают на другую питательную среду. Состав питательной среды представлен в таблице 1.
[18]Таким образом, получен штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) из первичных каллусов листового происхождения. В процессе культивирования определены ростовые и морфологические характеристики. Полученные данные позволяют отнести штамм к хорошо растущим каллусным культурам клеток высших растений (см. кривую роста на фигуре и параметры роста в таблице 2).
[19]Культивирование проводили в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в стеклянных чашках Петри с диаметром 90 мм. При этом цикл субкультивирования составлял 30 суток. При пересеве каллусной культуры использовали ¼ полученной биомассы.
[20]Штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) обладает следующими признаками: среднеплотный, неоднородный, оводненный, неморфогенный, беловатый каллус со светло бежевым оттенком и с темными участками. Содержит паренхимные небольшие клетки округлой формы.
[21]Таким образом, заявленное решение позволяет получить штамм каллусной культуры клеток из первичных каллусов листового происхождения. При этом штамм каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.) характеризуется стабильными ростовыми параметрами с отсутствием сезонной зависимости при культивировании.
[23]Состав питательной среды
[24]| Компоненты | Содержание, в мг/л |
| NH4NO3 | 33000 |
| KNO3 | 38000 |
| CaCl2x2H2O | 8800 |
| MgSO4x7H2O | 7400 |
| KH2PO4 | 3400 |
| KI | 166 |
| H3BO3 | 1240 |
| MnSO4x4H2O | 4460 |
| ZnSO4x7H2O | 1720 |
| Na2MoO4x2H2O | 50 |
| CuSO4x5H2O | 5 |
| CoCl2x6H2O | 5 |
| FeSO4x7H2O | 5560 |
| Na-ЭДТА | 7460 |
| Мезоинозит | 100 |
| Гидролизат казеина | 500 |
| Тиамин | 100 |
| Пиридоксин | 100 |
| Никотиновая кислота | 100 |
| Сахароза | 30000 |
| 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота | 1 |
| 6-бензиламинопурин | 1 |
| 1-нафтилуксусная кислота | 1 |
| Вода | 1000 мл |
| Агар | 12000 |
[26]Ростовые характеристики каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph. ex Willd.)
[27]| Показатель | I (индекс скорости роста) | μ, сут (удельная скорость роста) | М мах (увеличение веса) в г |
| Сырая биомасса | 11,91 | 0,15 | 5,11 |
| Сухая биомасса | 20,10 | 0,01 | 0,37 |
