[1]ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[2]Машиночитаемая форма перечня последовательностей подана вместе с настоящей заявкой путем подачи в электронном виде и полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. Перечень последовательностей содержится в файле, созданном 3 мая 2016 г., имеющем название ʺSEQUENCE_LISTING_61478_ST25.txtʺ, размер которого составляет 67223 байтов (согласно измерению в операционной системе MS-Windows®).
[4]Предложены способы и композиции для контроля заражения членистоногих паразитами и вредителями. Также предложены способы и композиции для контроля заражения пчел клещом Varroa.
[6]Различные виды членистоногих во все большем объеме культивируются в коммерческом масштабе. Насекомые и их личинки питательны, и их употребляют в пищу во многих культурах как сырыми, так и приготовленными. Ракообразных, таких как крабы, омары, речные раки, мелкие и крупные креветки, искусственно выращивают в крупном коммерческом масштабе, и они составляют важную часть диеты человека. Дополнительно к культивированию видов членистоногих для употребления в пищу, членистоногих также культивируют в рамках стратегии борьбы с вредителями, включая биологический контроль над другими членистоногими, например, культивирование паразитических ос (наездников) для контроля над тараканами и огненными муравьями. Членистоногие также могут служить источником сырья, такого как красители, лекарственные средства, медикаменты и антибиотики. Наряду с возрастающим значением культивирования членистоногих, растут популяции различных вредителей и паразитов, которые уничтожают колонии членистоногих или сильно уменьшают выход продуктов, полученных из культур членистоногих. Соответственно, существует все возрастающая потребность в способах контроля вредителей и паразитов членистоногих.
[7]Среди наиболее важных видов культивируемых членистоногих находится медоносная пчела. Медоносные пчелы Apis mellifera необходимы для эффективного опыления сельскохозяйственных культур и, следовательно, особо важны для мирового сельского хозяйства. Медоносные пчелы также производят экономически важные продукты, включая мед и пчелиный воск. Медоносные пчелы восприимчивы ко множеству паразитов и патогенов, включая эктопаразитарного клеща Varroa destructor.
[8]Клещи Varroa (Varroa destructor) представляют собой паразита номер один для выращиваемых медоносных пчел (Apis mellifera) и являются основной глобальной угрозой коммерческому пчеловодству (Rosenkranz и др. 2010). Взрослый клещ обычно проникает в ячейки с расплодом рабочей и трутневой пчелы перед тем, как они запечатываются, привлеченный феромоном расплода медоносных пчел. Клещ погружается в пищу расплода, которую пчелы помещают внутрь ячейки в преддверии запечатывания, наиболее вероятно, чтобы избежать распознавания и удаления пчелами-кормилицами. После запечатывания ячеек с расплодом пчелами-кормилицами клещ прикрепляется к личинке и начинает поглощать гемолимфу личинки пчелы. Этот процесс запускает оогенез у клещей, и несколько дней спустя за ним следует откладывание мужских и женских яиц. В конце концов, взрослый Varroa выходит из ячейки и прицепляется к высвободившейся пчеле. Varroa непосредственно повреждает медоносных пчел несколькими путями, наиболее значительно путем истощения их запасов, оказывая неблагоприятное влияние на врожденную иммунную систему медоносных пчел, и вследствие того, что он является очень эффективным переносчиком вирусов (Di Prisco и др. 2011), некоторые из которых, как известно, реплицируются внутри клеща, таким образом резко повышая вирусную нагрузку.
[9]Безопасное, эффективное и долгосрочное решение проблемы Varroa является текущей задачей, которую все еще необходимо решить. В настоящее время пчеловоды используют множество способов контролирования уровней Varroa, которые включают различные химические противоклещевые средства (майтициды), большинство из которых утратили эффективность и являются токсичными и/или проникают в воск и мед. Другие способы включают применение щавелевой или муравьиной кислоты, монотерпенов (тимола) и различных других практик контроля с крайне неустойчивыми результатами, включая токсичность для подвергнутых обработке колоний. Выведение пчел, устойчивых к Varroa, например, селекция на основании гигиеничного поведения, которое приводит к удалению зараженного паразитами расплода, позволила добиться умеренного практического успеха.
[10]Синдром разрушения колоний (CCD) медоносных пчел является угрозой полного уничтожения сельского хозяйства в США и во всем мире. В действительности, во время недавней вспышки CCD в США зимой 2006-2007 г. приблизительно 25% или более из 2,4 миллиона ульев медоносных пчел были утрачены вследствие CCD. По оценке 23% пчеловодных хозяйств в Соединенных Штатах пострадали от CCD за зиму 2006-2007 г., который затронул в среднем 45% хозяйств пчеловодов. Зимой 2007-2008 г. инициативная группа по CCD сельскохозяйственной научно-исследовательской службы Министерства сельского хозяйства США (USDA-ARS) оценила, что всего 36% всех ульев из коммерческих хозяйств были уничтожены CCD.
[11]CCD характеризуется быстрым покиданием колонии популяцией взрослых пчел, при этом на некотором расстоянии от колонии обычно находят мертвых взрослых пчел. На конечной стадии разрушения о матке заботится лишь несколько вновь появившихся взрослых пчел. В разрушенных колониях часто находят значительное количество запечатанного расплода и запасов пищи. О явлении CCD впервые сообщили в 2006 г.; тем не менее, пчеловоды заметили единичные распады колоний, связанные с CCD, еще в 2004 г. В качестве причин были предположительно названы различные факторы, такие как клещи и инфекционные агенты, погодные условия, электромагнитное излучение (антенны сотовой связи), пестициды, недостаточное питание и стресс. На сегодняшний день контроль CCD сосредоточен на контроле клеща Varroa, санации и удалении пораженных ульев, лечении условно патогенных инфекций (таких как нозема (Nosema)) и улучшении питания. На сегодняшний день не разработано эффективных профилактических мер.
[12]Клещи Varroa паразитируют на куколках и взрослых пчелах и репродуцируются в ячейках с куколками. Клещи с помощью рта прокалывают экзоскелет и кормятся за счет гемолимфы пчелы. В таких ранах в экзоскелете скапливаются бактериальные инфекции, такие как Melissococcus pluton, который вызывает Европейский гнилец пчел. Вдобавок к паразитному действию предполагают, что клещи Varroa являются переносчиками множества патогенов медоносных пчел, включая вирус деформации крыла (DWV), кашмирский вирус пчел (KBV), вирус острого паралича пчел (ABPV) и вирус черного маточника (BQCV), и могут ослаблять иммунную систему хозяев, делая их восприимчивыми к инфекциям. Если заражение паразитами Varroa оставить без лечения, то это, как правило, приведет к смертности на уровне колоний.
[13]Современные способы лечения заражений паразитами Varroa оказываются неэффективными, так как у данных клещей развивается устойчивость к существующим майтицидам. Кроме того, применение таких майтицидов может привести к попаданию вредных химических веществ в мед, который предназначен для потребления человеком.
[14]КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[15]В настоящем изобретении предложены и включены в него композиции селективного инсектицида, содержащие направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, которая по существу комплементарна или по существу идентична участку последовательности гена кальмодулина или РНК, транскрибируемой с него. В некоторых аспектах указанная композиция дополнительно содержит вспомогательное вещество.
[16]В некоторых вариантах реализации предложена направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты, которая по существу комплементарна или по существу идентична участку последовательности гена кальмодулина Varroa, или РНК, транскрибируемой с него, и не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты удалены одна или более нуклеиновых кислот по сравнению с эталонной последовательностью гена кальмодулина Varroa, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, так что указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации указанная последовательность гена нецелевого организма является ортологом последовательности гена кальмодулина Varroa. В некоторых вариантах реализации указанная последовательность гена нецелевого организма является гомологом последовательности гена кальмодулина Varroa. В некоторых вариантах реализации указанная последовательность гена нецелевого организма неродственна последовательности гена кальмодулина Varroa. В одном аспекте из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты удален по меньшей мере один нуклеотид в указанном участке по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в указанном участке по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94.
[17]В одном аспекте молекула нуклеиновой кислоты в селективной инсектицидной композиции представляет собой двухцепочечную РНК (дцРНК). В некоторых аспектах дцРНК представляет собой малую интерферирующую (миРНК).
[18]В одном аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93. В другом аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94. В некоторых аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35 и 69-93. В некоторых аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35 и 69-93.
[19]В одном аспекте композиция селективного инсектицида дополнительно содержит одну или более направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных молекул нуклеиновой кислоты, которые по существу комплементарны или по существу идентичны первому участку последовательности гена кальмодулина. В некоторых аспектах указанная одна или более молекул нуклеиновой кислоты содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную второму участку последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в указанном первом участке и/или втором участке по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина по существу идентична или по существу комплементарна последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92.
[20]В одном аспекте композиция селективного инсектицида поглощается пчелой, абсорбируется пчелой, поглощается клещом или абсорбируется клещом.
[21]В одном аспекте вспомогательное вещество выбрано из группы, состоящей из белка, пыльцы, углевода, полимера, жидкого растворителя, сахарного сиропа, твердого сахара и полутвердого корма. В некоторых аспектах жидкий растворитель выбран из группы, состоящей из раствора сахарозы и раствора кукурузного сиропа. В некоторых аспектах белок выбран из группы, состоящей из пыльцы и соевого белка. В другом аспекте вспомогательное вещество представляет собой твердое вещество, выбранное из сахара, заменителя сахара или сахарной добавки. В некоторых аспектах твердый сахар включает микрочастицы сахара, пропитанные нуклеиновой кислотой - дцРНК.
[22]В одном аспекте настоящего изобретения предложены композиции для поглощения пчелами, содержащие пчелиный корм и молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина, или РНК, транскрибируемой с него. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты по существу комплементарна или по существу идентична участку последовательности гена кальмодулина Varroa, или РНК, транскрибируемой с него, и не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из указанной молекулы нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в указанном одном или более участках по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина Varroa. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина Varroa по существу комплементарна или по существу идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94. В некоторых аспектах пчелиный корм включает продукт питания пчелы, выбранный из группы, состоящей из кукурузного сиропа, заменителя пыльцы, пыльцы, лепешки из пыльцы и помадки. В некоторых аспектах пчелиный корм дополнительно содержит один или более из следующих компонентов: минеральную соль, эфирное масло, пивные дрожжи, дрожжевой экстракт, трегалозу, триптон, сухое молоко, лецитин и витамин C. Примеры эфирных масел включают, но не ограничены перечисленными: винтергреневое масло, масло кудрявой мяты, масло перечной мяты, масло лемонграсса и масло чайного дерева.
[23]В другом аспекте настоящего изобретения предложена конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична или комплементарна участку последовательности гена кальмодулина, или РНК, транскрибируемой с него, функционально связанную с последовательностью промотора, функционирующей в клетке-хозяине, и способную продуцировать дцРНК при ее внедрении в указанную клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота по существу комплементарна или по существу идентична участку целевой последовательности гена кальмодулина, или РНК, транскрибируемой с него, и не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной последовательности нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина по существу идентична или по существу комплементарна последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94. В некоторых аспектах указанная конструкция нуклеиновой кислоты дополнительно содержит по меньшей мере один регуляторный элемент, выбранный из группы, состоящей из лидерных последовательностей трансляции, интронов, энхансеров, структур типа «стебель-петля», связывающих репрессор последовательностей, терминирующих последовательностей, последовательностей паузы и последовательностей узнавания полиаденилирования. В некоторых аспектах клетка-хозяин представляет собой клетку бактерии или дрожжей.
[24]В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ предоставления композиции медоносной пчеле, включающий предоставление пчеле эффективного количества композиции, содержащей направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина, или РНК, транскрибируемой с него, в результате чего указанная нуклеиновая кислота присутствует в ткани медоносной пчелы. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота по существу комплементарна или по существу идентична участку целевой последовательности гена кальмодулина, или РНК, транскрибируемой с него, и не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации нецелевой организм представляет собой медоносную пчелу. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в указанном одном или более участках по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина по существу идентична или по существу комплементарна последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или предотвращения заболевания в колонии медоносных пчел, включающий предоставление эффективного количества композиции, содержащей направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина, медоносной пчеле, в результате чего указанная нуклеиновая кислота присутствует в ткани медоносной пчелы. В некоторых аспектах последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота по существу комплементарна или по существу идентична участку последовательности гена кальмодулина Varroa, или РНК, транскрибируемой с него, и не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в одном или более участках по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина по существу комплементарна или по существу идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина.
[25]В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ снижения паразитирования на пчеле клеща Varroa destructor, включающий предоставление пчеле эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты, в которой указанная нуклеиновая кислота по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина Varroa destructor, или РНК, транскрибируемой с него, тем самым снижая паразитирование на пчеле клеща Varroa destructor. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94.
[26]В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ снижения паразитарной нагрузки на улей медоносных пчел, включающий предоставление указанному улью эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина паразита, или РНК, транскрибируемой с него, в результате чего снижается паразитарная нагрузка на указанный улей. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в одном или более участках по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина паразита. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина паразита по существу комплементарна или по существу идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94.
[27]В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ селективного лечения вида членистоногих от паразитов, включающий доставку эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина паразита, или РНК, транскрибируемой с него, в вид членистоногих. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в одном или более участках по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина членистоногого. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина членистоногого по существу комплементарна или по существу идентична последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, по существу идентичную или по существу комплементарную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 и 94.
[28]В другом аспекте настоящего изобретения предложен и раскрыт способ лечения или предотвращения синдрома разрушения колоний медоносных пчел, включающий предоставление колонии медоносных пчел эффективного количества композиции, содержащей направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой по существу идентична или по существу комплементарна одному или более участкам последовательности гена кальмодулина Varroa destructor, в результате чего уровень заражения паразитами Varroa destructor снижается или заражение предотвращается. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида в одном или более участках по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность гена кальмодулина членистоногого по существу комплементарна или по существу идентична последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или ее фрагменту. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности гена кальмодулина.
[29]КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[30]На фиг. 1 представлено филогенетическое дерево генов кальмодулина (CAM) из различных видов. Число, находящееся непосредственно перед названием вида, соответствует идентификационному номеру последовательности (SEQ ID NO).
[31]На фиг. 2 представлен уровень выживаемости клещей, подвергнутых воздействию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3 (CAM373), в биоанализе кормления напрямую на 3 день после обработки по сравнению с не подвергнутым обработке контролем (CNTR) или обработкой неспецифической последовательностью (SCRAM, SEQ ID NO: 5).
[32]На фиг. 3, панель A, представлен анализ экспрессии генов на пятый день после лечения нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3 (CAM373), или нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 4 (CAM186), по сравнению с контролями. На панели B показан уровень выживаемости клещей, подвергнутых воздействию нуклеиновых кислот, включающих последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NOS: 3 (CAM373) или 4 (CAM186), по сравнению с контролями.
[33]На фиг. 4 представлена клещевая нагрузка/100 пчел из подвергнутых обработке ульев по сравнению с неподвергнутыми обработке контролями на протяжении различного периода времени.
[34]На фиг. 5 представлен % выживаемости клещей, подвергнутых воздействию нуклеиновых кислот, включающих последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 89, по сравнению с неподвергнутыми воздействию (NTC) в день 5 (Д%) или день 6 (Д6) после воздействия.
[35]На фиг. 6 представлен % выживаемости клещей, подвергнутых воздействию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3, или смеси нуклеиновых кислот, содержащей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 89, по сравнению с неподвергнутыми воздействию (NTC) в день 5 (5), день 6 (6) и день 7 (7).
[36]На фиг. 7 представлена нагрузка клеща Varroa/100 пчел из подвергнутых обработке ульев по сравнению с неподвергнутыми обработке контролями в течение периода времени 17 недель. Крайние слева столбики представляют ульи, подвергнутые обработке неспецифической последовательностью (SCRAM, SEQ ID NO: 5), средние столбики представляют ульи, оставленные необработанными, и крайние справа столбики представляют ульи, подвергнутые обработке нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3 (CAM 373).
[37]На фиг. 8 представлен % выживаемости клещей, подвергнутых обработке нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3, нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 90, или нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 92, по сравнению с неподвергнутыми обработке (NTC) в день 5 (Д5) или день 6 (Д6).
[38]На фиг. 9 представлен % выживаемости клещей, подвергнутых обработке нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 3, нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 91, или смесью нуклеиновых кислот, содержащей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 90 или SEQ ID NO: 92, по сравнению с неподвергнутыми обработке контролями (NTC) в день 4 (Д4).
[39]На фиг. 10 представлен анализ экспрессии гена кальмодулина, измеренной с помощью Quantigene™ (QG), для обработок с помощью SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 91 и смеси последовательностей SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 92 по сравнению с неподвергнутыми обработке контролями (NTC) в день 4.
[40]На фиг. 11 представлена нагрузка клеща Varroa/100 пчел из подвергнутых обработке ульев по сравнению с неподвергнутыми обработке контролями в течение периода времени 19 недель. Крайние слева столбики представляют неподвергнутые обработке ульи, средние столбики представляют ульи, подвергнутые обработке нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 94, и крайние справа столбики представляют ульи, подвергнутые обработке нуклеиновой кислотой, включающей последовательность, идентичную или комплементарную последовательности SEQ ID NO: 91.
[41]ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[42]Если не указано иначе, технические и научные термины в данном тексте имеют такие же значения, которые обычно подразумевает средний специалист в данной области. Специалисту в данной области известно множество способов, которые можно применять для осуществления настоящего изобретения. В действительности, настоящее описание никаким образом не ограничено описанными способами и материалами. Любые ссылочные материалы, цитируемые в данном тексте, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. Для целей настоящего описания ниже приведены определения следующих терминов.
[43]Должно быть очевидно, что любой идентификационный номер последовательности (SEQ ID NO), описанный в данном тексте, может относиться либо к последовательности ДНК, либо к последовательности РНК, в зависимости от контекста, в котором упомянут данный SEQ ID NO, даже если этот SEQ ID NO выражен только в формате последовательности ДНК или в формате последовательности РНК. Например, SEQ ID NO: 1 выражен в формате последовательности ДНК (например, содержит T для обозначения тимина), но он также может относиться либо к последовательности ДНК, которая соответствует зрелой последовательности нуклеиновой кислоты кальмодулина Varroa destructor, либо к последовательности РНК зрелой последовательности нуклеиновой кислоты молекулы кальмодулина Varroa destructor. Аналогично, хотя SEQ ID NO: 3 выражен в формате последовательности РНК (например, содержит U для обозначения урацила), в зависимости от фактического типа молекулы, которую описывают, SEQ ID NO: 3 может относиться либо к смысловой или антисмысловой цепи дцРНК, либо к последовательности молекулы ДНК, которая соответствует показанной последовательности РНК. В любом случае предусмотрены обе молекулы ДНК и РНК с описанными последовательностями, содержащие любые замены.
[44]В данной заявке термин ʺприблизительноʺ относится к ± 10%.
[45]В данном тексте ссылочные материалы в форме единственного числа включают указанные материалы в форме множественного числа, если в контексте явно не указано иное. Например, термин ʺ соединениеʺ или ʺпо меньшей мере одно соединениеʺ может включать множество соединений, включая их смеси.
[46]В данном тексте термин ʺпо существу идентичнаʺ или ʺпо существу комплементарнаʺ относится к нуклеиновой кислоте (или по меньшей мере к одной цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты или ее части, или к части одноцепочечной нуклеиновой кислоты), которая гибридизуется при физиологических условиях с эндогенным геном, с РНК, транскрибируемой с него, или с их фрагментом, чтобы повлиять на регуляцию или подавление (супрессию) эндогенного гена. Например, в некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты на 100 процентов идентична или по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов идентична при сравнении с участком из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или более смежных нуклеотидов в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты на 100 процентов комплементарна или по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов комплементарна при сравнении с участком из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 или более смежных нуклеотидов в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты на 100 процентов идентична или комплементарна одной аллели или одному представителю семейства данного целевого гена (кодирующей или некодирующей последовательности гена). В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов идентична или комплементарна множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты на 100 процентов идентична или комплементарна множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена.
[47]В некоторых аспектах нуклеиновая кислота по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или более смежным нуклеотидам эндогенного гена кальмодулина целевого вредителя, или РНК, транскрибируемой с него. В некоторых аспектах указанная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах из нуклеиновой кислоты удален по меньшей мере один нуклеотид по сравнению с целевой последовательностью гена кальмодулина, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93. В некотором аспекте из последовательности нуклеиновой кислоты удален по меньшей мере один нуклеотид по сравнению с эндогенной эталонной последовательностью гена кальмодулина целевого вредителя, или РНК, транскрибируемой с него, таким образом, что указанная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. Нуклеиновая кислота может представлять собой одноцепочечную ДНК, одноцепочечную РНК, двухцепочечную РНК, двухцепочечную ДНК или двухцепочечный гибрид ДНК/РНК. В некоторых аспектах целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина Varroa destructor. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевая последовательность гена кальмодулина представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из SEQ ID NO: 93. В некотором аспекте из указанной нуклеиновой кислоты удален по меньшей мере один нуклеотид по сравнению с эндогенной последовательностью гена кальмодулина целевого вредителя, или РНК, транскрибируемой с него. В некотором аспекте из нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять нуклеотидов по сравнению с эндогенной последовательностью гена кальмодулина целевого вредителя, или РНК, транскрибируемой с него. В некоторых аспектах по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять удаленных нуклеотидов являются смежными в целевых эндогенных последовательностях гена кальмодулина. В других аспектах по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять удаленных нуклеотидов не являются смежными в целевых эндогенных последовательностях гена кальмодулина. В одном аспекте целевая последовательность гена кальмодулина по существу комплементарна или по существу идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93. В одном аспекте указанная нуклеиновая кислота включает последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 90-92 и 94.
[48]В данном тексте термин ʺлечениеʺ включает прекращение, значительное ингибирование, замедление или обращение прогрессирования состояния, значительное облегчение клинических или эстетических симптомов состояния или значительное предотвращение возникновения клинических или эстетических симптомов состояния. В некотором аспекте настоящего изобретения композицию можно применять для лечения организма или колонии организмов от результатов паразитирования. В некотором аспекте композицию нуклеиновой кислоты можно применять для лечения организма-хозяина или колонии организмов-хозяев от паразитов. В некотором аспекте указанный организм-хозяин представляет собой пчелу и указанный паразит представляет собой клеща Varroa destructor.
[49]В данном тексте формулировка ʺзамалчивание РНКʺ относится к группе регуляторных механизмов (например, РНК-интерференции (РНКи), транскрипционному замалчиванию гена (TGS), посттранскрипционному замалчиванию гена (PTGS), подавлению, косупрессии и репрессии трансляции), опосредуемых молекулами РНК, которые приводят к ингибированию или ʺзамалчиваниюʺ экспрессии соответствующего кодирующего белок гена или последовательности РНК патогена пчелы. Замалчивание РНК наблюдают во многих типах организмов, включая растений, животных и грибов. В аспектах настоящего описания композиции нуклеиновых кислот приводят к замалчиванию РНК. В некоторых аспектах указанные композиции нуклеиновых кислот приводят к замалчиванию РНК и смертности паразита.
[50]В данном тексте термин ʺзамалчивающий РНК агентʺ относится к нуклеиновой кислоте, которая по существу гомологична или комплементарна полинуклеотидной последовательности целевого гена или РНК, экспрессируемой с указанного целевого гена, или их фрагменту, и способна ингибировать или ʺзамалчиватьʺ экспрессию целевого гена. Замалчивающие РНК агенты, как правило, описывают в отношении целевой последовательности, против которой направлен замалчивающий РНК агент. Целевая последовательность может включать, но не ограничена перечисленными последовательностями: область промотора, 5'-нетранслируемые области, кодирующие транскрипт области, которые могут содержать интронные области, 3'-нетранслируемые области или комбинации данных областей. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность может содержать кодирующую или некодирующую последовательность, или обе указанные последовательности. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность идентична или комплементарна информационной РНК, например, в вариантах реализации, в которых целевая последовательность представляет собой кДНК. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность представляет собой нативную последовательность гена кальмодулина, которая эндогенно экспрессируется в целевом вредителе. В некоторых вариантах реализации целевая последовательность представляет собой последовательность гена кальмодулина, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93, или часть указанной последовательности. В некоторых вариантах реализации эталонная последовательность гена кальмодулина содержит по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов, по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов, по меньшей мере 21 смежный нуклеотид, по меньшей мере 22 смежных нуклеотида или более из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, 26-35, 69-89 и 93.
[51]В некоторых аспектах замалчивающий РНК агент способен предотвращать полный процессинг (например, полную трансляцию и/или экспрессию) молекулы мРНК посредством механизма посттранскрипционного замалчивания. Замалчивающие РНК агенты могут представлять собой одно- или двухцепочечную РНК, или одно- или двухцепочечную ДНК, или двухцепочечные гибриды ДНК/РНК, или модифицированные аналоги перечисленных молекул. В некоторых аспектах замалчивающие РНК агенты выбраны из группы, состоящей из: (a) молекулы одноцепочечной РНК (оцРНК), (b) молекулы оцРНК, которая самогибридизуется с образованием молекулы двухцепочечной РНК, (c) молекулы двухцепочечной РНК (дцРНК), (d) молекулы одноцепочечной ДНК (оцДНК), (e) молекулы оцДНК, которая самогибридизуется с образованием молекулы двухцепочечной ДНК, и (f) молекулы одноцепочечной ДНК, содержащей модифицированный ген Pol III, которая транскрибируется с образованием молекулы РНК, (g) молекулы двухцепочечной ДНК (дцДНК), (h) молекулы двухцепочечной ДНК, содержащей модифицированный промотор Pol III, которая транскрибируется с образованием молекулы РНК, (i) двухцепочечной гибридизованной молекулы РНК/ДНК, или комбинации перечисленных молекул. В некоторых аспектах данные полинуклеотиды содержат химически модифицированные нуклеотиды или неканонические нуклеотиды. В некоторых аспектах замалчивающие РНК агенты представляют собой некодирующие молекулы РНК, например, дуплексы РНК, содержащие спаренные цепи, а также РНК-предшественники, из которых можно получить такие малые некодирующие РНК. В некоторых аспектах замалчивающие РНК агенты представляют собой дцРНК, такие как малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК и малые шпилечные РНК (мшРНК). В одном аспекте замалчивающий РНК агент способен вызывать РНК-интерференцию. В другом аспекте замалчивающий РНК агент способен опосредовать репрессию трансляции. В некотором аспекте замалчивающий РНК агент способен ингибировать экспрессию гена кальмодулина. В другом аспекте замалчивающий РНК агент можно применять в способах ингибирования экспрессии целевого гена и уничтожения посредством этого целевого организма. В некоторых аспектах целевой ген представляет собой ген кальмодулина и целевой организм представляет собой Varroa destructor.
[52]РНК-интерференция относится к процессу специфичного к последовательности посттранскрипционного замалчивания гена у животных, опосредованного малыми РНК. Соответствующий процесс у растений обычно называют посттранскрипционным замалчиванием гена или замалчиванием РНК, и его также называют подавлением у грибов. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, процесс посттранскрипционного замалчивания гена считают эволюционно-консервативным механизмом защиты клеток, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и он широко распространен в разнообразной флоре и таксонометрических типах. Такая защита от экспрессии чужеродных генов могла эволюционировать в ответ на продукцию двухцепочечных РНК (дцРНК), возникших в результате вирусной инфекции или в результате произвольного встраивания мобильных элементов - транспозонов - в геном хозяина, посредством клеточного ответа, который специфично уничтожает гомологичную одноцепочечную РНК или вирусную геномную РНК. В аспектах настоящего изобретения композиция нуклеиновой кислоты приводит к РНК-интерференции в целевом организме. В некоторых аспектах указанная композиция нуклеиновой кислоты приводит к РНК-интерференции в Varroa destructor, когда он присутствует в организме-хозяине - пчеле. В соответствии с аспектами настоящего изобретения селективный инсектицид может вызывать РНК-интерференцию в целевом организме и при этом не способен вызывать РНК-интерференцию в нецелевых организмах.
[53]В данном тексте термин ʺмалая РНКʺ относится к любой молекуле РНК, длина которой составляет по меньшей мере 15 пар оснований, обычно составляет 15-30 нуклеотидов, предпочтительно составляет 20-24 нуклеотида. В аспектах настоящего изобретения длина ʺмалой РНКʺ больше, чем 50 пар оснований. В некотором аспекте длина малой РНК больше, чем 50 пар оснований, но меньше, чем приблизительно 500 пар оснований. В некотором аспекте длина малой РНК больше, чем 100 пар оснований, но меньше, чем приблизительно 500 пар оснований. В некотором аспекте длина малой РНК больше, чем 200 пар оснований, но меньше, чем приблизительно 500 пар оснований. Малая РНК может быть либо двухцепочечной, либо одноцепочечной. Малая РНК включает, без ограничения, микроРНК, та-миРНК (трансактивирующую малую интерферирующую РНК), миРНК, активирующую РНК (РНКа), пас-миРНК (природную антисмыловую миРНК), гх-миРНК (гетерохроматическую миРНК), действующую в цис-положении миРНК, дмикроРНК (длинную микроРНК), дмиРНК (длинную миРНК) и эамиРНК (эпигенетически активируемую миРНК), и соответствующие предшественники перечисленных молекул. В некоторых вариантах реализации молекулы миРНК согласно настоящему описанию представляют собой молекулы микроРНК, молекулы та-миРНК и молекулы РНКа, и соответствующие предшественники перечисленных молекул. Малая РНК может подвергнуться процессингу in vivo в организме с образованием активной формы. В соответствии с аспектами настоящего изобретения селективный инсектицид может представлять собой малую РНК.
[54]В аспектах настоящего изобретения малая РНК непосредственно представлена в композиции. В других аспектах малая РНК продуцируется организмом in vivo либо из ДНК-предшественника, либо из РНК-предшественника. В некоторых аспектах малую РНК получают как продукт трансгена в организме, например, в дрожжевой или бактериальной клетке. В некоторых аспектах малую РНК, полученную как продукт трансгена, получают в виде предшественника, который подвергается процессингу in vivo после поглощения или абсорбции организмом. В других аспектах малую РНК, полученную как продукт трансгена, получают в виде предшественника, который подвергается процессингу in vivo после поглощения или абсорбции организмом.
[55]В некоторых аспектах замалчивающий РНК агент может представлять собой искусственную микроРНК. В данном тексте ʺискусственная микроРНКʺ (имикроРНК) представляет собой тип микроРНК, который получают путем замены нативных дуплексов микроРНК из природного предшественника микроРНК. Как правило, искусственная миРНК представляет собой не существующую в природе молекулу микроРНК, полученную из остова молекулы пре-микроРНК, сконструированного путем замены последовательности микроРНК существующей в природе молекулы пре-микроРНК на интересующую последовательность, которая соответствует последовательности искусственной микроРНК. В аспектах настоящего изобретения композиция нуклеиновой кислоты может представлять собой композицию имикроРНК.
[56]В различных исследованиях продемонстрировали, что длинные дцРНК можно применять для замалчивания экспрессии генов, не вызывая стрессовую реакцию или значительных побочных эффектов, см., например Strat и др., Nucleic Acids Research, 2006, том 34, № 13 3803-3810; Bhargava A и др. Brain Res. Protoc. 2004;13:115-125; Diallo M., и др., Oligonucleotides. 2003;13:381-392; Paddison P.J., и др., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99:1443-1448; Tran N., и др., FEBS Lett. 2004;573:127-134. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции с использованием длинных дцРНК.
[57]В данном тексте, в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, молекулы нуклеиновой кислоты или гена, термин ʺприродныйʺ или ʺнативныйʺ означает, что соответствующая последовательность или молекула присутствует в организме дикого типа, который не был генетически модифицирован или изменен человеком. Молекула малой РНК, по природе направленная на целевой ген, означает молекулу малой РНК, присутствующую в организме или клетке дикого типа, которые не были генетически модифицированы или изменены человеком, которая направлена на целевой ген, встречающийся в природе в соответствующем организме.
[58]В данном тексте термины ʺгомологияʺ и ʺидентичностьʺ, когда их используют по отношению к нуклеиновым кислотам, описывают степень подобия между двумя или более последовательностями нуклеотидов. Процент ʺидентичности последовательностейʺ между двумя последовательностями определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей по всему окну сравнения, таким образом, что часть указанной последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (разрывы) относительно эталонной последовательности (которая не содержит вставки или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Указанный процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых встречается идентичное основание нуклеиновой кислоты или идентичный аминокислотный остаток в обеих последовательностях, с получением количества совпадающих положений, деления указанного количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения полученного результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Последовательность, которая идентична в каждом положении по сравнению с эталонной последовательностью, называют идентичной эталонной последовательности, и наоборот. Выравнивание двух или более последовательностей можно осуществить, применяя любую подходящую компьютерную программу. Например, широко применяемая и утвержденная компьютерная программа для проведения выравниваний последовательностей представляет собой CLUSTALW версии 1.6 (Thompson, и др. Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994).
[59]В данном тексте термины ʺэкзогенный полинуклеотидʺ и ʺэкзогенная молекула нуклеиновой кислотыʺ по отношению к организмам относятся к гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, которая в природе не экспрессируется в данном организме. Экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты можно внедрить в организм стабильным или временным способом. Экзогенная молекула нуклеиновой кислоты может включать последовательность нуклеиновой кислоты, которая идентична или частично гомологична эндогенной последовательности нуклеиновой кислоты указанного организма или вредителя или патогена указанного организма. В некоторых аспектах ʺэкзогенный полинуклеотидʺ и ʺэкзогенная молекула нуклеиновой кислотыʺ может относиться к последовательности нуклеиновой кислоты паразита, экспрессируемой или присутствующей в хозяине, либо временно, либо стабильно. В настоящем изобретении предложены и включены в него композиции, содержащие экзогенные полинуклеотиды и экзогенные молекулы нуклеиновой кислоты, и способы их внедрения в целевой организм. В некоторых аспектах в настоящем изобретении предложены и включены в него композиции, содержащие экзогенные полинуклеотиды и экзогенные молекулы нуклеиновой кислоты и способы их внедрения в нецелевой организм, который представляет собой хозяина целевого организма.
[60]В данном тексте ʺконтрольный организмʺ означает организм, который не содержит рекомбинантную ДНК, малую РНК или другую нуклеиновую кислоту (например, белок, микроРНК, устойчивую к малой РНК целевую мРНК, дцРНК, целевой мимик), который является контролем вредителя или паразита. Контрольные организмы, как правило, относятся к тем же видам и находятся на той же стадии развития, а также выращиваются при таких же условиях роста, как и организм, который лечат. Аналогично ʺконтрольная колонияʺ означает колонии организмов, которые не содержат рекомбинантную ДНК, малую РНК или другую нуклеиновую кислоту (например, белок, микроРНК, устойчивую к малой РНК целевую мРНК, целевой мимик), которые являются контролем вредителя или паразита. Контрольные колонии организмов, как правило, относятся к тем же видам и находятся на той же стадии развития, а также выращиваются при таких же условиях роста, как и подвергнутая лечению колония организмов. В качестве лишь одного из примеров, контрольный организм может представлять собой пчелу, которая получила композицию, не содержащую нуклеиновую кислоту согласно настоящему описанию. В качестве другого лишь одного из примеров, контрольный организм может представлять собой пчелу, которая получила композицию, содержащую нуклеиновую кислоту, которая не способна замалчивать РНК ни в пчеле, ни в паразите, такую как SEQ ID NO: 5.
[61]В данном тексте термины ʺулучшениеʺ, ʺулучшенныйʺ, ʺповышениеʺ и ʺповышенныйʺ относятся к по меньшей мере приблизительно на 2%, по меньшей мере приблизительно на 3%, по меньшей мере приблизительно на 4%, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90% или большему увеличению популяции организмов или колонии, повышению производительности организма или колонии (например, повышенной продукции меда), увеличению скорости роста организма или колонии, или увеличению скорости репродукции по сравнению с контрольным организмом или колонией. В настоящем изобретении предложены способы улучшения здоровья организма или колонии путем предоставления им селективной инсектицидной композиции.
[62]В данном тексте ʺснижениеʺ уровня агента, такого как белок или мРНК, означает, что указанный уровень снижен по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, способной снижать уровень указанного агента. Также в данном тексте ʺснижениеʺ по отношению к паразитированию или паразитарной нагрузке означает, что указанный уровень снижен по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать жизнеспособность, плодовитость или количество паразитов. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для снижения уровня белка или мРНК и снижения уровня или количества паразитов.
[63]В данном тексте термин ʺпо меньшей мере частичное снижениеʺ уровня агента, такого как белок или мРНК, означает, что уровень снижен по меньшей мере на 25% по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать уровень агента. Также в данном тексте ʺпо меньшей мере частичное снижениеʺ по отношению к паразитированию или паразитарной нагрузке означает, что уровень снижен по меньшей мере на 25% по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать жизнеспособность, плодовитость или количество паразитов. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для по меньшей мере частичного снижения уровня белка или мРНК и по меньшей мере частичного снижения уровня или количества паразитов.
[64]В данном тексте ʺсущественное снижениеʺ уровня агента, такого как белок или мРНК, означает, что указанный уровень снижен по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать уровень агента, при этом снижение уровня указанного агента составляет по меньшей мере 75%. Также в данном тексте ʺсущественное снижениеʺ по отношению к паразитированию или паразитарной нагрузке означает, что уровень снижен по меньшей мере на 75% по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать жизнеспособность, плодовитость или количество паразитов. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для существенного снижения уровня белка или мРНК и существенного снижения уровня или количества паразитов.
[65]В данном тексте ʺэффективное элиминированиеʺ агента, такого как белок или мРНК, сравнивают с организмом или колонией, в которых нет молекулы дцРНК, способной снижать уровень агента, при этом снижение уровня указанного агента происходит более чем на 95%. Агент, такой как молекула дцРНК, предпочтительно способен приводить к по меньшей мере частичному снижению, более предпочтительно к существенному снижению или наиболее предпочтительно к эффективному элиминированию другого агента, такого как белок или мРНК, или паразит, при этом указанный агент оставляет уровень второго агента, или организма-хозяина, по существу неизменным, существено не измененным или частично не измененным. Также в данном тексте ʺэффективное элиминированиеʺ по отношению к паразитированию или паразитарной нагрузке означает, что уровень снижен по меньшей мере на 95% по сравнению с организмом или колонией, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать жизнеспособность, плодовитость или количество паразитов. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для эффективного элиминирования белка или мРНК и эффективного элиминирования паразитов.
[66]В данном тексте термины ʺподавлятьʺ, ʺрепрессироватьʺ и ʺснижатьʺ по отношению к экспрессии или активности молекулы нуклеиновой кислоты в организме используют эквивалентно, и они означают, что уровень экспрессии или активности молекулы нуклеиновой кислоты в клетке организма после осуществления способа согласно настоящему описанию ниже, чем ее экспрессия или активность в клетке организма до осуществления способа или по сравнению с контрольным организмом, в котором нет молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для подавления, репрессирования и снижения уровня белка или мРНК и подавления, репрессирования и снижения уровня или количества паразитов.
[67]Термины ʺподавленный,ʺ ʺрепрессированныйʺ и ʺс пониженной экспрессиейʺ в данном тексте синонимичны и означают более низкую, предпочтительно значительно более низкую экспрессию или активность целевой молекулы нуклеиновой кислоты. Также в данном тексте ʺподавленныйʺ, ʺрепрессированныйʺ и ʺсниженныйʺ по отношению к паразитированию или паразитарной нагрузке означает, что уровень паразитирования или паразитарной нагрузки более низкий, предпочтительно значительно более низкий по сравнению с таковым в организме или колонии, в которых нет нуклеиновой кислоты, такой как молекула дцРНК, способной снижать жизнеспособность, плодовитость или количество паразитов. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для подавления, репрессирования и снижения экспрессии или активности белка или мРНК и подавления, репрессирования и снижения активности паразитов.
[68]В данном тексте ʺподавлениеʺ, ʺрепрессияʺ или ʺснижениеʺ уровня или активности агента, такого как белок, мРНК или РНК, означает, что уровень или активность снижена по сравнению с по существу идентичной клеткой, организмом или колонией, которые растили при по существу идентичных условиях, в которых нет молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию, например, в которых нет участка, комплементарного дцРНК или миРНК, рекомбинантной конструкции или рекомбинантного вектора согласно настоящему описанию. В данном тексте ʺподавлениеʺ, ʺрепрессияʺ или ʺснижениеʺ уровня или активности агента, такого как, например, пре-РНК, мРНК, рРНК, тРНК, мякРНК, мяРНК, экспрессируемого с целевого гена, и/или белкового продукта, кодируемого им, означает, что указанное количество снижено на 10% или более, например, на 20% или более, предпочтительно на 30% или более, более предпочтительно на 50% или более, еще более предпочтительно на 70% или более, наиболее предпочтительно на 80% или более, например, на 90% по сравнению с таковым в клетке, организме или колонии, в которых нет рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для подавления, репрессии и снижения уровня агента, такого как белок, мРНК, РНК или паразит, по сравнению с неподвергнутым обработке организмом или колонией.
[69]В данном тексте термин ʺчленистоногоеʺ относится как к взрослой особи, так и к куколке беспозвоночных животных, имеющих экзоскелет (внешний скелет), фрагментированное тело и соединенные конечности. Членистоногие являются представителями типа Arthropoda и включают насекомых, паукообразных и ракообразных. Членистоногие согласно настоящему описанию включают, но не ограничены перечисленными: Apis mellifera, Apis cerana, Trigona minima, Halictidae, Bombus sp., блох, мух, вшей, зудней, клещей и полезных насекомых. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для лечения членистоногих либо в качестве хозяев, либо в качестве паразита или вредителя.
[70]В некотором аспекте членистоногое может представлять собой насекомое. В некоторых аспектах насекомое может представлять собой пчелу. В данном тексте термин ʺпчелаʺ относится как к взрослой пчеле, так и к ячейкам с куколкой пчелы. Согласно одному аспекту пчела находится в улье. Взрослую пчелу определяют как любое из имеющих несколько крыльев и мохнатое тело, обычно жалящих насекомых из надсемейства Apoidea в отряде Перепончатокрылые (Hymenoptera), включая как одиночные, так и социальные виды, и характеризуемых сосущим и жующим ротовым аппаратом для сбора нектара и пыльцы. Примеры видов пчел включают, но не ограничены перечисленными: Apis, Bombus, Trigona, Osmia и тому подобные виды. В одном аспекте пчелы включают, но не ограничены перечисленными: шмелей (Bombus terrestris), медоносных пчел (Apis mellifera) (включая пчел-сборщиц и домашних пчел) и Apis cerana. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для лечения пчел как хозяев паразитов, таких как клещи Varroa.
[71]Согласно одному аспекту пчела является частью колонии. Термин ʺколонияʺ относится к популяции пчел, содержащей от дюжин до обычно нескольких десятков тысяч пчел, которые сообща строят ульи, собирают пищу и вскармливают расплод. В колонии обычно есть одна матка, остальные пчелы являются либо ʺрабочими пчеламиʺ (самками), либо ʺтрутнямиʺ (самцами). Общественное устройство колонии поддерживается маткой и рабочими пчелами и зависит от эффективной системы коммуникации. Разделение труда внутри касты рабочих пчел, главным образом, зависит от возраста пчелы, но может изменяться в зависимости от потребности колонии. Размножение и численность колонии зависят от матки, количества запасов пищи и размера армии рабочих пчел. Медоносных пчел также можно подразделить на категории ʺдомашних пчелʺ, обычно, в течение первой части жизни рабочих пчел, во время которой ʺдомашняя пчелаʺ выполняет задачи внутри улья, и ʺпчел-сборщицʺ в течение последней части жизни пчел, во время которой ʺсборщицаʺ находит и собирает пыльцу и нектар за пределами улья и приносит нектар или пыльцу в улей для питания и хранения. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для лечения колоний насекомых.
[72]В данном тексте термин ʺвредительʺ относится как к взрослой, так и к незрелой форме организма, инвазивного или способного к размножению, вредоносного, доставляющего неприятности, токсичного, губительного, доставляющего беспокойство растениям или животным, или экосистемам. Паразит представляет собой тип вредителя. Организм может быть вредителем в одном случае, но быть полезным, одомашненным или приемлемым в другом случае.
[73]В данном тексте термин ʺпаразитʺ относится как к взрослой, так и к незрелой формам организмов, которые напрямую получают пользу за счет другого организма - хозяина, например, путем питания кровью или жидкостями хозяина, проживания внутри клетки организма-хозяина или проживания внутри тела организма-хозяина. Паразиты включают организмы, которые представляют собой животных, грибов, бактерий или растений, и их определяют по отрицательному или вредному взаимодействию с хозяином. В некоторых аспектах паразит, используемый в данном тексте, может, в свою очередь, служить в качестве хозяина для второго паразита. В некоторых аспектах паразит и хозяин могут принадлежать к одному и тому же типу организмов (например, членистоногий хозяин и членистоногий паразит). Паразиты включают, но не ограничены перечисленными: Acari (зудней, клещей), Hippoboscoidea (мух), Ichneumonoidea (паразитических ос), Oestridae (носоглоточных оводов), Phthiraptera (вшей), Siphonaptera (блох), Tantulocarida, краба-горошинку и Sacculina. В данном тексте вредитель может находиться как на паразитарной, так и на непаразитарной стадии жизни. В настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для лечения от паразитов. В некотором аспекте паразит может представлять собой Varroa destructor.
[74]В настоящем изобретении предложены и включены в него паразиты и/или вредители, включающие: Varroa destructor, Ixodes scapularis, Solenopsis invicta, Tetranychus urticae, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, Acyrthosiphon pisum и Pediculus humanus. В аспектах настоящего изобретения селективные инсектициды могут быть селективны по отношению к Varroa destructor, Ixodes scapularis, Solenopsis invicta, Tetranychus urticae, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, Acyrthosiphon pisum и Pediculus humanus и неактивны, или значительно менее активны, по отношению к нецелевому организму, такому как организм-хозяин.
[75]В данном тексте термин ʺвспомогательное веществоʺ относится к любому неактивному веществу в лекарственной форме, содержащей активный ингредиент, такой как направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота, включая, без ограничения, дцРНК, малую РНК, миРНК и антисмысловую РНК. В некоторых вариантах реализации вспомогательное вещество включает вещества, которые могут придать композиции дополнительные функциональные возможности, которые отличны от направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных нуклеиновых кислот. Функции вспомогательных веществ включают, но не ограничены перечисленными: ʺобъемообразующие агентыʺ, ʺнаполнителиʺ, ʺразбавителиʺ и ʺносителиʺ. Увеличение объема позволяет удобное и точное распределение композиций согласно настоящему описанию. Вспомогательные вещества также могут служить для того, чтобы способствовать поеданию композиций организмами, и включают различные углеводы, белки, жирные кислоты, пыльцу и заменители пыльцы. Вспомогательные вещества также могут служить для того, чтобы способствовать абсорбции композиций организмами, и включают, например, как водные, так и неводные растворы активных ингредиентов. Лишь некоторые из примеров вспомогательных веществ включают кукурузный сироп, сахарный сироп, твердый сахар, полутвердые сахара, пыльцу, соевый белок, смеси пыльцы и белка. Вспомогательные вещества могут дополнительно включать привлекающие вещества (аттрактанты), буферы и пищевые добавки. Композиции согласно настоящему описанию могут быть покрыты, инкапсулированы, растворены, смешаны или другим способом объединены со вспомогательным веществом. В данном тексте термин вспомогательное вещество может относиться к смеси неактивных веществ.
[76]В настоящей заявке предложены и раскрыты направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные молекулы нуклеиновой кислоты, которые по существу гомологичны или комплементарны полинуклеотидной последовательности целевого гена кальмодулина, или РНК, которая экспрессируется с целевого гена кальмодулина, или их фрагментам, и осуществляют подавление экспрессии целевого гена кальмодулина или приводят к образованию нокдаун-фенотипа. В некоторых аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты удалены одна или более нуклеиновых кислот по сравнению с целевым геном кальмодулина, так что указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность из 19 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. Указанные направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные молекулы нуклеиновой кислоты способны ингибировать или ʺзамалчиватьʺ экспрессию целевого гена кальмодулина у целевого вида. В некоторых вариантах реализации направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные молекулы нуклеиновой кислоты не влияют на экспрессию гена кальмодулина в нецелевом организме, тем не менее, способны ингибировать или ʺзамалчиватьʺ экспрессию целевого гена кальмодулина у целевого вида. Указанные направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные молекулы нуклеиновой кислоты, как правило, описаны в отношении их ʺцелевой последовательностиʺ. В некоторых вариантах реализации целевую последовательность выбирают из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 и 6-77. В некоторых вариантах реализации из направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных молекул нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре нуклеотида по сравнению с целевой последовательностью. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида являются смежными в целевой последовательности. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре удаленных нуклеотида не являются смежными в целевой последовательности. Указанные направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные молекулы нуклеиновой кислоты могут представлять собой одноцепочечную ДНК (оцДНК), одноцепочечную РНК (оцРНК), двухцепочечную РНК (дцРНК), двухцепочечную ДНК (дцДНК) или двухцепочечные гибриды ДНК/РНК. Указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут содержать встречающиеся в природе нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды, аналоги нуклеотидов или любую комбинацию перечисленных молекул. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты может быть включена в более длинный полинуклеотид, например, в молекулу прай-микроРНК. В некоторых вариантах реализации направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты можно подвергнуть процессингу с получением малой интерферирующей РНК (миРНК). В некоторых вариантах реализации предложены или раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, которые селективно действуют против паразитов или убивают клещей, и способы модуляции экспрессии или активности целевых для них генов для снижения количества или устранения паразитов из колонии или популяции. В некоторых вариантах реализации предложены или раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, которые селективно действуют против паразитов или убивают клещей, модулируя экспрессию или активность гена кальмодулина Varroa, чтобы уменьшить количество или устранить паразитов Varroa из колонии или популяции пчел, при этом не влияя на ген кальмодулина в нецелевых организмах.
[77]В аспектах настоящего изобретения направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеотидов, идентичную по меньшей мере на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-94. В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из оцДНК, оцРНК, дцРНК, дцДНК или гибридов ДНК/РНК. В некоторых вариантах реализации предложена дцРНК, включающая последовательность нуклеотидов, которая идентична по меньшей мере на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-94. В некоторых вариантах реализации предложена дцРНК, включающая последовательность нуклеотидов, которая идентична по меньшей мере на 100% последовательности или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-94. В другом аспекте предложена ДНК, кодирующая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, такую как оцРНК или дцРНК, включающая последовательность нуклеотидов или часть последовательности нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-94, или идентичную по меньшей мере на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательностям SEQ ID NO: 1-94 или частям указанных последовательностей. В другом дополнительном аспекте предложена рекомбинантная ДНК, кодирующая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, такую как оцРНК или дцРНК, которая содержит последовательность нуклеотидов, или часть последовательности нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-94, последовательность гетерологичного промотора и последовательность терминатора транскрипции. В другом аспекте настоящего изобретения предложена рекомбинантная ДНК, кодирующая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, такую как оцРНК или дцРНК, которая содержит последовательность нуклеотидов, идентичную по меньшей мере на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-94, и дополнительно содержит гетерологичный промотор и терминатор транскрипции.
[78]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89 или 93. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68.
[79]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 98 процентов идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 97 процентов идентична участку из целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 96 процентов идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 95 процентов идентична участку из целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 94 процента идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 93 процента идентична участку из целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 92 процента идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 91 процент идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 процентов идентична участку из указанного целевого гена, представленному выше. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89 или 93. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68.
[80]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена (в кодирующей или в некодирующей последовательности гена). В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 93.
[81]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 98 процентов идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 97 процентов идентична участку из целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 96 процентов идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 95 процентов идентична участку из целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 94 процента идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 93 процента идентична участку из целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 92 процента идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 91 процент идентична участку из целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 процентов идентична участку из указанного целевого гена, представленному выше. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 93.
[82]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, в одной аллели или в одном представителе семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 93.
[83]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, при этом наблюдается идентичность или комплементарность множеству аллелей или представителей семейства данного целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 98 процентов идентична участку целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 97 процентов идентична участку целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 96 процентов идентична участку целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 95 процентов идентична участку целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 94 процента идентична участку целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 93 процента идентична участку целевого гена. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 92 процента идентична участку целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 91 процент идентична участку целевого гена. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 процентов идентична участку целевого гена, представленному выше. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 93.
[84]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 100 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89 или 93. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6-68.
[85]В аспектах настоящего изобретения композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 10 до 17 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 18 до 25 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 20 до 30 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 25 до 35 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 30 до 40 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 40 до 50 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 50 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из от 45 до 60 или более смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из вплоть до 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 35 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте композиция содержит направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 99 процентов идентична участку, состоящему из по меньшей мере 60 смежных нуклеотидов, в целевом гене или в РНК, транскрибированной с целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 98 процентов идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 97 процентов идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 96 процентов идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 95 процентов идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 94 процента идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 93 процента идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некоторых аспектах последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 92 процента идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере на 91 процент идентична участку из целевого гена, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте последовательность направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно на 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 процентов идентична участку из указанного целевого гена, представленному выше, при этом указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность, которая на 100% идентична или комплементарна 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежным нуклеотидам в последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1-89 или 93. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89. В некотором аспекте целевой ген может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87.
[86]В некоторых вариантах реализации в направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоте по меньшей мере один нуклеотид удален по сравнению с целевой последовательностью гена. В одном аспекте направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более последовательных нуклеотидов, которые идентичны или комплементарны последовательности гена в нецелевом организме. В одном варианте реализации нецелевой организм представляет собой пчелу. В другом варианте реализации нецелевой организм представляет собой человека. В другом варианте реализации нецелевой организм представляет собой бабочку монарх. В некоторых вариантах реализации из направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты удалены по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать, по меньшей мере пятнадцать или более нуклеотидов по сравнению с целевой последовательностью. В некоторых вариантах реализации указанные по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть удаленных нуклеотидов являются смежными в эталонной последовательности гена кальмодулина. В других вариантах реализации указанные по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать, по меньшей мере тринадцать, по меньшей мере четырнадцать, по меньшей мере пятнадцать или более удаленных нуклеотидов не являются смежными в целевой последовательности. В некотором аспекте целевая последовательность может быть выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-89, 93 или их частей. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 1 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 2 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 3 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 4 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 69 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 70 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 88 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность SEQ ID NO: 89 или ее часть. В некотором аспекте целевая последовательность может представлять собой ген, включающий последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87 или их частей. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 процентов идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 или 94 или их частей. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает обратный комплемент последовательности, которая по меньшей мере приблизительно на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 процентов идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 или 94 или их частей. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-92 или 94. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 90-92 или 94 или их частей. В некоторых вариантах реализации направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота включает последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 90-92 и 94, и обратный комплемент последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 90-92 и 94.
[87]В настоящей заявке предложены и раскрыты композиции, содержащие направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную молекулу нуклеиновой кислоты и вспомогательное вещество. В некотором аспекте вспомогательное вещество может представлять собой комбинацию одного или более неактивных компонентов. В некоторых аспектах вспомогательное вещество включает сахар. Примеры сахаров включают гексозы, дисахариды, трисахариды и высшие сахара. Вспомогательные сахара включают, например, фруктозу, глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, галактозу, рибозу. В других аспектах вспомогательное вещество включает сахар и растворитель. В других аспектах вспомогательное вещество включает белок. В некотором аспекте белок представляет собой соевый белок. В других аспектах вспомогательное вещество может представлять собой пыльцу. В аспектах настоящего изобретения вспомогательное вещество может представлять собой продукт питания пчелы. В некоторых аспектах вспомогательное вещество включает триптон. В некоторых аспектах вспомогательное вещество включает дрожжевой экстракт. В некоторых аспектах вспомогательное вещество включает эфирное масло.
[88]Кормление пчел является обычной практикой среди пчеловодов как для обеспечения их питанием, так и для других, например, дополнительных нужд. Пчелы обычно питаются медом и пыльцой, но также известно, что кроме этого они употребляют неприродные корма. Пчел можно кормить различными продуктами питания, включая, но не ограничиваясь перечисленными: Wheast (молочные дрожжи, выращенные на домашнем сыре), соевую муку, дрожжи (например, пивные дрожжи, дрожжи торула) и дрожжевые продукты, которыми кормят отдельно или в комбинации, и соевую муку, которой кормят в виде сухой смеси или в виде влажной лепешки, находящейся внутри улья, или в виде сухой смеси в открытых кормушках за пределами улья. Также пригоден сахар или сахарный сироп. Добавление от 10 до 12 процентов пыльцы в кормовую добавку, которую дают пчелам, улучшает вкусовые качества. Добавление 25 процентов пыльцы улучшает качество и количество незаменимых питательных веществ, которые необходимы для жизнедеятельности пчел. Тростниковый или свекловичный сахар, изомеризованный кукурузный сироп и сахарный сироп ʺtype-50ʺ являются удовлетворительными заменителями меда в естественном питании медоносных пчел. Последние два можно давать пчелам только в виде жидкости. Жидкий корм можно давать пчелам внутри улья, например, с помощью любого из следующих устройств: бак с притертой крышкой, соты внутри гнездового корпуса улья, рамочная кормушка, кормушка Бордмана и т.д. Сухой сахар можно давать, поместив фунт или два фунта на перевернутую внутреннюю крышку. Запас воды должен быть доступен пчелам в любой момент времени. В одном аспекте предусмотрены поддоны или лотки, в которых присутствуют плавучие опоры, такие как древесные стружки, пробка или пластиковая губка. Подробное описание дополнительных кормов для пчел можно найти, например, в публикации USDA, Standifer, и др., 1977 г., названной ʺSupplemental Feeding of Honey Bee Coloniesʺ (USDA, Agriculture Information Bulletin № 413).
[89]В аспектах настоящего изобретения направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота, например, дцРНК, является абсорбируемой. В данном тексте ʺабсорбируемыйʺ относится к механизмам, с помощью которых осуществляется поглощение нуклеиновой кислоты путем, отличным от приема внутрь. В некотором аспекте направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота может абсорбироваться через кожу организма или через экзоскелет членистоногого. В некотором аспекте абсорбируемая нуклеиновая кислота растворена во вспомогательном веществе. В других аспектах абсорбируемая нуклеиновая кислота суспендирована во вспомогательном веществе. Вспомогательные вещества для растворения или суспенздирования могут быть водными или безводными. В некоторых аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота абсорбируется организмом-хозяином и переносится в организм паразита в процессе его питания. В других аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота абсорбируется организмом хозяина и переносится в организм паразита путем абсорбции. В некотором аспекте направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота согласно настоящему описанию абсорбируется непосредственно паразитом.
[90]В аспектах настоящего изобретения направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота, например, дцРНК, объединена со вспомогательным веществом. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может быть предложена в виде некоторого отношения нуклеиновой кислоты к вспомогательному веществу. В некотором аспекте отношение может представлять собой одну часть нуклеиновой кислоты к 4 частям вспомогательного вещества. В некотором аспекте отношение нуклеиновой кислоты к вспомогательному веществу может составлять 1:1, 1:2, 1:5 или 1:10. В других аспектах отношение нуклеиновой кислоты к вспомогательному веществу может составлять 1:20, 1: 25, 1:30, 1:40 или более. В некотором аспекте отношение нуклеиновой кислоты к вспомогательному веществу может составлять 1:50. В аспектах настоящего изобретения отношение может быть установлено как отношение объема к объему (об/об), отношение масса:масса (м/м). В некоторых аспектах отношение может быть выражено как отношение масса:объем (м/об). В некоторых аспектах нуклеиновая кислота и вспомогательное вещество могут представлять собой дцРНК и вспомогательное вещество.
[91]В аспектах настоящего изобретения композиция может содержать некоторую массу направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты, объединенную со вспомогательным веществом. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять некоторый процент от общей массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять приблизительно 0,1% от массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять приблизительно 0,2% от массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять приблизительно 0,3% от массы композиции. В другом аспекте нуклеиновая кислота может составлять приблизительно 0,4% от массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять до 0,5% от массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять до 0,6% от массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять до 0,7% от массы композиции. В некотором аспекте нуклеиновая кислота может составлять до 0,8% от массы композиции. В другом аспекте нуклеиновая кислота может составлять до 1,0% от массы композиции. В других аспектах нуклеиновая кислота может составлять до 1,5% от массы композиции. В других дополнительных аспектах нуклеиновая кислота может составлять до 2,0% от массы, или до 2,5% от массы композиции. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота и вспомогательное вещество могут представлять собой дцРНК и вспомогательное вещество.
[92]В настоящем изобретении предложены и включены в него композиции, содержащие от 0,1% до 5% по массе одной или более направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных нуклеиновых кислот. В других аспектах композиция может содержать от 0,1 до 4%, от 0,1 до 3%, от 0,1 до 2%, от 0,1 до 1%, от 0,1 до 2%, от 0,1 до 3% или от 0,1 до 4% по массе нуклеиновой кислоты. В некотором аспекте композиция может содержать от 0,2% до 5% по массе нуклеиновой кислоты. В других аспектах композиция может содержать от 0,2 до 4%, от 0,2 до 3%, от 0,2 до 2%, от 0,2 до 1%, от 0,2 до 2%, от 0,2 до 3% или то 0,2 до 4% по массе нуклеиновой кислоты. В других аспектах композиция может содержать до 1%, до 2%, до 3%, до 4% или до 5% нуклеиновой кислоты. В других аспектах композиция может содержать до 7,5%, до 10% или до 15% нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах нуклеиновая кислота и вспомогательное вещество могут представлять собой дцРНК и вспомогательное вещество.
[93]В настоящем изобретении предложены и включены в него композиции, содержащие от 0,1 до 10 мг/мл одной или более направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных нуклеиновых кислот. В других аспектах композиция может содержать от 0,1 до 1,0 мг/мл, от 0,1 до 2,0 мг/мл, от 0,1 до 2,5 мг/мл, от 0,1 до 5 мг/мл, от 0,1 до 10 мг/мл, от 0,1 до 15 мг/мл или от 0,1 до 20 мг/мл нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах композиция может содержать по меньшей мере 0,1 мкг/мл нуклеиновой кислоты. В некоторых других аспектах композиция может содержать по меньшей мере 1,0 мкг/мл нуклеиновой кислоты. В других дополнительных аспектах композиция может содержать по меньшей мере 10 мкг/мл нуклеиновой кислоты. В некотором аспекте композиция может содержать от 0,5 до 10 мг/мл нуклеиновой кислоты. В других аспектах композиция может содержать от 0,5 до 1,0 мг/мл, от 0,5 до 2,0 мг/мл, от 0,5 до 2,5 мг/мл, от 0,5 до 5 мг/мл, от 0,5 до 10 мг/мл, от 0,5 до 15 мг/мл или от 0,5 до 20 мг/мл нуклеиновой кислоты. В некотором аспекте композиция может содержать от 1,0 до 10 мг/мл нуклеиновой кислоты. В других аспектах композиция может содержать от 1,0 до 2,0 мг/мл, от 1,0 до 2,5 мг/мл, от 1,0 до 5 мг/мл, от 1,0 до 10 мг/мл, от 1,0 до 15 мг/мл или от 1,0 до 20 мг/мл нуклеиновой кислоты. В некоторых аспектах направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота в указанной композиции включает дцРНК.
[94]В настоящем изобретении предложены и включены в него композиции селективного инсектицида и способы применения композиций селективного инсектицида.
[95]В данном тексте ʺкомпозиция селективного инсектицидаʺ представляет собой композицию, которая более эффективна для одного или более видов членистоногих и менее эффективна для одного или более отличных видов членистоногих. Композиция селективного инсектицида включает композиции, которые убивают взрослых или незрелых членистоногих, и включает композиции, которые убивают личинок (ларвициды) и яйца (овициды) членистоногих. Селективный инсектицид может представлять собой системные инсектициды, входящие в состав обработанной пищи, включая кровь или гемолимфу, полученную из организмов-хозяев. Селективный инсектицид может представлять собой контактные инсектициды, которые токсичны для некоторых насекомых, с которыми они вступили в непосредственный контакт, и нетоксичны или минимально токсичны для некоторых других насекомых. В некоторых вариантах реализации композиция селективного инсектицида направлена против вредителей. В некоторых вариантах реализации композиция селективного инсектицида является противопаразитарной. В некоторых вариантах реализации композиция селективного инсектицида представляет собой майтицид. В некоторых вариантах реализации композиция селективного инсектицида является токсичной для целевого насекомого паразита или вредителя и нетоксичной или минимально токсичной для нецелевых организмов. Примеры нецелевых организмов включают, но не ограничены перечисленными: полезных насекомых, нематод, птиц, млекопитающих и растений. В некоторых вариантах реализации композиция селективного инсектицида токсична для паразитирующего насекомого, например, клеща Varroa, и нетоксична или минимально токсична для организма-хозяина, например, пчелы.В некоторых вариантах реализации композиция селективного инсектицида токсична для одного или более насекомых вредителей или паразитов, выбранных из группы, состоящей из: Varroa destructor, Ixodes scapularis, Solenopsis invicta, Tetranychus urticae, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, Acyrthosiphon pisum и Pediculus humanus.
[96]В некоторых аспектах настоящего изобретения селективный инсектицид можно внедрить в бактерии или дрожжи путем генетической модификации (например, трансгенные бактерии или дрожжи, сконструированные таким образом, чтобы они экспрессировали нуклеиновую кислоту согласно настоящему описанию). Селективный инсектицид, внедренный путем генетической модификации бактерий или дрожжей, может действовать на организм-вредитель непосредственно или опосредованно после того, как его поглощает хозяин организма вредителя.
[97]В некотором аспекте настоящего изобретения селективный инсектицид может быть более эффективным инсектицидом против одного или более первых насекомых, чем против одного или более вторых насекомых. В некотором аспекте селективный инсектицид может быть токсичным для первого насекомого и не оказывать влияния на второго насекомого. В некотором аспекте селективный инсектицид может быть токсичным для первого насекомого и требовать значительно более высоких концентраций или количеств, чтобы оказать влияние на второе насекомое. В некотором аспекте селективный инсектицид может быть в 2 раза или более токсичным для первого насекомого по сравнению со вторым насекомым. В некотором аспекте селективный инсектицид может быть в 4 раза или более токсичным для первого насекомого по сравнению со вторым насекомым. В некотором аспекте селективный инсектицид может быть в 5 раз или более токсичным для первого насекомого по сравнению со вторым насекомым. В некотором аспекте селективный инсектицид может быть в 10 раз или более токсичным для первого насекомого по сравнению со вторым насекомым.
[98]В некотором аспекте селективный инсектицид может ингибировать рост, развитие или плодовитость первого насекомого и не оказывать влияния на второе насекомое. В некотором аспекте селективный инсектицид может ингибировать рост, развитие или плодовитость первого насекомого и требовать значительно более высоких концентраций или количеств, чтобы оказывать аналогичное действие на второе насекомое. В некотором аспекте может потребоваться большее в 2 раза или более количество активного ингредиента в селективном инсектициде, чтобы ингибировать рост, развитие или плодовитость второго насекомого. В некотором аспекте может потребоваться большее в 4 раза или более количество активного ингредиента в селективном инсектициде, чтобы ингибировать рост, развитие или плодовитость второго насекомого. В некотором аспекте может потребоваться большее в 5 раз или более количество активного ингредиента в селективном инсектициде, чтобы ингибировать рост, развитие или плодовитость второго насекомого. В некотором аспекте может потребоваться большее в 10 раз или более количество активного ингредиента в селективном инсектициде, чтобы ингибировать рост, развитие или плодовитость второго насекомого.
[99]В некоторых вариантах реализации предложен способ изменения направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной молекулы нуклеиновой кислоты для уменьшения или устранения участков комплементарности или идентичности последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации последовательности потенциальных направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных нуклеиновых кислот сравнивают с подходящей базой данных геномов одного или более нецелевых организмов (лишь некоторые из примеров нецелевых организмов включают человека, пчелу, бабочку монарх, мышь, крысу и т.д.), применяя любое программное обеспечение для выравнивания последовательностей, такое как программное обеспечение BLAST, доступное на сервере NCBI (доступно на странице в сети Интернет по адресу www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В некоторых вариантах реализации предполагаемые направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные молекулы нуклеиновой кислоты, которые проявляют существенную гомологию с последовательностями генов одного или более нецелевых организмов, отсеивают. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеотидов предполагаемых направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат участки комплементарности или идентичности с последовательностью гена нецелевого организма, изменяют, чтобы уменьшить, устранить или прервать такие участки комплементарности или идентичности последовательностей. В некоторых вариантах реализации один или более нуклеотидов заменены, вставлены или удалены по сравнению с целевой последовательностью, чтобы прервать последовательности, содержащие 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более смежных нуклеотидов, которые идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некоторых вариантах реализации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов заменены, вставлены или удалены по сравнению с целевой последовательностью, так что указанная направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательность из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или более смежных нуклеотидов, которые идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма.
[100]В настоящее изобретение дополнительно включены и предложены способы лечения или предотвращения синдрома разрушения колоний медоносных пчел, включающие предоставление медоносной пчеле эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна участку последовательности гена кальмодулина Varroa destructor, в результате чего уровень заражения паразитами Varroa destructor снижается. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам в последовательности SEQ ID NO: 1 и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам в последовательности SEQ ID NO: 2 и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам в последовательности SEQ ID NO: 69 и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам в последовательности SEQ ID NO: 70 и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 3 и не содержащей последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 4 и не содержащей последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 88 и не содержащей последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 89 и не содержащей последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 90. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 91. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 92. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 93. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 94. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 90 и нуклеиновую кислоту, которая является обратным комплементом последовательности SEQ ID NO: 90. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 91 и нуклеиновую кислоту, которая является обратным комплементом последовательности SEQ ID NO: 91. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 92 и нуклеиновую кислоту, которая является обратным комплементом последовательности SEQ ID NO: 92. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 93 и нуклеиновую кислоту, которая является обратным комплементом последовательности SEQ ID NO: 93. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно SEQ ID NO: 94 и нуклеиновую кислоту, которая является обратным комплементом последовательности SEQ ID NO: 94. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей две или более нуклеиновых кислот с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 88, 89, 90-93. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 19 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 23 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 30 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 40 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 50 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 60 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 70 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 80 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 90 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 100 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 110 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 120 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 130 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна по меньшей мере 140 смежным нуклеотидам в последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87, и не содержит последовательность из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична или по существу комплементарна последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, сответствующую последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 71-87. В некотором аспекте указанный способ включает предоставление эффективного количества композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, сответствующую последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 90-94.
[101]В настоящем изобретении предложены и включены в него способы снижения паразитарной нагрузки на организм хозяина. В некотором аспекте паразитарная нагрузка относится к количеству паразитов на отдельного хозяина. В некотором аспекте паразитарная нагрузка относится к среднему количеству паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте паразитарная нагрузка может относиться к количеству паразитов на колонию паразитов хозяев. В аспектах настоящего изобретения указанный паразит представляет собой Varroa destructor и указанный хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera. В некоторых аспектах паразитарная нагрузка относится к количеству паразитов Varroa destructor на 100 медоносных пчел в колонии. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для снижения паразитарной нагрузки до менее чем 6 паразитов Varroa destructor на 100 медоносных пчел в колонии. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для снижения паразитарной нагрузки до менее чем 5 паразитов Varroa destructor на 100 медоносных пчел в колонии. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для снижения паразитарной нагрузки до менее чем 4 паразитов Varroa destructor на 100 медоносных пчел в колонии. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложены и включены в него способы и композиции для снижения паразитарной нагрузки до менее чем 2 паразитов Varroa destructor на 100 медоносных пчел в колонии.
[102]В некотором аспекте способы снижения паразитарной нагрузки включают предоставление эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты организму-хозяину. Эффективное количество композиции согласно настоящему описанию приводит к снижению паразитарной нагрузки за некоторый период времени. В некотором аспекте снижение паразитарной нагрузки можно измерить в течение одного дня с момента предоставления эффективного количества композиции нуклеиновой кислоты. В некотором аспекте паразитарную нагрузку можно измерить через два дня. В некотором аспекте паразитарную нагрузку можно измерить через 3 дня. В других аспектах паразитарную нагрузку можно измерить через 5 дней или через 1 неделю. В другом аспекте паразитарную нагрузку можно измерить более одного раза, например, раз в 3 дня, раз в 5 дней, раз в неделю или раз в месяц. В некоторых аспектах настоящего изобретения уменьшение количества паразитов можно измерить и сравнить с неподвергнутым обработке контрольным организмом или колонией. В аспектах настоящего изобретения указанный паразит представляет собой Varroa destructor и указанный хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera.
[103]В аспектах настоящего изобретения снижение паразитарной нагрузки через некоторый период времени означает уменьшение количества паразитов. В некотором аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 10%, 20%, 30% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 40% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 50% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 60% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 70% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 80% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 90% или более.
[104]В других аспектах паразитарную нагрузку можно измерить как среднее количество паразитов на организм-хозяин. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 20 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 15 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 10 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 5 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 4 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 3 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 2 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 1 паразита на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 20 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 15 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 10 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 5 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 4 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 3 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 2 паразитов на 1000 организмов-хозяев. В некотором аспекте сниженная паразитарная нагрузка может включать менее 1 паразита на 1000 организмов-хозяев.
[105]В аспектах настоящего изобретения у колонии организмов-хозяев была первоначальная паразитарная нагрузка перед тем, как ей предоставили источник эффективного количества нуклеиновой кислоты. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 20 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 15 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 10 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 5 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 4 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 3 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 2 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте первоначальная паразитарная нагрузка может включать менее 1 паразита на 100 организмов-хозяев.
[106]В аспектах настоящего изобретения эффективное количество можно предоставлять через определенные промежутки времени или непрерывно. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять один, два или три раза в день. В других аспектах эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в день. В другом аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять один или более раз в два дня. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в два дня, раз в три дня или раз в неделю. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в две недели. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в три недели. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в месяц. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в два месяца. В некотором аспекте эффективное количество композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять нуждающемуся организму постоянно, например, предоставляя постоянный источник питания. В одном аспекте эффективное количество композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять постоянно в виде композиции для поглощения пчелами. В аспектах настоящего изобретения указанный паразит представляет собой Varroa destructor и указанный хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera. В аспектах настоящего изобретения направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота может представлять собой дцРНК.
[107]В аспектах настоящего изобретения паразитарная нагрузка может снизиться за некоторый период времени. В некотором аспекте период времени, необходимый для снижения паразитарной нагрузки, может составлять 15 недель. В другом аспекте период времени для снижения паразитарной нагрузки может составлять 12 недель. В некотором аспекте снижение паразитарной нагрузки происходит за период времени, составляющий 10 недель. В некотором аспекте период времени, необходимый для снижения паразитарной нагрузки, может составлять 5 недель. В другом аспекте период времени для снижения паразитарной нагрузки может составлять 2 недели. В некотором аспекте снижение паразитарной нагрузки происходит за период времени, составляющий 1 неделю. В некоторых аспектах паразитарная нагрузка может снизиться через один день, через два дня или через три дня.
[108]В настоящем изобретении предложены способы снижения паразитирования на колонии медоносных пчел, включающие предоставление колонии пчел эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты. Эффективное количество композиции согласно настоящему описанию приводит к снижению паразитирования за некоторый период времени. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования можно измерить в течение одного дня с момента предоставления эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования можно измерить через два дня. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования можно измерить через 3 дня. В других аспектах снижение уровня паразитирования можно измерить через 5 дней или через 1 неделю. В другом аспекте снижение уровня паразитирования можно измерить более одного раза, например, раз в 3 дня, раз в 5 дней, раз в неделю или раз в месяц. В некоторых аспектах настоящего изобретения снижение уровня паразитирования можно измерить и сравнить с неподвергнутым обработке контрольным организмом или колонией.
[109]В аспектах настоящего изобретения снижение уровня паразитирования через некоторый период времени означает уменьшение общего количества паразитов. В некотором аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 10%, 20%, 30% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 40% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 50% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 60% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 70% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 80% или более. В другом аспекте количество паразитов может уменьшиться между измерениями на 90% или более.
[110]В других аспектах снижение уровня паразитирования можно измерить как среднее количество паразитов на организм-хозяин. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 20 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 15 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 10 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 5 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 4 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 3 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 2 паразитов на 100 организмов-хозяев. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования может включать менее 1 паразита на 100 организмов-хозяев.
[111]В аспектах настоящего изобретения эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты, которое приводит к снижению уровня паразитирования, можно предоставлять через определенные промежутки времени или непрерывно. В некотором аспекте эффективное количество композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять один, два или три раза в день. В других аспектах эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в день. В другом аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять один или более раз каждые два дня. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять раз в два дня, раз в три дня или раз в неделю. В некотором аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять нуждающемуся организму постоянно, например, предоставляя постоянный источник питания. В одном аспекте эффективное количество направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты можно предоставлять постоянно в виде композиции для поглощения пчелами. В аспектах настоящего изобретения указанный паразит представляет собой Varroa destructor и указанный хозяин представляет собой медоносную пчелу Apis mellifera. В аспектах настоящего изобретения направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота может представлять собой дцРНК.
[112]В аспектах настоящего изобретения снижение уровня паразитирования может уменьшаться за некоторый период времени. В некотором аспекте период времени, необходимый для снижения уровня паразитирования, может составлять 15 недель. В другом аспекте период времени, необходимый для снижения уровня паразитирования, может составлять 12 недель. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования происходит за период времени, составляющий 10 недель. В некотором аспекте период времени, необходимый для снижения уровня паразитирования, может составлять 5 недель. В другом аспекте период времени, необходимый для снижения уровня паразитирования, может составлять 2 недели. В некотором аспекте снижение уровня паразитирования происходит за период времени, составляющий 1 неделю. В некоторых аспектах снижение уровня паразитирования может происходить через один день, через два дня или через три дня.
[113]В аспектах настоящего изобретения снижение уровня паразитирования измеряют по количеству выживших паразитов по сравнению с первоначальным измерением количества паразитов в колонии организмов-хозяев. В некотором аспекте указанный паразит может представлять собой клеща Varroa destructor и указанный хозяин может представлять собой медоносную пчелу Apis mellifera. В некотором аспекте количество выживших паразитов может составлять 25% от первоначального количества паразитов. В некотором аспекте количество выживших паразитов может составлять 15% от первоначального количества паразитов. В некотором аспекте количество выживших паразитов может составлять 10% от первоначального количества паразитов. В некотором аспекте количество выживших паразитов может составлять 5% от первоначального количества паразитов. В некотором аспекте количество выживших паразитов может составлять менее 5% или даже быть недетектируемым после предоставления колонии хозяев эффективного количества направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной композиции нуклеиновой кислоты.
[114]В некотором аспекте в настоящем изобретении предложены способы и композиции для снижения восприимчивости пчел к заражению клещом Varroa. В других аспектах в настоящем изобретении предложены способы и композиции для предотвращения заражения паразитами колоний пчел. В другом аспекте настоящего изобретения предложены способы и композиции для снижения уровня паразитирования клеща Varroa destructor на медоносных пчелах.
[115]Согласно настоящему описанию хозяин, которому предоставили источник направленной против паразитов, против вредителей или инсектицидной нуклеиновой кислоты, может накапливать нуклеиновую кислоту в своем организме, обычно в гемолимфе. Накапливая нуклеиновую кислоту, такие организмы хозяева становятся устойчивыми или менее восприимчивыми к паразитированию. В других аспектах колония организмов-хозяев, которым предоставили источник нуклеиновой кислоты, может накапливать нуклеиновую кислоту в организмах нескольких представителей колонии, что обеспечивет устойчивость или сниженную восприимчивость к паразиту. Нуклеиновую кислоту, находящуюся в организмах-хозяевах, которым предоставили источник нуклеиновой кислоты, можно обнаружить, применяя способы, известные средним специалистам в данной области. В аспектах настоящего изобретения направленная против паразитов, против вредителей или инсектицидная нуклеиновая кислота может представлять собой дцРНК.
[116]В некотором аспекте настоящего изобретения предложены способы и композиции для лечения заражения пчел клещом Varroa путем снижения экспрессии кальмодулина и связанных с кальмодулином продуктов генов варриатозного клеща. В некотором аспекте указанные композиции содержат направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте указанные композиции содержат направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте указанные композиции содержат направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте указанные композиции содержат направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 70. В некоторых аспектах указанные композиции содержат направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87. В другом аспекте указанные композиции содержат направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4 и 88-93. В некотором аспекте указанные композиции содержат малую РНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте указанные композиции содержат малую РНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте указанные композиции содержат малую РНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте указанные композиции содержат малую РНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 70. В некоторых аспектах указанные композиции включают a малая РНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87. В другом аспекте указанные композиции содержат малую РНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 88 и 89. В другом аспекте указанные композиции содержат малую РНК соответствующую последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 90-93. В некотором аспекте указанные композиции содержат дцРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте указанные композиции содержат дцРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте указанные композиции содержат дцРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте указанные композиции содержат дцРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 70. В некоторых аспектах указанные композиции содержат дцРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87. В другом аспекте указанные композиции содержат дцРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 88 и 89. В другом аспекте указанные композиции содержат дцРНК, включающую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 90-93. В некотором аспекте указанные композиции содержат миРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 1. В некотором аспекте указанные композиции содержат миРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 2. В некотором аспекте указанные композиции содержат миРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 69. В некотором аспекте указанные композиции содержат миРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, представленной в SEQ ID NO: 70. В некоторых аспектах указанные композиции содержат миРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 71-87. В другом аспекте указанные композиции содержат миРНК, соответствующую последовательности кальмодулина Varroa destructor, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 88 и 89. В другом аспекте указанные композиции содержат миРНК соответствующую последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 90-93. В аспектах настоящего изобретения композиция может содержать направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую участку последовательности SEQ ID NO: 1 или 2. В других аспектах настоящего изобретения композиция может содержать направленную против паразитов, против вредителей или инсектицидную нуклеиновую кислоту, соответствующую участку последовательности SEQ ID NO: 69 или 70. В других дополнительных аспектах настоящего изобретения композиция может содержать нуклеиновую кислоту, соответствующую участку последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 3, 4, 88 и 89. В других дополнительных аспектах настоящего изобретения композиция может содержать нуклеиновую кислоту, соответствующую участку последовательности, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 90-94.
[117]Клещи Varroa паразитируют на куколках и взрослых пчелах и репродуцируются в ячейках с куколками. Клещи с помощью рта прокалывают экзоскелет и кормятся за счет гемолимфы пчелы. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полинуклеотидные агенты, которые вводили пчелам для лечения заражения клещом Varroa, присутствовали в гемолимфе пчелы, благодаря чему становились доступными для клеща.
[118]Авторы настоящего изобретения показали, что нацеленные на кальмодулин фрагменты дцРНК можно успешно передавать клещам Varroa (см., например, ФИГ. 2), что указанная дцРНК может служить для снижения экспрессии генов кальмодулина в клеще Varroa (см., например, ФИГ. 3, панель A) и дополнительно что нацеливание на гены кальмодулина для снижения экспрессии может привести к уменьшению количества клещей Varroa (см., например, ФИГ. 3, панель B).
[119]Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ предотвращения или лечения заражения пчелы клещом Varroa destructor, указанный способ включает введение пчеле эффективного количества агента нуклеиновой кислоты, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, которая снижает экспрессию гена кальмодулина клеща Varroa destructor, тем самым предотвращая или вылечивая заражение пчелы клещом Varroa destructor.
[120]Согласно данному аспекту настоящего изобретения агенты согласно настоящему описанию применяют для предотвращения проживания клеща Varroa destructor как паразита на пчеле, или его личинок. Формулировка ʺклещ Varroa destructorʺ относится к внешнему паразитирующему клещу, который нападает на медоносных пчел Apis cerana и Apis mellifera. Указанный клещ может находиться на стадии взрослой особи, кормящейся от пчелы, или на стадии личинки внутри ячейки с расплодом медоносной пчелы.
[121]Как уже было упомянуто, агенты согласно настоящему описанию способны селективно снижать экспрессию продукта гена клеща Varroa destructor. В данном тексте формулировка ʺпродукт генаʺ относится к молекуле РНК или к белку. Согласно одному аспекту продукт гена клеща Varroa destructor представляет собой такой продукт, который необходим для жизнеспособности клеща. Снижение экспрессии такого продукта гена, как правило, будет приводить к гибели клеща Varroa. Согласно другому аспекту продукт гена клеща Varroa destructor представляет собой такой продукт, который необходим для репродукции клеща. Снижение экспрессии такого продукта гена, как правило, будет приводить к предотвращению репродукции варриатозного клеща и к окончательному истреблению популяции клещей. Согласно еще одному аспекту продукт гена клеща Varroa destructor представляет собой такой продукт, который необходим для формирования патогенных симптомов у пчелы. В некоторых аспектах продукт гена Varroa destructor представляет собой продукт гена кальмодулина. В некоторых аспектах ген кальмодулина может включать последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых аспектах ген кальмодулина может включать последовательность нуклеиновой кислоты согласно SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 70.
[122]Примеры продуктов генов, экспрессию которых можно снижать в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения, включают, но не ограничены геном кальмодулина.
[123]В некотором аспекте настоящего изобретения агенты, способные снижать экспрессию продукта гена клеща Varroa destructor или другого паразита, могут снижать в меньшей степени экспрессию продукта гена у других животных, таких как пчела или другой нецелевой организм. Соответственно, некоторые агенты согласно настоящему изобретению способны различать ген клеща и ген пчелы и снижать экпрессию первого из упомянутых в большей степени, чем последнего. В некоторых аспектах некоторые агенты согласно настоящему изобретению способны различать целевой ген в целевом организме и ортологи в нецелевых организмах, снижая экпрессию первого из упомянутых в большей степени, чем последнего. В других аспектах экспрессия целевого гена указанного паразита снижена, тогда как экспрессия гомологичного гена хозяина - нет. В другом дополнительном аспекте у целевого гена паразита нет гомолога в указанном хозяине. Согласно другому аспекту агенты согласно настоящему изобретению вообще не снижают экпрессию гена пчелы. Например, это можно осуществить, нацеливаясь на ген, который избирательно экспрессируется у клеща, но не у пчелы, например, ген натриевого канала клеща - FJ216963. В качестве альтернативы агенты согласно настоящему изобретению могут быть нацелены на специфичные для клеща последовательности в генах, которые экспрессируются как у клеща, так и у пчелы.
[124]Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 5 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 6 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 7 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 8 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 9 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 10 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 11 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 12 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 13 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 14 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 15 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 16 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 17 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 18 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 19 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 20 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 21 основания, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 22 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 23 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 24 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 25 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 26 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 27 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 28 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 29 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Согласно одному аспекту агенты согласно настоящему изобретению нацелены на фрагменты генов Varroa, длина которых составляет по меньшей мере 100 оснований и которые не несут какую-либо последовательность длиннее 30 оснований, которая полностью гомологична любой последовательности из генома пчелы или последовательности из генома человека. Хотя должно быть очевидно, что мишенью может быть более чем один ген, чтобы максимизировать цитотоксическое действие на клещей Varroa, композиции, которые содержат одну или лишь несколько малых РНК повысят вероятность того, что данная композиция будет представлять собой композицию селективного инсектицида, так как способность вступать в перекрестные реакции с другими насекомыми может быть снижена.
[125]Согласно одному аспекту можно получить композицию дцРНК, соответствующую генам кальмодулина-1 и кальмодулина-2 Varroa destructor (например, применяя агенты нуклеиновые кислоты, последовательность которых представлена в последовательностях SEQ ID NO: 1-4 и с 69 по 89, комплементарные им последовательности или нуклеиновые кислоты, направленные на их участки).
[126]Должно быть очевидно, что наряду со снижением экпрессии некоторого количества генов, в настоящем изобретении дополнительно предложено и включено в него применение некоторого количества агентов для снижения экпрессии одного и того же гена (например, множества нуклеиновых кислот, или дцРНК, каждая из которых гибридизуется с отличным фрагментом одного и того же гена). Например, в некотором аспекте комбинацию одной или более нуклеиновых кислот, соответствующих последовательности, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, с 26 по 35 и с 69 по 89, можно применять для увеличения цитотоксического и противопаразитарного действия указанной композиции. для данной цели можно применять средства, которые способны идентифицировать видоспецифические последовательности: например, BLASTN и другие подобные компьютерные программы. В публикациях патентов США с номерами 20090118214 и 20120108497 предложено применение дцРНК для предотвращения и лечения вирусных инфекций у медоносных пчел. В публикациях патентов США с номерами 20120258646 предложено применение дцРНК для контролирования Varroa destructor у медоносной пчелы. Каждая публикация настоящим полностью включена в данную заявку.
[127]В настоящем изобретении предложены и включены в него композиции и способы снижения экспрессии гена в целевом организме. В некотором аспекте целевой организм может представлять собой паразита. В некоторых аспектах паразит может представлять собой Varroa destructor. В данном тексте термин ʺснижение экпрессииʺ относится к непосредственной или опосредованной индукции снижения уровня транскрипции желательного гена, уменьшению количества, стабильности или способности транслироваться продуктов транскрипции гена (например, РНК), и/или к снижению уровня трансляции полипептида(-ов), кодируемого(-ых) желательным геном. Снижение уровня экспрессии продукта гена клеща Varroa destructor можно отслеживать, например, путем непосредственного обнаружения транскриптов гена (например, с помощью ПЦР), путем обнаружения полипептида(-ов), кодируемого(-ых) РНК гена или патогена пчелы (например, с помощью вестерн-блоттинга или иммунопреципитации), путем обнаружения биологической активности полипептидов, кодируемых геном (например, каталитической активности, связывания лиганда и тому подобных активностей), или путем отслеживания изменений в клеще Varroa destructor (например, снижения пролиферации клеща, снижения вирулентности клеща, снижения подвижности клеща и т.д.) и путем анализа инфективности/патогенности для пчелы.
[128]Снижение уровня экспрессии продукта гена вредителя или паразита можно осуществить на уровне генома и/или транскрипта, применяя различные агенты, которые препятствуют транскрипции и/или трансляции (например, замалчивающие РНК агенты, рибозим, дезоксирибозим и антисмысловые молекулы нуклеиновой кислоты). Снижение уровня экспрессии продукта гена клеща Varroa destructor можно осуществить на уровне генома и/или транскрипта, применяя различные агенты, которые препятствуют транскрипции и/или трансляции (например, замалчивающие РНК агенты, рибозим, дезоксирибозим и антисмысловые молекулы нуклеиновой кислоты).
[129]Согласно одному аспекту агент, который снижает уровень экспрессии продукта гена вредителя или паразита, представляет собой малую РНК, такую как замалчивающий РНК агент. Согласно данному аспекту длина малой РНК больше, чем 15 пар оснований. В другом аспекте длина малой РНК больше, чем 50 пар оснований. В некотором аспекте длина малой РНК больше, чем 50 пар оснований, но меньше, чем приблизительно 500 пар оснований. В некотором аспекте длина малой РНК больше, чем 100 пар оснований, но меньше, чем приблизительно 500 пар оснований. В некотором аспекте длина малой РНК больше, чем 200 пар оснований, но меньше, чем приблизительно 500 пар оснований. В некотором аспекте указанный вредитель или паразит может представлять собой клеща Varroa destructor.
[130]Другой способ снижения уровня экпрессии продукта гена вредителя или паразита состоит во внедрении малых ингибиторных РНК (миРНК). Другой способ снижения уровня экпрессии продукта гена клеща Varroa состоит во внедрении малых ингибиторных РНК (миРНК).
[131]В одном аспекте настоящего изобретения, синтез замалчивающих РНК агентов, подходящих для применения в настоящем изобретении, можно осуществить, как описано далее. Во-первых, целевую мРНК вредителя или паразита сканируют по ходу транскрипции от инициирующего кодона AUG для выявления последовательности динуклеотида AA. Местонахождение каждого AA и 19 смежных с ним с 3'-стороны нуклеотидов регистрируют как потенциальные целевые сайты миРНК. Предпочтительно, целевые сайты миРНК выбирают из открытой рамки считывания, так как нетранслируемые области (НТО) более богаты сайтами связывания регуляторных белков. Белки, связывающиеся с НТО, и/или комплексы инициации трансляции могут препятствовать связыванию комплекса эндонуклеазы миРНК (Tuschl ChemBiochem. 2:239-245). Тем не менее, должно быть очевидно, что миРНК, направленные на нетранслируемые области, также могут быть эффективными, что продемонстрировали для GAPDH, где миРНК, направленная на 5'-НТО, опосредовала снижение приблизительно на 90% уровня мРНК клеточного GAPDH и полностью нарушала синтез белка (доступно в сети Интернет по адресу www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html).
[132]Во-вторых, потенциальные целевые сайты сравнивают с подходящей базой данных геномов нецелевых организмов (например, человека, пчелы, бабочки монарх, мыши, крысы и т.д.), применяя любое программное обеспечение для выравнивания последовательностей, такое как программное обеспечение BLAST, доступное на сервере NCBI (доступно в сети Интернет по адресу www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В некоторых вариантах реализации предполагаемые целевые сайты, для которых выявлена существенная гомология с другими кодирующими последовательностями, отсеивают. В некоторых вариантах реализации один или более нуклеотидов заменены или удалены по сравнению с целевой последовательностью, чтобы прервать последовательности, содержащие 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных нуклеотидов, которые на 100% идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма.
[133]Удовлетворяющие требованиям целевые последовательности выбирают для использования в качестве матрицы для синтеза миРНК. Предпочтительные последовательности представляют собой последовательности с низким содержанием G/C, так как было доказано, что такие последовательности более эффективно опосредуют замалчивание гена по сравнению с последовательностями, содержание G/C в которых выше, чем 55%. Предпочтительно для оценки выбирают несколько целевых сайтов по всей длине целевого гена или последовательности. Для лучшей оценки выбранных миРНК, предпочтительно вместе с ней используют отрицательный контроль. МиРНК отрицательного контроля предпочтительно имеют такой же нуклеотидный состав, как и миРНК, но у них нет существенной гомологии с геномом. Таким образом, предпочтительно применяют перемешанную последовательность нуклеотидов миРНК, при условии, что она не проявляет какой-либо существенной гомологии с любым другим геном или целевой последовательностью вредителя или паразита. Пример перемешанной последовательности нуклеотидов представлен в SEQ ID NO. 5.
[134]Например, миРНК, которую можно применять в данном аспекте настоящего изобретения, представляет собой такую миРНК, которая нацелена на специфический для клеща ген кальмодулина. Примеры миРНК представлены в последовательностях SEQ ID NO: 3,4, 88 и 89.
[135]Должно быть очевидно, что замалчивающий РНК агент согласно настоящему описанию не обязательно должен быть ограничен молекулами, содержащими только РНК, и может дополнительно содержать химически модифицированные нуклеотиды и не относящиеся к нуклеотидам молекулы.
[136]В некоторых аспектах замалчивающий РНК агент, предложенный в данной заявке, может быть функционально связан с проникающим в клетку пептидом. В данном тексте ʺпроникающий в клетку пептидʺ представляет собой пептид, который содержит короткую (состоящую приблизительно из 12 остатков) последовательность аминокислот или функциональный мотив, придающий ему способность к транслокации энергетически независимым путем (т.е., не путем эндоцитоза), относящуюся к транспорту проникающего через мембрану комплекса через плазматическую и/или ядерную мембраны клетки. Проникающий в клетку пептид, используемый в проникающем через мембрану комплексе согласно настоящему описанию, предпочтительно содержит по меньшей мере один нефункциональный остаток цистеина, который либо свободен, либо дериватизирован для образования дисульфидной связи с двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой, которую модифицируют для такой связи. Примеры мотивов аминокислот, придающих такие свойства, перечислены в патенте США номер 6348185, содержание которого явно включено в данную заявку посредством ссылки. Проникающие в клетку пептиды согласно настоящему описанию предпочтительно включают, но не ограничены перечисленными: пенетратин, транспортан, plsl, TAT(48-60), pVEC, MTS и MAP.
[137]Другой агент, способный снижать уровень экпрессии продукта гена вредителя или паразита, представляет собой молекулу дезоксирибозима, способную специфично расщеплять мРНК-транскрипт или последовательность ДНК полипептида патогена пчелы. Дезоксирибозимы представляют собой одноцепочечные полинуклеотиды, которые способны расщеплять как одноцепочечные, так и двухцепочечные целевые последовательности (Breaker, R.R. и Joyce, G. Chemistry и Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262). Была предложена обобщенная модель (модель ʺ10-23ʺ) дезоксирибозима. Дезоксирибозимы ʺ10-23ʺ содержат каталитический домен из 15 дезоксирибонуклеотидов, фланкированный двумя распознающими субстрат доменами, каждый из которых состоит из от семи до девяти дезоксирибонуклеотидов. Данный тип дезоксирибозима может эффективно расщеплять субстрат РНК в местах соединения пурин:пиримидин (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199; обзор дезоксирибозимов см. в Khachigian, LM, Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)). В некотором аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена клеща Varroa. Снижения уровня экспрессии продуктов генов вредителя или паразита также можно добиться, применяя антисмысловой полинуклеотид, способный специфично гибридизоваться с мРНК-транскриптом, кодирующим продукт гена вредителя или паразита. При разработке антисмысловых молекул, которые можно применять для эффективного снижения уровня экспрессии продукт гена вредителя или паразита, необходимо учитывать два аспекта, важных для антисмыслового подхода. Первый аспект представляет собой доставку олигонуклеотида в цитоплазму подходящих клеток, тогда как второй аспект представляет собой разработку олигонуклеотида, который специфично связывает указанную целевую последовательность мРНК или РНК внутри клетки таким образом, что ингибирует ее трансляцию. В некотором аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена клеща Varroa. В другом аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена кальмодулина.
[138]Можно применять множество стратегий доставки для эффективной доставки олигонуклеотидов в большое разнообразие типов клеток (см., например, Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998); Kronenwett и др. Blood 91: 852-62 (1998); Rajur и др. Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997); Lavigne и др. Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997) и Aoki и др. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)).
[139]Кроме того, также доступны алгоритмы идентификации последовательностей с наиболее высокой предсказанной аффинностью связывания с целевой мРНК на основании термодинамического цикла, который учитывает энергетику структурных изменений как в целевой мРНК, так и в олигонуклеотиде (см., например, Walton и др. Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)). Такие алгоритмы успешно применялись для реализации антисмыслового подхода в клетках. Например, алгоритм, разработанный Walton и др., позволил ученым успешно разработать антисмысловые олигонуклеотиды для транскриптов бета-глобина кролика (RBG) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа) мыши. Та же группа исследователей позже сообщила, что антисмысловая активность рационально выбранных олигонуклеотидов против трех модельных целевых мРНК (лактатдегидрогеназы A и B человека и gp1 крысы) в культуре клеток, которую оценивали с помощью методики кинетической ПЦР, оказалась эффективной почти во всех случаях, включая анализы против трех различных мишеней в двух типах клеток с фосфодиэфирными и фосфоротиоатными взаимодействиями олигонуклеотидов. Кроме того, также было опубликовано несколько подходов к разработке и прогнозированию эффективности специфических олигонуклеотидов с применением системы in vitro (Matveeva и др., Nature Biotechnology 16: 1374-1375 (1998)].
[140]Другой агент, способный снижать уровень экпрессии продукта гена вредителя или паразита, представляет собой молекулу рибозима, способную специфично расщеплять мРНК-транскрипт, кодирующий продукт гена клеща Varroa. Рибозимы все чаще применяют для специфического к последовательности ингибирования экспрессии генов путем расщепления мРНК, кодирующей интересующие белки (Welch и др., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)). Возможность разработки рибозимов для расщепления любой специфической целевой РНК, включая вирусную РНК, сделала их полезными средствами как в фундаментальных исследованиях, так и для применения в терапии. В некотором аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена клеща Varroa. В другом аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена кальмодулина.
[141]Дополнительный способ снижения уровня экспрессии продукта гена вредителя или паразита в клетках состоит в использовании образующих триплекс олигонуклеотидов (TFO). Недавние исследования показали, что можно разработать TFO, которые могут распознавать и связываться с участками полипурина/полипиримидина в двухцепочечной спиральной ДНК специфическим к последовательности образом. Такие правила распознавания в общих чертах описаны в Maher III, L. J., и др., Science (1989) 245:725-7; Moser, H. E., и др., Science, (1987) 238:645-6; Beal, P. A., и др., Science (1992) 251:1360-1363; Cooney, M., и др., Science (1988) 241:456-459; и Hogan, M. E., и др., публикация EP 375408. Модификация олигонуклеотидов, такая как внедрение интеркаляторов и замен в остове, и оптимизация условий связывания (pH и концентрация катионов) помогла преодолеть внутренние ограничения, препятствующие активности TFO, такие как отталкивание зарядов и нестабильность, и недавно было показано, что синтетические олигонуклеотиды могут быть нацелены на специфические последовательности (недавний обзор см. в Seidman и Glazer, J Clin Invest 2003;112:487-94). В некотором аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена клеща Varroa. В другом аспекте продукт гена вредителя или паразита может представлять собой продукт гена кальмодулина.
[142]Как правило, у образующего триплекс олигонуклеотида наблюдают соответствие последовательностей:
[143]| олиго | 3'--A | G | G | T |
| дуплекс | 5'--A | G | C | T |
| дуплекс | 3'--T | C | G | A |
[144]Тем не менее, было показано, что у триплетов A-AT и G-GC наиболее стабильная тройная спираль (Reither и Jeltsch, BMC Biochem, 12 сентября 2002 г., Epub). Те же авторы продемонстрировали, что TFO, разработанные согласно правилу A-AT и G-GC, не образуют неспецифических триплексов, свидетельствуя о том, что образование триплекса в действительности специфично для последовательности.
[145]Длина образующих триплекс олигонуклеотидов предпочтительно составляет по меньшей мере 15, более предпочтительно 25, еще более предпочтительно или более нуклеотидов, до 50 или 100 п.о.
[146]Трансфекция клеток TFO (например, посредством катионных липосом) и образование структуры тройной спирали с целевой ДНК приводит к стерическим и функциональным изменениям, блокированию инициации и элонгации транскрипции, что позволяет вносить желательные изменения в последовательность эндогенной ДНК и приводит к специфическому снижению уровня экспрессии генов.
[147]Подробное описание разработки, синтеза и внедрения эффективных TFO можно найти в публикациях патентов США с номерами 2003/017068 и 2003/0096980, Froehler и др., и 2002/0128218 и 2002/0123476, Emanuele и др., и патенте США номер 5721138, Lawn.
[148]Агенты, снижающие экпрессию полинуклеотида, согласно настоящему описанию можно получить с помощью любого способа синтеза полинуклеотидов, известного в данной области, такого как ферментативный синтез или твердофазный синтез. Оборудование и реагенты для осуществления твердофазного синтеза доступны для приобретения, например, у Applied Biosystems. Также можно применять любые другие средства для такого синтеза; эффективный синтез полинуклеотидов находится в рамках компетенции специалиста в данной области, и его можно осуществить с помощью общепринятых методик, подробно описанных, например, в ʺMolecular Cloning: A laboratory Manualʺ Sambrook и др., (1989); ʺCurrent Protocols in Molecular Biologyʺ тома I-III Ausubel, R. M., ред. (1994); Ausubel и др., ʺCurrent Protocols in Molecular Biologyʺ, John Wiley and Sons, Балтимор, Мэриленд (1989); Perbal, ʺA Practical Guide to Molecular Cloningʺ, John Wiley & Sons, Нью-Йорк (1988) и ʺOligonucleotide Synthesisʺ Gait, M. J., ред. (1984), используя химические реакции с твердофазными материалами, например, цианоэтилфосфорамидитом, с последующим снятием защитных групп, обессоливанием и очисткой, например, с помощью автоматизированного способа без снятия тритила (trityl-on) или ВЭЖХ.
[149]Полинуклеотидные агенты согласно настоящему изобретению могут содержать гетероциклические нуклеозиды, состоящие из оснований пуринов и пиримидинов, связанных 3' с 5' фосфодиэфирной связью. Предпочтительно применяемые полинуклеотидные агенты представляют собой агенты, с модификациями либо в остове, либо в межнуклеозидных связях, либо в основаниях, что в общих чертах описано ниже в данном тексте.
[150]Конкретные примеры полинуклеотидных агентов, полезных согласно данному аспекту настоящего изобретения, включают полинуклеотидные агенты, содержащие модифицированные остовы или неприродные межнуклеозидные связи. Полинуклеотидные агенты, содержащие модифицированные остовы, включают агенты, в остове которых сохранен атом фосфора, описанные в патентах США с номерами: 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050.
[151]Модифицированные остовы полинуклеотидов включают, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метилфосфонаты и фосфонаты другого алкила, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3' аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, содержащие нормальные связи 3'-5', их аналоги со связями 2'-5', а также указанные молекулы с обратной ориентацией, в которых смежные пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Также можно применять формы различных солей, смешанных солей и свободных кислот.
[152]В качестве альтернативы, модифицированные остовы полинуклеотидов, которые не содержат атом фосфора, представляют собой такие остовы, которые образованы алкильными с короткой цепью или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или более гетероатомными с короткой цепью или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Такие остовы включают остовы, содержащие морфолиновые связи (образованные частично сахаром нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие остовы, содержащие смешанные компоненты N, 0, S и СН2, описанные в патентах США с номерами 5034506; 5166315; 5185444; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5214134; 5466677; 5610289; 5633360; 5677437 и 5677439.
[153]Другие полинуклеотидные агенты, которые можно применять согласно настоящему описанию, представляют собой агенты, в которых модифицированы как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е. остов, нуклеотидных единиц, которые заменены новыми группами. Основания сохраняют для гибридизации с подходящим целевым полинуклеотидом. Пример такого полинуклеотидного миметика включает пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК). Полинуклеотид ПНК относится к полинуклеотиду, в котором сахарный остов заменен амидсодержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Основания сохранены и связаны непосредственно или опосредованно с азотными атомами азагрупп амидной части остова. Патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение ПНК-соединений, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Другие модификации остова, которые можно использовать в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США № 6303374.
[154]Полинуклеотидные агенты согласно настоящему изобретению также могут содержать модификации или замены оснований. В данном тексте ʺнемодифицированныеʺ или ʺприродныеʺ основания включают пуриновые основания - аденин (A) и гуанин (G), и пиримидиновые основания - тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные основания включают, но не ограничены другими синтетическими и природными основаниями, такими как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоген-урацил и -цитозин, 5-пропинил-урацил и -цитозин, 6-азо-урацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, особенно 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3- деазааденин. Дополнительные основания включают основания, раскрытые в патенте США № 3687808, основания, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, страницы 858-859, Kroschwitz, J. I., ред. John Wiley & Sons, 1990, основания, раскрытые в Englisch и др., Angewandte Chemie, международное издание, 1991, 613, и основания, раскрытые в Sanghvi, Y. S., Глава 15, Antisense Research and Applications, страницы 289-2, Crooke, S. T. и Lebleu, B., ред., CRC Press, 1993. Такие основания особенно полезны для повышения аффинности связывания олигомерных соединений согласно настоящему описанию. Они включают содержащие заместители в положении 5 пиримидины, 6-азапиримидины и содержащие заместители в положениях N-2, N-6 и 0-6 пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замены на 5-метилцитозин повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°C (Sanghvi YS и др. (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными заменами оснований, особенно когда их комбинируют с модификациями сахара 2'-O-метоксиэтилом.
[155]После синтеза полинуклеотидные агенты согласно настоящему изобретению необязательно можно очистить. Например, полинуклеотиды можно очистить из смеси путем экстрагирования растворителем или смолой, преципитации, электрофореза, хроматографии или комбинации перечисленных способов очистки. В качестве альтернативы полинуклеотиды можно применять без очистки или с минимальной очисткой, чтобы избежать потерь при обработке образца. Полинуклеотиды можно сушить для хранения или растворять в водном растворе. Раствор может содержать буферы или соли, способствующие отжигу и/или стабилизирующие цепи дуплекса.
[156]Должно быть очевидно, что полинуклеотидный агент согласно настоящему описанию может быть предложен сам по себе или в виде конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полинуклеотидный агент. Как правило, конструкция нуклеиновой кислоты содержит последовательность промотора, который функционален в клетке хозяина, что подробно описано ниже в данном тексте.
[157]Полинуклеотидные последовательности согласно настоящему описанию, под контролем функционально связанной с ними последовательности промотора, дополнительно могут быть фланкированы дополнительными последовательностями, которые положительно влияют на транскрипцию и/или стабильность полученного транскрипта. Такие последовательности, как правило, расположены против хода транскрипции от промотора и/или по ходу транскрипции от 3'-конца экспрессирующей конструкции.
[158]Термин ʺфункционально связанныйʺ, используемый по отношению к регуляторной последовательности и структурной последовательности нуклеотидов, означает, что регуляторная последовательность вызывает регулируемую экспрессию связанной с ней структурной последовательности нуклеотидов. ʺРегуляторные последовательностиʺ или ʺконтролирующие элементыʺ относятся к последовательности нуклеотидов, расположенной против хода транскрипции, внутри или по ходу транскрипции от структурной последовательности нуклеотидов, и влияющей на распределение по времени и уровень или величину транскрипции, процессинга РНК или стабильности, или трансляции ассоциированной с ней структурной последовательности нуклеотидов. Регуляторные последовательности могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, энхансеры, структуры типа «стебель-петля», связывающие репрессор последовательности, терминирующие последовательности, последовательности паузы, последовательности узнавания полиаденилирования и тому подобные последовательности.
[159]Должно быть очевидно, что агенты нуклеиновой кислоты можно доставлять вредителю или паразиту большим разнообразием способов. Согласно одному аспекту указанные агенты нуклеиновой кислоты доставляют непосредственно вредителю или паразиту (например, путем опрыскивания зараженного клещами улья). Агенты нуклеиновой кислоты или конструкции, кодирующие их, могут проникать в организмы клещей путем диффузии. В данном аспекте промотор конструкции нуклеиновой кислоты обычно функционален в клетках клеща. В некотором аспекте вредитель или паразит может представлять собой Varroa destructor.
[160]Должно быть очевидно, что поскольку многие паразиты с помощью своих ртов прокалывают экзоскелет членистоногого хозяина и кормятся за счет гемолимфы членистоногого, в настоящем описании предложена доставка полинуклеотидных агентов согласно настоящему описанию членистоногому, в результате чего они присутствуют в гемолимфе членистоногого, становясь доступными для вредителя или паразита. Таким образом, согласно другому аспекту агенты нуклеиновой кислоты доставляют опосредованно вредителю или паразиту (например, клещу через пчелу-хозяина). В данном аспекте промотор конструкции нуклеиновой кислоты обычно функционален в клетках хозяина. В некоторых аспектах вредитель или паразит может представлять собой Varroa destructor и хозяин-членистоногое может представлять собой пчелу.
[161]Согласно одному аспекту агенты нуклеиновой кислоты доставляют зараженным паразитами хозяевам путем распыления. Указанные агенты нуклеиновой кислоты или конструкции, кодирующие их, могут проникать в организмы хозяев путем диффузии. В некоторых аспектах вредитель или паразит может представлять собой Varroa destructor и хозяин-членистоногое может представлять собой пчелу.
[162]Согласно другому аспекту агенты нуклеиновой кислоты доставляют хозяину через пищу. Авторы настоящего изобретения считают, что после употребления в пищу агентов нуклеиновой кислоты согласно настоящему описанию, указанные агенты могут присутствовать, например, в гемолимфе указанного хозяина членистоногого, в результате чего они становятся доступными для паразита, например, клеща Varroa.
[163]Таким образом, полинуклеотиды согласно настоящему описанию можно синтезировать in vitro или in vivo, например, в бактериальной или дрожжевой клетке, и добавлять в пищу. Например, двухцепочечную РНК можно синтезировать путем добавления двух противоположно направленных промоторов (например, промоторов T7) к концам фрагментов гена, при этом указанный промотор располагают непосредственно с 5'-стороны от гена и указанный промотор располагают непосредственно с 3'-стороны от фрагмента гена в противоположной ориентации. Затем можно получить дцРНК путем транскрипции in vitro с помощью T7 РНК-полимеразы.
[164]Примеры последовательностей для синтеза нуклеиновых кислот, включая дцРНК, в соответствии с аспектами настоящего описания представлены в SEQ ID NO: 1-4, 6, 23, с 26 по 35 и с 69 по 93.
[165]Должно быть очевидно, что некоторые вредители или паразиты создают раневые поверхности в экзоскелете членистоногого хозяина. В таких раневых поверхностях накапливаются бактериальные инфекции. Например, в раневой поверхности пчелы-хозяина могут накапливаться такие бактерии, как Melissococcus pluton, который вызывает Европейский гнилец пчел. Известно, что помимо паразитного действия паразиты действуют как переносчики для множества других патогенов и паразитов. Например, предполагают, что клещи Varroa действуют как переносчики для множества патогенов медоносных пчел, включая вирус деформации крыла (DWV), Кашмирский вирус пчел (KBV), вирус острого паралича пчел (ABPV) и вирус черного маточника (BQCV), и могут ослаблять иммунную систему хозяев, делая их восприимчивыми к инфекциям.
[166]Таким образом, убивая вредителя или паразита (или предотвращая его репродукцию), направленные против паразитов, против вредителей или инсектицидные агенты согласно настоящему изобретению можно применять для предотвращения и/или лечения бактериального инфицирования организмов-хозяев, например, инфицирования Melissococcus pluton и вирусных инфекций у хозяев-пчел, вызванных перечисленными выше вирусами. Поскольку считают, что заражение клещом Varroa и вирусные инфекции ответственны за синдром разрушения колоний (CCD), агенты согласно настоящему изобретению также можно применять для предотвращения или уменьшения восприимчивости колонии пчел к CCD.
[167]Должно быть очевидно, что дополнительно к кормлению направленными против паразитов, против вредителей или инсектицидными агентами нуклеиновой кислоты для снижения инфицирования патогенами и заражения паразитами пчел, обязательное проведение надлежащей санации (например, отказ от повторного использования зараженных паразитами ульев) может повысить эффективность лечения и предотвращения инфекций.
[168]В настоящем изобретении также предложены и включены в него трансгенные бактериальные и дрожжевые клетки, которые экспрессируют селективный инсектицид. В одном аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая малую РНК, дцРНК, микроРНК, или устойчивая к малой РНК или микроРНК целевая молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, функционально связана с промотором и необязательно с терминатором. В некоторых вариантах реализации трансгенные бактериальные и дрожжевые клетки убивают, например, воздействуя на них нагреванием или давлением. В некоторых вариантах реализации трансгенные бактериальные и дрожжевые клетки лизируют перед предоставлением селективного инсектицида целевому организму. В некоторых вариантах реализации трансгенные бактериальные и дрожжевые клетки не лизируют.
[169]В одном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует малую РНК, или, в конкретном аспекте, микроРНК, которая может модулировать экспрессию гена в целевом организме. В некотором аспекте экзогенная нуклеиновая кислота кодирует малую РНК, которая идентична по меньшей мере на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-4 и 6-94. В дополнительном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует дцРНК. В другом аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует синтетическую микроРНК. В дополнительном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует миРНК. В одном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует предшественник малой РНК. В другом аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует предшественник микроРНК или миРНК. В одном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой встречающуюся в природе молекулу. В другом аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой синтетическую молекулу.
[170]В одном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой или кодирует предшественник со структурой «петля-на-стебле» малой РНК или, в конкретном аспекте, микроРНК, включающий последовательность, которая идентична по меньшей мере на 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-4 и 6-94. Предшественник со структурой «петля-на-стебле», применяемый в настоящем изобретении, включает последовательность, которая идентична по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-4 и 6-94.
[171]В одном аспекте экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в настоящем изобретении, представляет собой свободную РНК или экспрессируется с экспрессионной конструкции нуклеиновой кислоты, где она функционально связана с регуляторной последовательностью.
[172]В одном аспекте конструкция рекомбинантной ДНК или трансген, описанный в данном тексте, дополнительно содержит терминатор транскрипции.
[173]Ожидается, что во время действия патента, начиная с настоящей заявки, может быть разработано множество подходящих способов снижения уровня экспрессии продуктов генов, и предполагается, что в объем термина ʺснижение уровня экпрессии продукта гена клеща Varroa destructorʺ априори входят все такие новые методики.
[174]Должно быть очевидно, что некоторые свойства настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных аспектов, также могут быть предложены в комбинации в одном аспекте. И наоборот, различные свойства настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного аспекта, также могут быть предложены отдельно или в любой подходящей подкомбинации или подходящим образом в любом другом описанном аспекте настоящего изобретения. Некоторые свойства, описанные в контексте различных аспектов, не должны рассматриваться как необходимые свойства указанных аспектов, за исключением случаев, когда указанный аспект не действует без данных элементов. Различные аспекты и аспекты настоящего описания, описанные в общих чертах выше в данном тексте и заявленные в разделе формулы изобретения ниже, получили экспериментальное подтверждение в следующих примерах.
[176]Пример 1. Последовательности гена кальмодулина клеща Varroa
[177]Гены кальмодулина (CAM), приведенные в таблице 1 (SEQ ID NO: 1 и 2), или соответствующие транскрипты, использовали в качестве мишеней для полинуклеотидных композиций, содержащих полинуклеотид, который представляет собой по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов, идентичных или комплементарных указанным генам или транскриптам. Последовательности генов, приведенные в таблице 1, последовательности белков, кодируемых указанными генами, или последовательности, содержащиеся в указанных генах использовали для получения ортологичных генов кальмодулина (CAM) из других видов вредителей и паразитов членистоногих, не перечисленых в таблице 1. Такие ортологичные гены и их транскрипты затем могут служить в качестве мишеней для полинуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, или в качестве источника направленных против паразитов, против вредителей или инсектицидных полинуклеотидов, которые специально разработаны, чтобы нацеливаться на ортологичные гены или транскрипты.
[178]Таблица 1. Целевые гены кальмодулина (CAM) Varroa destructor.
[179]| Название гена | SEQ ID | Открытая рамка считывания последовательности ДНК |
| CAM-1 | 1 | ATGGCTGATCAGCTAACTGAGGAACAGATCGCCGAGTTCAAAGAGGCGTTTAGCCTGTTTGACAAGGACGGAGATGGCACGATCACGACAAAGGAGCTCGGTACGGTAATGCGATCTCTCGGCCAGAACCCCACTGAGGCTGAACTGCAGGACATGATCAACGAGGTCGACGCCGACGGCTCCGGAACGATAGATTTCCCTGAGTTCCTCACAATGATGGCAAGAAAGATGAAGGACACCGACTCGGAGGAGGAGATCCGAGAGGCGTTCCGCGTATTCGACAAGGATGGCAACGGTTTCATTTCGGCGGCCGAGCTCAGGCACGTTATGACCAACCTTGGCGAGAAGCTTACGGACGAGGAGGTAGATGAGATGATTCGGGAGGCAGATATTGACGGTGATGGTCAGGTCAACTACGAGGAGTTCGTCACCATGATGACGTCCAAGTAA |
| CAM-2 | 2 | ATGGCGGATCAGCTGACCGAGGAGCAAATCGCCGAATTCAAGGAGGCTTTCAGCCTGTTCGATAAAGACGGTGATGGCACAATTACGACCAAGGAACTAGGGACCGTCATGCGGTCCCTCGGCCAGAACCCTACTGAGGCTGAGCTTCAAGACATGATCAACGAGGTCGACGCTGACGGTAACGGCACTATTGACTTTCCAGAGTTTCTCACGATGATGGCGCGTAAAATGAAGGACACCGACTCCGAGGAGGAGATCCGGGAAGCTTTTAGGGTTTTTGATAAAGACGGAAATGGCTTCATTTCGGCTGCAGAGCTGAGGCACGTAATGACCAACCTTGGCGAAAAGCTCACGGACGAGGAAGTGGACGAGATGATCCGCGAGGCGGATATCGACGGCGACGGACAGGTCAACTACGAGGAGTTCGTCACGATGATGACATCAAAATGA |
[180]Для каждой последовательности ДНК кальмодулина, представленной в SEQ ID NO: 1 и 2, фрагментами одноцепочечной или двухцепочечной ДНК или РНК в смысловой или антисмысловой ориентации, или обоими, вводили in vitro клещам Varroa, выращиваемым на чашке Петри, или наносили на поверхность ульев пчел, чтобы повлиять на экспрессию целевых генов CAM и добиться уменьшения популяции клещей Varroa destructor.
[181]Пример 2. Супрессия генов кальмодулина (CAM) Varroa destructor.
[182]Предложены полинуклеотиды для подавления экспрессии генов кальмодулина (CAM) у клеща Varroa destructor, соответствующие последовательностям SEQ ID NO: 3 и 4 (таблица 2), которые применяли для подавления экспрессии генов кальмодулина (CAM) у клеща Varroa destructor. В последовательностях SEQ ID NO: 3 и 4 описана полинуклеотидная последовательность дцРНК длиной 373 п.о. и полинуклеотидная последовательность дцРНК длиной 186 п.о., соответственно, выбранные из CAM-1 (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 3, соответствующая полинуклеотиду дцРНК CAM_L/CAM373, покрывает большую часть открытой рамки считывания гена кальмодулина CAM-1 (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO 4, соответствующая полинуклеотиду дцРНК CAM_S/CAM186, представляет собой частичный фрагмент CAM_L/CAM373 (SEQ ID NO: 3), и она также получена из CAM-1 (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 5 в таблице 2 представляет собой контрольную полинуклеотидную последовательность дцРНК, не более чем на 19 п.о. идентичную последовательности любого известного гена Varroa destructor.
[183]Таблица 2. дцРНК, нацеленные на гены кальмодулина (CAM) Varroa destructor.
[184]| Название дцРНК | SEQ ID | Последовательность нуклеиновой кислоты |
| CAM_L/CAM373 | 3 | ACAGAUCGCCGAGUUCAAAGAGGCGUUUAGCCUGUUUGACAAGGACGGAGAUGGCACGAUCACGACAAAGGAGCUCGGUACGGUAAUGCGAUCUCUCGGCCAGAACCCCACUGAGGCUGAACUGCAGGACAUGAUCAACGAGGUCGACGCCGACGGCUCCGGAACGAUAGAUUUCCCUGAGUUCCUCACAAUGAUGGCAAGAAAGAUGAAGGACACCGACUCGGAGGAGGAGAUCCGAGAGGCGUUCCGCGUAUUCGACAAGGAUGGCAACGGUUUCAUUUCGGCGGCCGAGCUCAGGCACGUUAUGACCAACCUUGGCGAGAAGCUUACGGACGAGGAGGUAGAUGAGAUGAUUCGGGAGGCAGAUAUUGAC |
| CAM_S/CAM186 | 4 | ACAAUGAUGGCAAGAAAGAUGAAGGACACCGACUCGGAGGAGGAGAUCCGAGAGGCGUUCCGCGUAUUCGACAAGGAUGGCAACGGUUUCAUUUCGGCGGCCGAGCUCAGGCACGUUAUGACCAACCUUGGCGAGAAGCUUACGGACGAGGAGGUAGAUGAGAUGAUUCGGGAGGCAGAUAUUGAC |
| SCRAM | 5 | AUACUUACUGGUGCUAAUUUUUAUCGAGGAUGCCCAACUCCCCCCACUUUAAAACUGCGAUCAUACUAACGAACUCCCGAAGGAGUGAAAGGUGUCUAUGUUGAGCUUAAUAACCUACCUUGCGAGCAAAGAAGGACUAGUUGACCCUGGGCACCCUAUAUUGUUAUGUUGUUUCGAACUGAGUUGGCACCCAUGCUGCACAUGCAACAAACAUGUCGGCCUUCGUGUCUAUCCUAGAAAAGUACCUGUGAACUUGGCUGUCUACAUCAUCAUC |
[185]Пример 3. Биоанализ Varroa destructor в день 3 после обработки специфическими дцРНК.
[186]Взрослых самок клещей собирали из колоний медоносных пчел и помещали в чашку Петри на поверхность искусственной питательной среды, содержащей смесь 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 15 мг/мл агара. В данном примере питательную среду дополняли 50 мкг канамицина на 1 мл питательной среды. Раствор питательной среды/агара также дополняли 200-500 мкг/мл дцРНК, и полученный в результате этого раствор выливали на чашку Петри. дцРНК в данном примере состояла либо из SEQ ID NO: 3 (CAM_L/CAM373), либо из SEQ ID NO: 5 (SCRAM). На каждую чашку наносили по пятнадцать клещей, и эксперимент проводили в трех повторах. Чашки с питательной средой и клещами инкубировали при 29°C и при относительной влажности 50-60%. Через определенные промежутки времени осматривали чашки и мертвых клещей подсчитывали и удаляли. Для исследования летальности клещей подсчитывали через три дня после того, как их помещали на питательную среду (ФИГ. 2). На ФИГ. 2 показано, что все клещи были мертвы через три дня после обработки, по сравнению с неподвергнутыми обработке чашками или чашками, в которых клещи питались средой, дополненной неспецифическим (SCRAM) полинуклеотидом дцРНК.
[187]Пример 4. Биоанализ Varroa destructor в день 5 после обработки дцРНК, направленной на кальмодулин.
[188]Взрослых самок клещей собирали из колоний медоносных пчел и помещали в чашку Петри на поверхность искусственной питательной среды. Искусственная питательная среда содержала смесь 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 15 мг/мл агара. В данном примере питательную среду также дополняли противогрибковым раствором (100x, Sigma Aldrich) в конечной 8x концентрации, 500 мкг/мл канамицина и 220 ед/мл нистатина. Раствор питательной среды/агара также дополняли 200-500 мкг/мл дцРНК и полученный в результате этого раствор выливали на чашку Петри. дцРНК в данном примере состояла либо из SEQ ID NO: 3 (CAM_L/CAM373), либо из SEQ ID NO: 4 (CAM_S/CAM186), либо из SEQ ID NO: 5 (SCRAM). На каждую чашку наносили по пятнадцать клещей и эксперимент проводили в трех повторах. Чашки с питательной средой и клещами инкубировали при 29°C и при относительной влажности 50-60%. Через определенные промежутки времени осматривали чашки и мертвых клещей подсчитывали и удаляли. Для исследования летальности клещей подсчитывали через пять дней после того, как их помещали на питательную среду (ФИГ. 3). Для молекулярного анализа живых клещей удаляли с чашек, быстро замораживали в жидком азоте и проводили анализ TAQMAN™, чтобы оценить уровни РНК кальмодулина (CAM). ФИГ. 3, панель A. Уровни РНК генов кальмодулина (CAM) в клещах, подвергнутых воздействию SEQ ID NO: 3 (CAM_L/CAM373) или SEQ ID NO: 4 (CAM_S/CAM186), сильно уменьшились по сравнению с неспецифической (SCRAM) обработкой или отсутствием обработки (CNTR). ФИГ. 3, панель B. Статистически значимую летальность клещей, которые были подвергнуты воздействию дцРНК против кальмодулина (CAM), наблюдали через 5 дней после обработки.
[189]Пример 5. Способ доставки полинуклеотидов дцРНК, нацеленных на гены Varroa, с применением высушенной распылением или полутвердой лекарственной формы.
[190]дцРНК, используемую для того, чтобы подавлять экспрессию целевых генов кальмодулина (CAM) Varroa, получали в лекарственной форме, содержащей 1 часть дцРНК и ~14 частей трегалозы в фосфатном буфере (раствор из 1,15 мМ KH2PO4 (одноосновной) и 8 мМ Na2HPO4 (двухосновной), pH 8,0), как показано в таблице 3. Применяя устройство для сушки распылением Büchi B-290 mini, жидкую лекарственную форму распыляли с получением капель и нагревали с газом для получения жидкотекучего порошка.
[191]Таблица 3. Получение лекарственной формы.
[192]| дцРНК | Исходный буфер (X % масса/объем трегалозы+фосфатный буфер) | Конечный буфер ( X % масса/объем трегалозы+фосфатный буфер) | Общий объем (мл) | Исходный буфер (мл) | Исходный раствор дцРНК (мл) | Отношение | Конц. активного ингредиента (АИ) (мг/мл) | Конц. активного ингредиента (АИ) (% твердого вещества) | Отношение АИ (дцРНК) к буферу (трегалоза+фосфатный буфер) |
| CAM_L/CAM373 | 40 | 10 | 1100 | 275,00 | 825,00 | 1/4 | 7,20 | 0,720 | 13,9 |
| CAM_S/CAM186 | 40 | 10 | 1285 | 321,21 | 963,75 | 1/4 | 6,75 | 0,675 | 14,8 |
[193]Полученные частицы смешивали с порошковым сахаром и равномерно наносили на ульи путем равномерного распределения порошкового сахара по поверхности рамок. В других аспектах полутвердый препарат высушенного распылением материала получали в воде, и сахарно-водную лекарственную форму (ʺконфету для пчелʺ) скармливали ульям пчел, позволяя пчелам ею кормиться.
[194]Пример 6. Уменьшение количества клещей Varroa в ульях пчел in vivo после обработки дцРНК, нацеленной на гены кальмодулина (CAM).
[195]Варриатозных клещей, паразитирующих на взрослых медоносных пчелах в ульях, собирали и подсчитывали, используя стандартную методику подсчета клещей. Ульи подвергали обработке высушенной распылением дцРНК согласно примеру 7, содержащей SEQ ID NO: 3 (CAM-L), SEQ ID NO: 4 (CAM-S), или не подвергали обработке (контроль). Клещевую нагрузку на каждый улей оценивали в начале эксперимента и через 2 недели, 4 недели и 12 недель после обработки. На ФИГ. 4 показана клещевая нагрузка на подвергнутые обработке ульи по сравнению с ульями, которые не подвергали обработке. Подсчитанное количество клещей нормировали на 100 взрослых пчел, и оно представляло собой типичную нагрузку клещом Varroa.
[196]Пример 7. Обнаружение переходных малых РНК в Varroa после обработки дцРНК, нацеленной на гены кальмодулина (CAM).
[197]Клещей Varroa собирали из ульев, подвергнутых обработке полинуклеотидами дцРНК с последовательностью SEQ ID NO: 3, через 7 дней после обработки. Экстрагировали РНК Varroa и проводили анализ секвенирования малых РНК, применяя платформу SOLiD. Большая часть молекул малых РНК была обнаружена за пределами участка последовательности дцРНК и, в частности, в направлении 3'-части участка дцРНК с последовательностью SEQ ID NO: 3. Кроме того, большая часть переходных считываний находилась в антисмысловой ориентации по сравнению с последовательностью транскрипта гена кальмодулина (CAM). Кроме того, в данном эксперименте обнаружили малые РНК, специфичные к CAM-2 (SEQ ID NO: 2), несмотря на то, что ульи были подвергнуты обработке дцРНК против SEQ ID NO: 3, которая, как было предсказано, специфична к CAM-1 (SEQ ID NO: 1). Данное наблюдение подкрепляет гипотезу, состоящую в том, что подавление экспрессии РНК и образования переходных малых РНК в Varroa работает, даже когда лишь малый фрагмент полностью идентичен между двумя генами на уровне ДНК (в данном случае 23 нуклеотида).
[198]Пример 8. Гомологи гена кальмодулина (CAM) из видов вредителей и паразитов членистоногих и соответствующие полинуклеотиды дцРНК.
[199]Применяя стандартную методику биоинформатики и последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 для Varroa destructor, идентифицировали набор из 31 консервативной последовательности генов кальмодулина (CAM) у видов вредителей членистоногих, которые паразитируют либо на другом членистоногом, либо на млекопитающем, и которые будут мишенью для регуляции генов. Данные последовательности идентифицировали и представляли в виде филогенетического дерева на ФИГ. 1. Последовательности ДНК на ФИГ. 1 дополнительно анализировали путем идентификации консервативного домена из 373 п.о. внутри каждой последовательности, который соответствует последовательности SEQ ID NO: 3 (CAM_L/CAM373). В таблице 4 приведен перечень SEQ ID NO вновь идентифицированных последовательностей генов кальмодулина (CAM), а также соответствующие триггерные последовательности полинуклеотида дцРНК длиной 373 п.о. Последовательности полинуклеотида дцРНК длиной 373 п.о. тестируют либо отдельно, либо в комбинации в анализах кормления непосредственно на соответствующих видах членистоногих.
[200]Таблица 4. Последовательности генов кальмодулина (CAM), идентифицированные у вредителей или паразитов членистоногих, и соответствующие полинуклеотиды РНК длиной 373 п.о.
[201]| SEQ ID NO | Название гена | Организм/вид | Тип |
| 6 | CAM-3 | Varroa destructor | кДНК |
| 7 | CAM-1 | Ixodes scapularis | кДНК |
| 8 | CAM-1 | Aedes aegypti | кДНК |
| 9 | CAM-1 | Culex quinquefasciatus | кДНК |
| 10 | CAM-1 | Acyrthosiphon pisum | кДНК |
| 11 | CAM-1 | Harpegnathos saltator | кДНК |
| 12 | CAM-1 | Pediculus humanus corporis | кДНК |
| 13 | CAM-1 | Anopheles gambiae | кДНК |
| 14 | CAM-1 | Solenopsis invicta | кДНК |
| 15 | CAM-1 | Ixodes scapularis | РНК |
| 16 | CAM-1 | Aedes aegypti | РНК |
| 17 | CAM-1 | Culex quinquefasciatus | РНК |
| 18 | CAM-1 | Acyrthosiphon pisum | РНК |
| 19 | CAM-1 | Harpegnathos saltator | РНК |
| 20 | CAM-1 | Pediculus humanus corporis | РНК |
| 21 | CAM-1 | Anopheles gambiae | РНК |
| 22 | CAM-1 | Solenopsis invicta | РНК |
| 23 | CAM-3 | Varroa destructor | РНК |
| 24 | CAM-1 | Tetranychus urticae | кДНК |
| 25 | CAM-1 | Tetranychus urticae | РНК |
| 26 | CAM-4 | Varroa destructor | кДНК |
| 27 | CAM-4 | Varroa destructor | РНК |
| 28 | CAM-5 | Varroa destructor | кДНК |
| 29 | CAM-5 | Varroa destructor | РНК |
| 30 | CAM-7 | Varroa destructor | кДНК |
| 31 | CAM-7 | Varroa destructor | РНК |
| 32 | CAM-8 | Varroa destructor | кДНК |
| 33 | CAM-8 | Varroa destructor | РНК |
| 34 | CAM-9 | Varroa destructor | кДНК |
| 35 | CAM-9 | Varroa destructor | РНК |
| 36 | CAM | Ixodes scapularis | кДНК |
| 37 | CAM | Ixodes scapularis | РНК |
| 38 | CAM | Ixodes scapularis | кДНК |
| 39 | CAM | Ixodes scapularis | РНК |
| 40 | CAM | Ixodes scapularis | кДНК |
| 41 | CAM | Ixodes scapularis | кДНК |
| 42 | CAM | Ixodes scapularis | РНК |
| 43 | CAM | Aedes aegypti | кДНК |
| 44 | CAM | Aedes aegypti | РНК |
| 45 | CAM | Aedes aegypti | кДНК |
| 46 | CAM | Aedes aegypti | РНК |
| 47 | CAM | Aedes aegypti | кДНК |
| 48 | CAM | Aedes aegypti | РНК |
| 49 | CAM | Culex quinquefasciatus | кДНК |
| 50 | CAM | Culex quinquefasciatus | РНК |
| 51 | CAM | Culex quinquefasciatus | кДНК |
| 52 | CAM | Culex quinquefasciatus | РНК |
| 53 | CAM | Culex quinquefasciatus | кДНК |
| 54 | CAM | Culex quinquefasciatus | РНК |
| 55 | CAM | Culex quinquefasciatus | кДНК |
| 56 | CAM | Culex quinquefasciatus | РНК |
| 57 | CAM | Acyrthosiphon pisum | кДНК |
| 58 | CAM | Acyrthosiphon pisum | РНК |
| 59 | CAM | Acyrthosiphon pisum | кДНК |
| 60 | CAM | Acyrthosiphon pisum | РНК |
| 61 | CAM | Pediculus humanus | кДНК |
| 62 | CAM | Pediculus humanus | РНК |
| 63 | CAM | Pediculus humanus | кДНК |
| 64 | CAM | Pediculus humanus | РНК |
| 65 | CAM | Pediculus humanus | кДНК |
| 66 | CAM | Pediculus humanus | РНК |
| 67 | CAM | Pediculus humanus | кДНК |
| 68 | CAM | Pediculus humanus | РНК |
[202]Пример 9. Транскрипты гена кальмодулина (CAM) Varroa и триггерные последовательности дцРНК.
[203]Последовательности кальмодулина (CAM), приведенные в таблице 5 (SEQ ID NO: 69 и 70), или соответствующие транскрипты использовали в качестве мишеней для полинуклеотидных композиций, содержащих полинуклеотид, который представляет собой по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов, идентичных или комплементарных указанным генам или транскриптам. Последовательности 5'- и 3'-НТО последовательностей кальмодулина Varroa идентифицировали путем секвенирования РНК.
[204]Таблица 5. Целевые транскрипты генов кальмодулина (CAM) Varroa destructor.
[205]| Название гена и вид | SEQ ID NO | Тип |
| CAM-1; Varroa destructor | 69 | РНК |
| CAM-2; Varroa destructor | 70 | РНК |
[206]Последовательности SEQ ID NO: 69 и 70 покрывали фрагментами длиной 150 п.о. В таблице 6 проиллюстрирована верхняя цепь (5'-3') для фрагментов длиной 150 п.о., которые целиком покрывают последовательности SEQ ID NO: 69 и 70.
[207]Таблица 6. Покрытые полинуклеотидные последовательности генов CAM-1 и CAM-2.
[208]| Название гена | SEQ ID NO | Положение внутри последовательности транскрипта |
| CAM-1 | 71 | 1-150 |
| CAM-1 | 72 | 151-300 |
| CAM-1 | 73 | 301-450 |
| CAM-1 | 74 | 451-600 |
| CAM-1 | 75 | 601-750 |
| CAM-1 | 76 | 751-900 |
| CAM-1 | 77 | 901-1050 |
| CAM-1 | 78 | 1051-1200 |
| CAM-1 | 79 | 1201-1350 |
| CAM-1 | 80 | 1351-1500 |
| CAM-2 | 81 | 1-150 |
| CAM-2 | 82 | 151-300 |
| CAM-2 | 83 | 301-450 |
| CAM-2 | 84 | 451-600 |
| CAM-2 | 85 | 601-750 |
| CAM-2 | 86 | 751-900 |
| CAM-2 | 87 | 901-1050 |
[209]Одну или более дцРНК, включающих последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 71-87, предоставляли in vitro клещам Varroa, которых растили на чашке Петри, или наносили на поверхности ульев пчел, чтобы повлиять на экспрессию целевых генов CAM и добиться уменьшения популяции клещей Varroa destructor.
[210]Пример 10. Биоанализ in vitro нацеленых на кальмодулин (CAM) триггеров в клеще Varroa.
[211]Полинуклеотидные триггерные последовательности, нацеленные на кальмодулин (CAM)-1 и 2, получали на основании перекрывания консервативных последовательностей CAM-1 и CAM-2. Они представлены как последовательности SEQ ID NO: 88 и 89 (нацеленные на CAM-1 и CAM-2, соответственно).
[212]Способность полинуклеотидных последовательностей, выбранных из последовательностей SEQ ID NO: 88 и 89, подавлять жизнеспособность взрослых клещей Varroa исследовали в биоанализе in vitro. Взрослых самок клещей собирали из колоний медоносных пчел и помещали в чашку Петри на поверхность искусственной питательной среды. Искусственная питательная среда содержала смесь 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 15 мг/мл агара. В данном примере питательную среду также дополняли противогрибковым раствором (100x, Sigma Aldrich) в конечной 8x концентрации, 500 мкг/мл канамицина и 220 ед/мл нистатина. Раствор питательной среды/агара также дополняли 200-500 мкг/мл дцРНК, и полученный в результате этого раствор выливали на чашку Петри. дцРНК в данном примере состояла либо из SEQ ID NO: 3 (CAM373), либо из SEQ ID NO: 88 (CAM-1), либо из SEQ ID NO: 89 (CAM-2), либо из не подвергнутого обработке контроля (NTC). На каждую чашку наносили по пятнадцать клещей и эксперимент проводили в трех повторах. Чашки с питательной средой и клещами инкубировали при 29°C и при относительной влажности 50-60%. Через определенные промежутки времени осматривали чашки и мертвых клещей подсчитывали и удаляли. Для исследования летальности, клещей подсчитывали через пять и шесть дней после того, как их помещали на питательную среду (ФИГ. 5.). Кроме того, дцРНК для SEQ ID NO: 88 (CAM-1) и SEQ ID NO: 89 (CAM-2) смешивали в эквимолярном количестве и кормили ими клещей, как описано выше. На ФИГ. 6 показан результат настоящего изобретения.
[213]Для молекулярного анализа живых клещей удаляли с чашек, быстро замораживали в жидком азоте и проводили анализ TAQMAN™, чтобы оценить уровни РНКкальмодулина (CAM).
[214]Пример 11. Снижение уровня заражения клещом Varroa in vivo подвергнутых обработке в поле ульев пчел после обработки дцРНК, нацеленной на ген кальмодулина (CAM).
[215]дцРНК, которую используют для подавления экспрессии целевых генов кальмодулина (CAM) Varroa, получали путем смешивания исходного раствора дцРНК в фосфатном буфере с 66% сахарным сиропом. Жидкую лекарственную форму давали в виде сиропа пчелам, позволяли им кормиться до тех пор, пока они его не съели (приблизительно 2-3 дня). Каждая группа полевого испытания состояла из 33 ульев. Указанные группы состояли из неподвергнутых обработке ульев, подвергнутых обработке неспецифическим триггером (SEQ ID NO: 5) ульев и подвергнутых обработке специфическим триггером (SEQ ID NO: 3) ульев. Пчел подвергали двум циклам обработки, каждый цикл состоял из двух кормлений с интервалом в две недели: в начале доставки (неделя 0) и две недели спустя (неделя 2), а затем снова в недели 13 и 15. Оценку выживаемости пчел проводили через 4, 9, 13, 15 и 17 недель (ФИГ. 7). Существенное подавление популяции Varroa наблюдали после обработки специфическим триггером (SEQ ID NO:3) через 9 недель.
[216]Пример 12. Биоанализ in vitro нацеленных на кальмодулин (CAM) триггеров в клеще Varroa.
[217]Полинуклеотидные триггерные последовательности, нацеленные на кальмодулин (CAM)-1 и 2, получали на основании перекрывания консервативных последовательностей CAM-1 и CAM-2. Они представлены в таблице 7 как последовательность SEQ ID NO: 3. Кроме того, указанные полинуклеотидные последовательности модифицировали, чтобы избежать наличия в них непрерывного участка последовательности из 19 оснований, которые идентичны или комплементарны последовательности гена нецелевого организма. Данные модификации представлены в полинуклеотидных последовательностях SEQ ID NO: 90-92.
[218]Таблица 7. Триггеры, нацеленные на CAM-1 и CAM-2.
[219]| Целевой ген | SEQ ID NO | Нативная или модифицированная |
| CAM-1 | 3 | Нативная |
| CAM-1 | 90 | Делеция 4 п.о. |
| CAM-1 | 91 | Делеция 4 п.о. |
| CAM-2 | 92 | Делеция 1 п.о. |
[220]В биоанализе in vitro исследовали способность полинуклеотидных последовательностей подавлять жизнеспособность взрослых клещей Varroa. Взрослых самок клещей собирали из колоний медоносных пчел и помещали в чашку Петри на поверхность искусственной питательной среды. Искусственная питательная среда содержала смесь 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 15 мг/мл агара. В данном примере питательную среду также дополняли противогрибковым раствором (100x, Sigma Aldrich) в конечной 8x концентрации, 500 мкг/мл канамицина и 220 ед/мл нистатина. Раствор питательной среды/агара также дополняли 200-500 мкг/мл дцРНК (либо SEQ ID NO: 3 (CAM373), либо SEQ ID NO: 90 (CAM-1), либо SEQ ID NO: 92 (CAM-2)), и полученный в результате этого раствор выливали на чашку Петри. Также получали чашки, содержащие искусственную питательную среду без дцРНК (не подвергнутый обработке контроль (NTC)). На каждую чашку наносили по пятнадцать клещей и эксперимент проводили в трех повторах. Чашки с питательной средой и клещами инкубировали при 29°C и при относительной влажности 50-60%. Через определенные промежутки времени осматривали чашки, и мертвых клещей подсчитывали и удаляли. Клещей подсчитывали через пять и шесть дней после того, как их помещали на питательную среду, чтобы определить смертность.
[221]На ФИГ. 8 показано, что наблюдали повышенную смертность клещей, подвергнутых обработке дцРНК (либо SEQ ID NO: 3 (CAM373), либо SEQ ID NO: 90 (CAM-1), либо SEQ ID NO: 92 (CAM-2)), через 5 и 6 дней после обработки по сравнению с клещами, которые не получали РНК.
[222]Проводили дополнительный биоанализ in vitro, описанный выше, в котором клещей подвергали обработке: эквимолярной смесью дцРНК, содержащей SEQ ID NO: 90 (CAM-1) и SEQ ID NO: 92 (CAM-2); дцРНК, включающей SEQ ID NO: 3 (CAM373), или дцРНК, включающей SEQ ID NO: 91 (CAM-1). На ФИГ. 9 показано, что у клещей, подвергнутых обработке дцРНК, включающей SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 91, или смесью дцРНК, содержащей SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 92, выявили пониженную жизнеспособность в день 4 (Д4). Проводили молекулярный анализ на живых клещах. Клещей удаляли с чашки, быстро замораживали в жидком азоте и проводили анализ Quantigene™, чтобы оценить уровни РНК кальмодулина (CAM). Результаты показаны на ФИГ. 10.
[223]Пример 13.Снижение уровня заражения клещом Varroa in vivo подвергнутых обработке в поле ульев пчел после обработки дцРНК, нацеленной на ген кальмодулина (CAM).
[224]дцРНК, которую используют для подавления экспрессии целевых генов кальмодулина (CAM) Varroa, получали путем смешивания исходного раствора дцРНК в фосфатном буфере с 66% сахарным сиропом. Жидкую лекарственную форму давали в виде сиропа пчелам, позволяли им кормиться до тех пор, пока они его не съели (приблизительно 2-3 дня). Каждая группа полевого испытания состояла из 40 ульев. Указанные группы состояли из неподвергнутых обработке ульев и подвергнутых обработке специфическим триггером (SEQ ID NO: 91 или SEQ ID NO: 94) ульев. Последовательность SEQ ID NO 94 идентична SEQ ID NO 3, за исключением вставки от трех оснований на 5'-конце триггера. Пчел подвергали двум циклам лечения, каждый цикл состоял из двух кормлений с интервалом в две недели: в начале доставки (неделя 0) и две недели спустя (неделя 2), а затем снова в недели 13 и 15. Дозировка составляла приблизительно 200 мг триггера на улей. Оценку выживаемости пчел проводили через 0, 3, 6, 8, 14 и 19 недель (ФИГ. 11). Существенное подавление популяции Varroa наблюдали после обработки специфическими триггерами (SEQ ID NO: 91 и 94) уже в неделю 3.
[226]СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[227]<110> Beeologics, Inc
[228] Monsanto Technology LLC
[231]<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ
[232]ЗАРАЖЕНИЯ ЧЛЕНИСТОНОГИХ ПАРАЗИТАМИ И ВРЕДИТЕЛЯМИ
[235]<170> PatentIn версии 3.5
[239]<213> Varroa destructor
[241]atggctgatc agctaactga ggaacagatc gccgagttca aagaggcgtt tagcctgttt 60
[242]gacaaggacg gagatggcac gatcacgaca aaggagctcg gtacggtaat gcgatctctc 120
[243]ggccagaacc ccactgaggc tgaactgcag gacatgatca acgaggtcga cgccgacggc 180
[244]tccggaacga tagatttccc tgagttcctc acaatgatgg caagaaagat gaaggacacc 240
[245]gactcggagg aggagatccg agaggcgttc cgcgtattcg acaaggatgg caacggtttc 300
[246]atttcggcgg ccgagctcag gcacgttatg accaaccttg gcgagaagct tacggacgag 360
[247]gaggtagatg agatgattcg ggaggcagat attgacggtg atggtcaggt caactacgag 420
[248]gagttcgtca ccatgatgac gtccaagtaa 450
[252]<213> Varroa destructor
[254]atggcggatc agctgaccga ggagcaaatc gccgaattca aggaggcttt cagcctgttc 60
[255]gataaagacg gtgatggcac aattacgacc aaggaactag ggaccgtcat gcggtccctc 120
[256]ggccagaacc ctactgaggc tgagcttcaa gacatgatca acgaggtcga cgctgacggt 180
[257]aacggcacta ttgactttcc agagtttctc acgatgatgg cgcgtaaaat gaaggacacc 240
[258]gactccgagg aggagatccg ggaagctttt agggtttttg ataaagacgg aaatggcttc 300
[259]atttcggctg cagagctgag gcacgtaatg accaaccttg gcgaaaagct cacggacgag 360
[260]gaagtggacg agatgatccg cgaggcggat atcgacggcg acggacaggt caactacgag 420
[261]gagttcgtca cgatgatgac atcaaaatga 450
[265]<213> Varroa destructor
[267]acagaucgcc gaguucaaag aggcguuuag ccuguuugac aaggacggag auggcacgau 60
[268]cacgacaaag gagcucggua cgguaaugcg aucucucggc cagaacccca cugaggcuga 120
[269]acugcaggac augaucaacg aggucgacgc cgacggcucc ggaacgauag auuucccuga 180
[270]guuccucaca augauggcaa gaaagaugaa ggacaccgac ucggaggagg agauccgaga 240
[271]ggcguuccgc guauucgaca aggauggcaa cgguuucauu ucggcggccg agcucaggca 300
[272]cguuaugacc aaccuuggcg agaagcuuac ggacgaggag guagaugaga ugauucggga 360
[277]<213> Varroa destructor
[279]acaaugaugg caagaaagau gaaggacacc gacucggagg aggagauccg agaggcguuc 60
[280]cgcguauucg acaaggaugg caacgguuuc auuucggcgg ccgagcucag gcacguuaug 120
[281]accaaccuug gcgagaagcu uacggacgag gagguagaug agaugauucg ggaggcagau 180
[288]auacuuacug gugcuaauuu uuaucgagga ugcccaacuc cccccacuuu aaaacugcga 60
[289]ucauacuaac gaacucccga aggagugaaa ggugucuaug uugagcuuaa uaaccuaccu 120
[290]ugcgagcaaa gaaggacuag uugacccugg gcacccuaua uuguuauguu guuucgaacu 180
[291]gaguuggcac ccaugcugca caugcaacaa acaugucggc cuucgugucu auccuagaaa 240
[292]aguaccugug aacuuggcug ucuacaucau cauc 274
[296]<213> Varroa destructor
[298]ctgccggagg aacaggtggc tgaatttaaa gaggcctttc ttttgtttga caaggacgcc 60
[299]gatggaatga ttacggccgc cgaactaggc gtcgtcatgc gatcgcttgg ccagcgacct 120
[300]acggagcaag agctcaagaa aatggttacc atggttgacc aggacggcaa tggtacaatc 180
[301]gagttcaacg agtttttgat gatgatgtct cgcaagatga aggaggcaga ctcggaggaa 240
[302]gaactccggg aggcgttccg tgtgttcgat cgagacggtg acggattcat ctcgcgggac 300
[303]gagctcagtg tcgtcatgaa caacctcggc gagaaattaa gtgacgatga tgttgaggat 360
[304]atgattcgag aggccgatct ggacggcgat ggcaagatta actaccaaga gtttgtgctc 420
[309]<213> Ixodes scapularis
[311]atggctgatc agcttacaga agaacagatt gcagttcaag gaggcgttct tcgctgttcg 60
[312]acaaggacgg aggatggcac catcacgacc aaggagctgg gcacggtcat gcgctcgctc 120
[313]ggccagaacc cgacggaggc ggagctgcag gacatgatca acgaggtgga cgcagacggc 180
[314]aacggaacga tcgacttccc cgagttcctt acgatgatgg cgcgcaagat gaaggacacg 240
[315]gactctgagg aggagatccg ggaggcgttc cgggtgttcg acaaggacgg caacggcttc 300
[316]atctctgcgg cggagctgcg ccacgtcatg accaacctgg gcgagaagct gacggacgag 360
[317]gaggtggacg agatgatccg ggaggcggac atcgacgggg acgggcaggt caactacgaa 420
[318]ggtgggcacg ctttccctcc cttggttatc ctcctgctat gctttctgca gttgctgtga 480
[324]atggccgatc aacttacaga agagcagatt gccgaattca aagaagcgtt ttcgctgttc 60
[325]gacaaagacg gtgacggcac aatcacaacc aaggaactgg gaaccgtgat gcgatcgtta 120
[326]ggccagaacc ccacagaagc agaactgcaa gatatgataa acgaagtcga cgcggacggc 180
[327]aacggcacga tcgatttccc cgaattcctg accatgatgg ctcgcaaaat gaaggacacc 240
[328]gatagcgaag aggaaatccg ggaggcgttc cgagtcttcg acaaggacgg caacggcttc 300
[329]atctcggcag ctgagctgcg tcatgtcatg accaatctcg gcgagaagct aacggacgag 360
[330]gaggtggatg agatgatccg cgaagccgac atagatggcg atggccaagt taattatgaa 420
[331]gaattcgtaa caatgatgac atcgaagtga 450
[335]<213> Culex quinquefasciatus
[337]atggccgatc aacttacaga ggaacagatc gccgagttca aagaagcgtt ctcgctgttc 60
[338]gacaaagacg gtgacggcac gatcacgacc aaggagctgg gcaccgtgat gcgatcgtta 120
[339]ggccagaacc ccacagaagc agagctgcaa gacatgataa acgaggtcga tgcggacggc 180
[340]aacggcacga tcgacttccc cgagtttctc accatgatgg ctcgcaaaat gaaggacacc 240
[341]gatagcgaag aggaaatccg ggaggcgttc cgagtcttcg acaaggacgg caacggcttc 300
[342]atctcggcgg ccgagctgcg ccacgtcatg accaatctcg gcgagaagct cacggacgag 360
[343]gaggtggatg agatgatccg cgaggccgac attgacggcg atggccaagt taattatgaa 420
[344]gaattcgtaa caatgatgac atcgaagtga 450
[348]<213> Acyrthosiphon pisum
[350]atggctgatc aactaacaga agaacagatt gccgaattca aagaggcgtt ttcgctattc 60
[351]gacaaggacg gagatggtac catcaccacc aaagaacttg gaaccgtcat gaggtcttta 120
[352]ggccaaaatc cgactgaagc tgaactccaa gatatgatta acgaggtcga tgctgatggc 180
[353]aacggcacga tagatttccc agagttcttg actatgatgg cccgcaaaat gaaggatacc 240
[354]gatagtgagg aagaaatcag agaggctttc cgtgtatttg ataaggatgg aaacggcttt 300
[355]attagtgcag ctgagctgcg tcatgtgatg actaaccttg gagaaaagct caccgatgaa 360
[356]gaggttgatg aaatgatcag ggaagctgac attgatggtg atggtcaagt caactatgaa 420
[357]gagttcgtga ccatgatgac ttctaagtga 450
[361]<213> Harpegnathos saltator
[363]caactcacag aggaacagat cgcagagttt aaggaagcct tctcgctatt cgacaaagat 60
[364]ggcgatggca ctataacgac taaagaattg ggtacagtca tgcgatccct gggtcaaaat 120
[365]cccacagagg ccgagttaca agacatgatt aatgaagtag acgcagatgg taacggtaca 180
[366]atcgactttc cggagttctt gaccatgatg gcacgcaaaa tgaaggatac ggacagcgag 240
[367]gaggagatca gggaggcctt cagagtgttc gataaggatg gaaatggttt catatccgca 300
[368]gcggaactca gacatgttat gacaaatctg ggcgagaaac tgaccgatga ggaagtagat 360
[369]gaaatgatac gggaggcaga tatcgacggc gatggccaag tgaattatga agaatttgtg 420
[370]acgatgatga catcaaagtg a 441
[374]<213> Pediculus humanus corporis
[376]atggtttctt tttttttgcg agctgatcag ttgaccgaag aacaaattgc cgaattcaag 60
[377]gaagcatttt ccttattcga caaagatggc gatggtacca taacaactaa ggaattgggt 120
[378]acggttatga gatcactcgg tcagaatccc acagaagcag aattacaaga tatgattaat 180
[379]gaagtggatg cagatggtaa tggtaccatc gattttcccg agttcctcac catgatggct 240
[380]agaaaaatga aggatacaga cagcgaagaa gaaattagag aagcattcag agttttcgat 300
[381]aaggatggta atggttttat atcggcagcc gagctaaggc acgtcatgac gaacctgggt 360
[382]gaaaaattaa cagacgaaga agtggatgaa atgattcgag aggctgatat cgacggagat 420
[383]ggacaagtga attacgaaga atttgtggaa aacttgtga 459
[387]<213> Anopheles gambiae
[389]atggccgatc aacttacgga agaacagatc gctgaattca aagaagcgtt ctcgctgttc 60
[390]gacaaggacg gcgatggcac aatcaccacc aaggaattag gcaccgtgat gcgatcgcta 120
[391]ggccagaacc ccacagaagc tgaattgcaa gacatgatca acgaagtcga cgcggacggt 180
[392]aacggcacga tcgatttccc cgagtttcta acaatgatgg ctcgtaaaat gaaggacacg 240
[393]gacagtgaag aggaaatccg ggaggcattc cgagtcttcg acaaggacgg caacggtttt 300
[394]atctctgcag ctgagctgcg ccacgtcatg actaatctgg gcgagaagct aacagacgag 360
[395]gaggtcgacg agatgatccg tgaagccgat atagatggcg atggccaggt taattatgaa 420
[396]ggtaagagtt gcctttcgcg cccacaccaa gcattgttt 459
[400]<213> Solenopsis invicta
[402]atgatcggca cgataacgac gagaaattcc attatttcag aattcaaaga ggcatttatg 60
[403]cttttcgaca aggacgaaga tggcacgatt acgatggcgg aattaggggt tgtcatgcgg 120
[404]tctctcggtc aaagaccgtc ggagacggaa ctgcgcgata tggtgaatga ggtagatcaa 180
[405]gatggaaatg gtaccatcga gtttaacgaa tttctgcaga tgatgtcgaa gaagatgaaa 240
[406]agcgccgacg gagaggacga acttcgcgag gcgttccgag tgttcgataa gaacaacgat 300
[407]ggcttaatat cttcgaaaga gttgcgacac gtaatgacga atcttggtga aaagctctct 360
[408]gaggaggagg tcgatgatat gattaaggag gcggatctag atggcgacgg aatggtcaac 420
[409]tacgaaggta acattttgtt ttgcctagat gtttattcta taatagattt agaatttatt 480
[410]ctaagcgata tagatgaatt g 501
[414]<213> Ixodes scapularis
[416]aguucaagga ggcguucuuc gcuguucgac aaggacggag gauggcacca ucacgaccaa 60
[417]ggagcugggc acggucaugc gcucgcucgg ccagaacccg acggaggcgg agcugcagga 120
[418]caugaucaac gagguggacg cagacggcaa cggaacgauc gacuuccccg aguuccuuac 180
[419]gaugauggcg cgcaagauga aggacacgga cucugaggag gagauccggg aggcguuccg 240
[420]gguguucgac aaggacggca acggcuucau cucugcggcg gagcugcgcc acgucaugac 300
[421]caaccugggc gagaagcuga cggacgagga gguggacgag augauccggg aggcggacau 360
[428]gcagauugcc gaauucaaag aagcguuuuc gcuguucgac aaagacggug acggcacaau 60
[429]cacaaccaag gaacugggaa ccgugaugcg aucguuaggc cagaacccca cagaagcaga 120
[430]acugcaagau augauaaacg aagucgacgc ggacggcaac ggcacgaucg auuuccccga 180
[431]auuccugacc augauggcuc gcaaaaugaa ggacaccgau agcgaagagg aaauccggga 240
[432]ggcguuccga gucuucgaca aggacggcaa cggcuucauc ucggcagcug agcugcguca 300
[433]ugucaugacc aaucucggcg agaagcuaac ggacgaggag guggaugaga ugauccgcga 360
[438]<213> Culex quinquefasciatus
[440]acagaucgcc gaguucaaag aagcguucuc gcuguucgac aaagacggug acggcacgau 60
[441]cacgaccaag gagcugggca ccgugaugcg aucguuaggc cagaacccca cagaagcaga 120
[442]gcugcaagac augauaaacg aggucgaugc ggacggcaac ggcacgaucg acuuccccga 180
[443]guuucucacc augauggcuc gcaaaaugaa ggacaccgau agcgaagagg aaauccggga 240
[444]ggcguuccga gucuucgaca aggacggcaa cggcuucauc ucggcggccg agcugcgcca 300
[445]cgucaugacc aaucucggcg agaagcucac ggacgaggag guggaugaga ugauccgcga 360
[450]<213> Acyrthosiphon pisum
[452]acagauugcc gaauucaaag aggcguuuuc gcuauucgac aaggacggag augguaccau 60
[453]caccaccaaa gaacuuggaa ccgucaugag gucuuuaggc caaaauccga cugaagcuga 120
[454]acuccaagau augauuaacg aggucgaugc ugauggcaac ggcacgauag auuucccaga 180
[455]guucuugacu augauggccc gcaaaaugaa ggauaccgau agugaggaag aaaucagaga 240
[456]ggcuuuccgu guauuugaua aggauggaaa cggcuuuauu agugcagcug agcugcguca 300
[457]ugugaugacu aaccuuggag aaaagcucac cgaugaagag guugaugaaa ugaucaggga 360
[462]<213> Harpegnathos saltator
[464]acagaucgca gaguuuaagg aagccuucuc gcuauucgac aaagauggcg auggcacuau 60
[465]aacgacuaaa gaauugggua cagucaugcg aucccugggu caaaauccca cagaggccga 120
[466]guuacaagac augauuaaug aaguagacgc agaugguaac gguacaaucg acuuuccgga 180
[467]guucuugacc augauggcac gcaaaaugaa ggauacggac agcgaggagg agaucaggga 240
[468]ggccuucaga guguucgaua aggauggaaa ugguuucaua uccgcagcgg aacucagaca 300
[469]uguuaugaca aaucugggcg agaaacugac cgaugaggaa guagaugaaa ugauacggga 360
[474]<213> Pediculus humanus corporis
[476]acaaauugcc gaauucaagg aagcauuuuc cuuauucgac aaagauggcg augguaccau 60
[477]aacaacuaag gaauugggua cgguuaugag aucacucggu cagaauccca cagaagcaga 120
[478]auuacaagau augauuaaug aaguggaugc agaugguaau gguaccaucg auuuucccga 180
[479]guuccucacc augauggcua gaaaaaugaa ggauacagac agcgaagaag aaauuagaga 240
[480]agcauucaga guuuucgaua aggaugguaa ugguuuuaua ucggcagccg agcuaaggca 300
[481]cgucaugacg aaccugggug aaaaauuaac agacgaagaa guggaugaaa ugauucgaga 360
[486]<213> Anopheles gambiae
[488]acagaucgcu gaauucaaag aagcguucuc gcuguucgac aaggacggcg auggcacaau 60
[489]caccaccaag gaauuaggca ccgugaugcg aucgcuaggc cagaacccca cagaagcuga 120
[490]auugcaagac augaucaacg aagucgacgc ggacgguaac ggcacgaucg auuuccccga 180
[491]guuucuaaca augauggcuc guaaaaugaa ggacacggac agugaagagg aaauccggga 240
[492]ggcauuccga gucuucgaca aggacggcaa cgguuuuauc ucugcagcug agcugcgcca 300
[493]cgucaugacu aaucugggcg agaagcuaac agacgaggag gucgacgaga ugauccguga 360
[498]<213> Solenopsis invicta
[500]cagaauucaa agaggcauuu augcuuuucg acaaggacga agauggcacg auuacgaugg 60
[501]cggaauuagg gguugucaug cggucucucg gucaaagacc gucggagacg gaacugcgcg 120
[502]auauggugaa ugagguagau caagauggaa augguaccau cgaguuuaac gaauuucugc 180
[503]agaugauguc gaagaagaug aaaagcgccg acggagagga cgaacuucgc gaggcguucc 240
[504]gaguguucga uaagaacaac gauggcuuaa uaucuucgaa agaguugcga cacguaauga 300
[505]cgaaucuugg ugaaaagcuc ucugaggagg aggucgauga uaugauuaag gaggcggauc 360
[510]<213> Varroa destructor
[512]acagguggcu gaauuuaaag aggccuuucu uuuguuugac aaggacgccg auggaaugau 60
[513]uacggccgcc gaacuaggcg ucgucaugcg aucgcuuggc cagcgaccua cggagcaaga 120
[514]gcucaagaaa augguuacca ugguugacca ggacggcaau gguacaaucg aguucaacga 180
[515]guuuuugaug augaugucuc gcaagaugaa ggaggcagac ucggaggaag aacuccggga 240
[516]ggcguuccgu guguucgauc gagacgguga cggauucauc ucgcgggacg agcucagugu 300
[517]cgucaugaac aaccucggcg agaaauuaag ugacgaugau guugaggaua ugauucgaga 360
[522]<213> Tetranychus urticae
[524]attcatcaga tttaaaatta ttcaccttgt acctgaatta aaacaatagt attatataag 60
[525]atggctgacc agctaactga agagcaaatt gctgaattta aggaggcctt ttcattgttt 120
[526]gataaagatg gtgatggtac aattaccacc aaggaattgg gaactgttat gagaagtcta 180
[527]ggtcaaaatc caacagaagc ggaattacaa gatatgatca atgaagttga tgccgatggt 240
[528]aatggtacta ttgattttcc tgaattcttg actatgatgg ctagaaaaat gaaggataca 300
[529]gactcagagg aggaaatccg tgaagctttc cgtgtttttg ataaagatgg taatggtttt 360
[530]atttctgctg ctgaattgag acatgtaatg accaatttgg gtgaaaaatt gaccgacgaa 420
[531]gaagtagatg aaatgattcg tgaagccgat attgacggtg atggtcaagt taattatgaa 480
[532]gaatttgtaa cgatgatgac atccaaatga ataaaagcac aaggttaatt gttcatttta 540
[533]attagatcca atggatccca tcagtgacag ggataaaaat taatcaataa aagatgaaaa 600
[534]gcaaaaaata catggaagct atcatca 627
[538]<213> Tetranychus urticae
[540]caaauugcug aauuuaagga ggccuuuuca uuguuugaua aagaugguga ugguacaauu 60
[541]accaccaagg aauugggaac uguuaugaga agucuagguc aaaauccaac agaagcggaa 120
[542]uuacaagaua ugaucaauga aguugaugcc gaugguaaug guacuauuga uuuuccugaa 180
[543]uucuugacua ugauggcuag aaaaaugaag gauacagacu cagaggagga aauccgugaa 240
[544]gcuuuccgug uuuuugauaa agaugguaau gguuuuauuu cugcugcuga auugagacau 300
[545]guaaugacca auuuggguga aaaauugacc gacgaagaag uagaugaaau gauucgugaa 360
[550]<213> Varroa destructor
[554]<223> неясно во всех n положениях
[557]<222> (1100)..(1110)
[558]<223> n представляет собой a, c, g или t
[560]ggctcgtaca ccgagagaga acggtggact ccattgctgt cctgagtgcg tttctcgtcg 60
[561]gctgtgtcgt attgcgtgtc tgtccgtgct ttcgtgcaca taagttttct ttccacattg 120
[562]gagatattgt gaatagtatc ctttgtgttt agtgcctgaa caatatttga aatcgtcgaa 180
[563]cgtatcaaga cataaaaacg agccaaaatg gctgatcaac ttacggaaga acaaatcgca 240
[564]gaatttaagg aagcattttc actatttgat aaagatggag atggtaccat cacaactaaa 300
[565]gagttgggta cagttatgcg atcactaggt caaaatccca cagaagctga gcttcaggat 360
[566]atgattaatg aagttgatgc agatggtaat ggcacaatcg attttccgga attcttaact 420
[567]atgatggctc gtaaaatgaa agatactgat agtgaggaag aaattaggga ggccttcaga 480
[568]gtatttgata aggatggaaa tggtttcata tccgcagcag aactcagaca tgttatgaca 540
[569]aatcttggcg agaaactcac tgatgaagaa gttgatgaaa tgattcggga ggctgacatt 600
[570]gatggtgatg gccaagttaa ttatgaagaa ttcgtcacaa tgatgacatc aaagtgaatg 660
[571]caacctgtgt aatggaaaaa cttgcaactt ggagtggtgt tgacgtatta agataaatca 720
[572]agaaacaaag aaaaatataa tgttaacaaa aaacgaatcg accagaaagt gaaaaaaatc 780
[573]ttgtatctgg acgcaaagat gtctataaaa cgcgaaaaat taacgtccaa cacgcgttaa 840
[574]tcatcattaa cgataagtaa tacagggcaa ttgtttaatt aaaagagtta taccactaaa 900
[575]aatcattatc tctaaataca caaaacttaa ttacacaaca tgaacataaa aatacatatt 960
[576]actcgcgcac atacatgaat acaaaaaaat atacagcaca cagaaatacc atctacataa 1020
[577]aagataattt atttccgtat taaaaagtat ataattaaaa aatgttagag atatatatat 1080
[578]ataatatata tatatatatn nnnnnnnnnn gtaa 1114
[582]<213> Varroa destructor
[584]acaaaucgca gaauuuaagg aagcauuuuc acuauuugau aaagauggag augguaccau 60
[585]cacaacuaaa gaguugggua caguuaugcg aucacuaggu caaaauccca cagaagcuga 120
[586]gcuucaggau augauuaaug aaguugaugc agaugguaau ggcacaaucg auuuuccgga 180
[587]auucuuaacu augauggcuc guaaaaugaa agauacugau agugaggaag aaauuaggga 240
[588]ggccuucaga guauuugaua aggauggaaa ugguuucaua uccgcagcag aacucagaca 300
[589]uguuaugaca aaucuuggcg agaaacucac ugaugaagaa guugaugaaa ugauucggga 360
[594]<213> Varroa destructor
[596]tttttttttt ttttcgaaga aatcgtatca tcgaacatcg gatcgaattt cgatccacga 60
[597]cgctcgaatt acatgcaacg aagtgaatgt cagagggggg ggggcagggg aaaagtatgc 120
[598]gacgaacgtg tacgtccgtc gtccgctggc tcgtcgttaa ttcgttctat ctaacacaga 180
[599]cacgagaata agtaagatcc tagtagcccg gggacagcac ctcctcctcc tcgtcctcct 240
[600]cgtcgtcgtc gatccccggc tctccgagcg cgtggacgaa ttcgtagaaa tcgatacggc 300
[601]cgtctccgtc cacgtccact tccttgatca tatcctcgat ctcttcttcc gacaagtcct 360
[602]cgccgagaca ttgcagcact gccctcaaat cggatgcggt gatgtatcct cgattgtgtt 420
[603]tatcgaatac ccggaacgca tccctcagct cctgctcttc ctgatcctga tccgtggggg 480
[604]cggtttcatt cgcacctatg ttgctcacga tttccacgaa ctcttcgaag ctgacatttc 540
[605]catccccgtc gatgtcgatc tcctgcaaca tggtgcgcag ctcctcggcc ctcgcgaatt 600
[606]gccccaacga gcgcatcacc ctcccgagct cctccttcgt gatgctcccg tccccgtcct 660
[607]tgtcgaacag tctgaacgct tccctgaatt ctttcatttg agatttggat atattgctcg 720
[608]gtatcttggt ggacgactca gaggcggatt ttttcggcga cgcaggtaag gagaagagga 780
[609]cgttggtcga caatttgccg gcctccgtgg acgaggaggc cg 822
[613]<213> Varroa destructor
[615]aacguguacg uccgucgucc gcuggcucgu cguuaauucg uucuaucuaa cacagacacg 60
[616]agaauaagua agauccuagu agcccgggga cagcaccucc uccuccucgu ccuccucguc 120
[617]gucgucgauc cccggcucuc cgagcgcgug gacgaauucg uagaaaucga uacggccguc 180
[618]uccguccacg uccacuuccu ugaucauauc cucgaucucu ucuuccgaca aguccucgcc 240
[619]gagacauugc agcacugccc ucaaaucgga ugcggugaug uauccucgau uguguuuauc 300
[623]<213> Varroa destructor
[625]ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgccg tgttaagaac tagacaaagg caacaaccgg 60
[626]aagacatctg ttaggccagt tgggtgaagg gaaataaact cgcaacaaag agctactgtt 120
[627]gcaaaagcta tctgttctga gtcctagact agactgggat cgactaacaa ctctgcaggc 180
[628]cgtggaccac tatcactgaa caacgccgca ggaccgagcg attgagaagt tggccgcggc 240
[629]tgggacgctc tggctcactt gatctgatta ctacttacac caggtcaatt taaccaagcc 300
[630]gttgaaccac tcctacatgg aaacacacat ctacactctc atccaattgt gtacacgcga 360
[631]agcaaacgac aacggtatta gcagcgacac taacaaaaac gaatctgcca gaaaccgagt 420
[632]aacgctgatt tctgcagcgg cgttcctacg aacttaccac agacccggtc ggcacaatag 480
[633]tttgaaggtt agcatcggcc cgtgaactat agtgaaagga actgagcgaa atactatagt 540
[634]tgttgaacag caggcttcaa agtaaagaag tgaatattct tatggtgaca acaaattttg 600
[635]tctgtagtgg tcaagaccct actcaatgaa gtgagaagcg aattcatatg tgctcagtta 660
[636]tagcagttgt ttgtcgtaat gccgccaata tacgacgtct gtgtgtctcg atactggcgt 720
[637]atctgactga ttccgatcgg tgtcattgat ctgcaaagcc aattgttttc tttacgtccc 780
[638]ggatagagca aacgatcatg gcaacggaaa catttggcct gccggaggaa caggtggctg 840
[639]aatttaaaga ggcctttctt ttgtttgaca aggacgccga tggaatgatt acggccgccg 900
[640]aactaggcgt cgtcatgcga tcgcttggcc agcgacctac ggagcaagag ctcaagaaaa 960
[641]tggttaccat ggttgaccag gacggcaatg gtacaatcga gttcaacgag tttttgatga 1020
[642]tgatgtctcg caagatgaag gaggcagact cggaggaaga actccgggag gcgttccgtg 1080
[643]tgttcgatcg agacggtgac ggattcatct cgcgggacga gctcagtgtc gtcatgaaca 1140
[644]acctcggcga gaaattaagt gacgatgatg ttgaggatat gattcgagag gccgatctgg 1200
[645]acggcgatgg caagattaac taccaagagt ttgtgctcat tatcacctcc gccaagtagg 1260
[646]ccttggagtt gctcgcgcac acacatgcta ttcctcttgt cctacacgac aaacactata 1320
[647]cacgttacaa tacggaaaaa tgaaataaaa gcacagtcac acttattcat tcattcacag 1380
[648]aggatcactg gcgtgtcctc attaatatgg ctgacaaata ctattgattt gtctcgactg 1440
[649]agctatcagg cacacgcata ttgtctgttc cgatacgtgc aataataggt aaagtggtgt 1500
[650]tagcttgagc accttacggt ttacatttat tccgtattaa cggtactatg tctcaatagt 1560
[651]catgtcgcag cattagccag ctaacattaa atttagttga tttttatttt atttttttac 1620
[652]acaacaagaa ttatcttact atttggcaag ctgactgcga gtagtaaaat taccctagta 1680
[653]aaaaaaaaag gctttaaaaa cgatttaaca aaggtgcgtc catttaaaaa agtatgacac 1740
[654]aagctaatgt gttcgatcgc ggtcggttgc attcggccag tttgtgagac gcgaaattta 1800
[655]ccagcagccg tcaacaacga tggaataatt atatattaaa tataaataat aaaatatctg 1860
[656]ttacacattc tatgtgaata aagttataca tatatatata catacaacag caatgatata 1920
[657]tatgatgata cgtatactat atagaagtat ccactgatat aggataatgg gaaattctgg 1980
[658]aaaggagaaa acatattctt ctttcataat taatgaatta tcatcgagca cctcaagaat 2040
[659]ttgcttagac atattacaaa aaaaaaatta attcactata tataaataat cgcaattaat 2100
[660]caaaaaaaaa atacggtcat ttatggcata ccctaggtta ataaacttca taaaggtacc 2160
[661]tatatatata tcttttttac tgtctcttta atcgtcatta tacatagtga cgattaaaga 2220
[662]gagagagtaa aaaagaggtc aaaataaaag acttgaagtc gattgaggtt aatttttatt 2280
[663]ctaggttata tgtgttttag cggatttata gtgtgctcgt tgtaaaagtt gacgtaagga 2340
[664]gttgaaacgc ggagagcagt ataacagtaa aatggagagg aagtttagaa gttgggaaat 2400
[665]aaatgatttg ctactaattg gaaattacaa aaatgaccat ttaaagaact tatcattaga 2460
[666]attttaatat ctgccacact gaaccgtttt gtcattattt cgaccatagc gattttcaca 2520
[667]cagttgtctc acgtttgagg ccttatcgtt taaaggctaa cggaaatttc tctaaag 2577
[671]<213> Varroa destructor
[673]acagguggcu gaauuuaaag aggccuuucu uuuguuugac aaggacgccg auggaaugau 60
[674]uacggccgcc gaacuaggcg ucgucaugcg aucgcuuggc cagcgaccua cggagcaaga 120
[675]gcucaagaaa augguuacca ugguugacca ggacggcaau gguacaaucg aguucaacga 180
[676]guuuuugaug augaugucuc gcaagaugaa ggaggcagac ucggaggaag aacuccggga 240
[677]ggcguuccgu guguucgauc gagacgguga cggauucauc ucgcgggacg agcucagugu 300
[678]cgucaugaac aaccucggcg agaaauuaag ugacgaugau guugaggaua ugauucgaga 360
[683]<213> Varroa destructor
[685]cgcctctata cagtgaaaaa gtcggataag gttatgttac tcagtaactt aaccttatct 60
[686]tggataacgt tatttgacac gtaaacgaaa agtaataaca aagttttgta ttatggctcg 120
[687]ttattttcga gaggaagata tagatgaatt cagggaatgt ttttatctat ttgcaaggaa 180
[688]tggtcaaata cgtactttgg atgagcttac aatcattatg agatcattag gattaagtcc 240
[689]aactattgca gaattaaata aatatttgaa agataaaggt ggaaaaatgt cttttgccga 300
[690]tttcttggaa gttatgcatc tacaaactag agctgaagat ttaccaaaag aagtgataga 360
[691]tgcttttcaa gctgcagata aatttaggac tggcactata ccagctagac agttagcgca 420
[692]tatgttactc cactggggtg aacaattaag taacaaagaa gtggagcaaa ttttcagaga 480
[693]ggcaaatgtg tctccaaatg gacaagtaaa gtacgaagat tttgttaaaa tagcttgtgc 540
[694]acctgtacct gattactatt aaaataaata tttttcatat tttttaaaga tatttatata 600
[695]ctttttacac aatacacacg tatttaatta ataaaaggat aaaaatgatc ataaaagaaa 660
[696]aagaatttat tcttccagca acttatcttc gac 693
[700]<213> Varroa destructor
[702]augcuuuuca agcugcagau aaauuuagga cuggcacuau accagcuaga caguuagcgc 60
[703]auauguuacu ccacuggggu gaacaauuaa guaacaaaga aguggagcaa auuuucagag 120
[704]aggcaaaugu gucuccaaau ggacaaguaa aguacgaaga uuuuguuaaa auagcuugug 180
[705]caccuguacc ugauuacuau uaaaauaaau auuuuucaua uuuuuuaaag auauuuauau 240
[706]acuuuuuaca caauacacac guauuuaauu aauaaaagga uaaaaaugau cauaaaagaa 300
[707]aaagaauuua uucuu 315
[711]<213> Varroa destructor
[713]cgttttttta atttcaaaga ctcctgattt tcttttcttt tcctttccta caaaccaaac 60
[714]acaagctaga aagaggttcg atttttgcag gaagaagaag gaacaatggc tgatcagctc 120
[715]accgatgacc agatctctga gtttaaggaa gccttcagcc tcttcgataa ggatggagat 180
[716]ggttgtatca ccaccaagga gcttggaact gtgatgaggt ctcttggcca gaaccccact 240
[717]gaggcagagc tccaggacat gatcaacgag gtggatgctg atggcaatgg aacaattgac 300
[718]tttcctgagt tcttaaacct catggccagg aagatgaagg atactgattc tgaggaggag 360
[719]ctcaaggaag ctttccgcgt gtttgacaag gaccagaatg gcttcatttc tgcggctgag 420
[720]ctccgccatg ttatgacgaa tcttggtgag aagctcacag acgaggaagt tgatgagatg 480
[721]atccgtgagg ctgatgtaga tggtgacggc cagattaact acgaggagtt tgtcaaagtc 540
[722]atgatggcca agtgaggatc attaaccaaa ccttaaaatt tcgaaagcat aaacatttaa 600
[727]<213> Varroa destructor
[729]cagaucucug aguuuaagga agccuucagc cucuucgaua aggauggaga ugguuguauc 60
[730]accaccaagg agcuuggaac ugugaugagg ucucuuggcc agaaccccac ugaggcagag 120
[731]cuccaggaca ugaucaacga gguggaugcu gauggcaaug gaacaauuga cuuuccugag 180
[732]uucuuaaacc ucauggccag gaagaugaag gauacugauu cugaggagga gcucaaggaa 240
[733]gcuuuccgcg uguuugacaa ggaccagaau ggcuucauuu cugcggcuga gcuccgccau 300
[734]guuaugacga aucuugguga gaagcucaca gacgaggaag uugaugagau gauccgugag 360
[739]<213> Ixodes scapularis
[741]acaccgcgct cgacgagaac tcgcgcaagg agcgcgtgct aacgccgata gctctcgtac 60
[742]aaaagaaaac taaagacttg acacgctcaa taccgatctt tcacattttc agcaaaattt 120
[743]gagcattccg aatatggacc tgactccgga agagatcgcg gacatcaagg gagcgtttct 180
[744]gctgtttgac cgcaacggcg acggaaccat ctccacgact gagctagaga tggtcctccg 240
[745]cgccatgggc gaacggccca gtccttccca gctggcccgt atagtgcggc aaattgacag 300
[746]cgaccgcaat ggaagcatcg acttccaaga gtttctcttt ttcatggccg gcaggatttc 360
[747]ccacaaaggc ctctccaaaa gcgcagtcct caaggccttc caactcttcg accgcgatgg 420
[748]caatggatac atcaccaggg aggaactcgt ccacattttc acgcacgttg ggcagagcat 480
[749]gagccaagaa gacgccgaaa agataatccg cgaagtggat gtggacaagg acggaaagat 540
[750]ccattacact gaattggtca acaaggtgct gcccaccaag aagcaaaaag aagaaaccaa 600
[751]aacctagaag gtcgtcgctt ggcacggtct ttattattaa acaagtgctt tatcgcttg 659
[755]<213> Ixodes scapularis
[757]agaucgcgga caucaaggga gcguuucugc uguuugaccg caacggcgac ggaaccaucu 60
[758]ccacgacuga gcuagagaug guccuccgcg ccaugggcga acggcccagu ccuucccagc 120
[759]uggcccguau agugcggcaa auugacagcg accgcaaugg aagcaucgac uuccaagagu 180
[760]uucucuuuuu cauggccggc aggauuuccc acaaaggccu cuccaaaagc gcaguccuca 240
[761]aggccuucca acucuucgac cgcgauggca auggauacau caccagggag gaacucgucc 300
[762]acauuuucac gcacguuggg cagagcauga gccaagaaga cgccgaaaag auaauccgcg 360
[767]<213> Ixodes scapularis
[769]gattcgtcca cttattttgt ccctattctt cgtccgcagt cgtcctcgag gaaaagtgcg 60
[770]tcaggtgcgg gctacaagcg gaaactgagc ggaaagccag aaccgagcga ggagcagaag 120
[771]aatgacatga aggaagcgtt cagtctcttc gatcccagtg gcacgggctt catggagtct 180
[772]aaagatatga agtttgcaat gagagcactg ggttttgaac caaaaaagga ggaagtgaaa 240
[773]aaactgatag cagagattga caagcagggg actggaaaaa ttcccttgga ggagttcatg 300
[774]agcgtcatgt ccacgaggct ggctgagaaa gacataaatg aggagattat gaaggcgttt 360
[775]cagctgtttg atgaggatgg cactgggaag atttctttta agaacctcaa gaatgtggcc 420
[776]aaggaactgt cggagaacct cacagatgag gagcttcagg aaatgatcaa tgaagctgac 480
[777]agggatggag atggcgaagt gaaccaagag gagttcctta ggataatgaa gaagacctgc 540
[782]<213> Ixodes scapularis
[784]ugaaggaagc guucagucuc uucgauccca guggcacggg cuucauggag ucuaaagaua 60
[785]ugaaguuugc aaugagagca cuggguuuug aaccaaaaaa ggaggaagug aaaaaacuga 120
[786]uagcagagau ugacaagcag gggacuggaa aaauucccuu ggaggaguuc augagcguca 180
[787]uguccacgag gcuggcugag aaagacauaa augaggagau uaugaaggcg uuucagcugu 240
[788]uugaugagga uggcacuggg aagauuucuu uuaagaaccu caagaaugug gccaaggaac 300
[789]ugucggagaa ccucacagau gaggagcuuc aggaaaugau caaugaagcu gacagggaug 360
[794]<213> Ixodes scapularis
[796]atggccaaga acgtccgcgc cctggacacc gaggaggaga ttttggaggc cttcaaagtc 60
[797]ttcgaccgca acggcgacgg cttcgtgagc acagccgagc tccgtcacgt gatgaccacg 120
[798]ttaggcgaga agttgacgca cgaagaagtg gacgagatga tccgcgaggc cgaccgcgac 180
[799]ggcgacggac agatcaacta cgacgagttc gtggccatga tgacttccaa gtga 234
[803]<213> Ixodes scapularis
[805]cctggaaccg aggaggagat tctggaggcc ttcaaagtct tcgaccgcaa cggcgacggc 60
[806]ttcgtgagca cggccgagct ccgtcacgtg atgaccacgc taggcgagaa gttgacgcac 120
[807]gaagaagtgg acgagatgat ccgcgaggcc gaccgtgacg gcgacggaca gatcaactac 180
[808]gacgagttcg tggccatgat gacctccaag tga 213
[812]<213> Ixodes scapularis
[814]gaggaggaga uucuggaggc cuucaaaguc uucgaccgca acggcgacgg cuucgugagc 60
[815]acggccgagc uccgucacgu gaugaccacg cuaggcgaga aguugacgca cgaagaagug 120
[816]gacgagauga uccgcgaggc cgaccgugac ggcgacggac agaucaacua cgacgaguuc 180
[817]guggccauga ugaccuccaa 200
[823]atgtccgccc atagtctaac agaggaacaa gggcgccagt tccgtcagat gttcgagatg 60
[824]ttcgacaaaa atggcgacgg ttcgatcagc acatcggaac tgggatcggt cattcgggcc 120
[825]ttgggtatga atccctccat tgcggaaatc gagcaaatga tccacgaggt cgatttggac 180
[826]ggaagtgggt cgattgagtt gaacgaattt ctcatactga tggcacgtaa gtcacgggag 240
[827]ggttccacac aggaagagct acgggatgcg ttcaaaattt ttgacaagga tggagatgga 300
[828]tttctcacgg ttgacgagtt gtcggctgtt atgaagaact ttggcgagag attgaccgat 360
[829]gacgaactag cagatctgct ggaggaagcc gacatcgatg gagacggaaa gatcaactat 420
[830]gaagaatttg tcatcatgtt gagcaagtga 450
[836]acagaggaac aagggcgcca guuccgucag auguucgaga uguucgacaa aaauggcgac 60
[837]gguucgauca gcacaucgga acugggaucg gucauucggg ccuuggguau gaaucccucc 120
[838]auugcggaaa ucgagcaaau gauccacgag gucgauuugg acggaagugg gucgauugag 180
[839]uugaacgaau uucucauacu gauggcacgu aagucacggg aggguuccac acaggaagag 240
[840]cuacgggaug cguucaaaau uuuugacaag gauggagaug gauuucucac gguugacgag 300
[846]atgtccgccc aaaccccgcc agacaagctt tcccaggatc aaatcgaaga actgcgggaa 60
[847]gctttctccc tgttcgacac caacggcgac ggaaccataa cctgttcaga acttggcaca 120
[848]gtccttcgat cccttggcaa aaatgtatcc gacgcggaag tggaagaact gctcaaagaa 180
[849]gtcaacgtcg accacgaagg aatgatccac tttccggact tcgtggcaat gatgtccatc 240
[850]cgattgcggg acttcaatag cgaggaggaa ctcaaggaag ccttccggat cttcgaccgc 300
[851]aacggagatg ggctgatttc ggcggacgaa ttgcgagcgg ctctccaatc tttcggggaa 360
[852]cagctggccg aggaggaaat cgaagaactg ctccgggagg cggatgtcaa ctgcgacgga 420
[853]caaatagact acgaggagtt tgttaaaatg atcacgctga aataa 465
[859]caaaucgaag aacugcggga agcuuucucc cuguucgaca ccaacggcga cggaaccaua 60
[860]accuguucag aacuuggcac aguccuucga ucccuuggca aaaauguauc cgacgcggaa 120
[861]guggaagaac ugcucaaaga agucaacguc gaccacgaag gaaugaucca cuuuccggac 180
[862]uucguggcaa ugauguccau ccgauugcgg gacuucaaua gcgaggagga acucaaggaa 240
[863]gccuuccgga ucuucgaccg caacggagau gggcugauuu cggcggacga auugcgagcg 300
[869]tcgtcaagga tatccggcaa ctgattatga cccggcaaac caacgatccc aacggccagc 60
[870]aacaggaaca gaacgaacca gaatccagtc agaacaccca gagcgaccaa agcaacaacc 120
[871]agcccacgca gcgattggga ggaaccacct cggacttcag tgtcagctcc gcggccacta 180
[872]atcgaagtat gccccgccac caggaggaca atcccaatca accggccagc gactgttcca 240
[873]gcctcgaggg aaatgtattc gtcgaaggcg gatccggcac cggagcgcac ccgaaaacac 300
[874]gccgctcgca aacttccgat tcgatcacct ccagcaactt caactacagt ctcaaccgga 360
[875]ggttcatatc gaagaaccag atgaaggagt ttcgagaagc gttccggctg ttcgacaagg 420
[876]ataatgacgg ctcaatcacc aaggaagaac tgggaactgt catgaggtcg ttgggacaat 480
[877]ttgctcgcgt ggaagaatta caagagatgt tactggagat tgatgttgat ggcgatggaa 540
[878]acgtaagttt cgaagagttt gtcgacatca tgtccaacat gacggatacc gtggcggaaa 600
[879]catcggccga ccaggaggaa cgtgagctac gtgatgcctt ccgtgtcttc gacaagcaca 660
[880]atcgaggtta cattacggca tcagatctac gggcggttct tcaatgtctg ggcgaagatt 720
[881]tggatgaaga agaaattgaa gacatgatca aagaagtgga cgtggatgga gacggacgga 780
[882]tcgatttcta cgaattcgta catgctcttg gagaaccgga agattcccaa gaaaacgacg 840
[883]acgaagacga ggcagtgtcc ccccattcgc tgtcctgtga cgtgcatgtc taagaaccgc 900
[884]caggagaaaa atagctaacg ccaacgaatc gcattcctaa caaaatgtcg aacaatctag 960
[885]agacattgac cagatttttt ttaaatattt aacacacaaa aaaacttcgc ttaacgccat 1020
[886]tgtacttctc catacgcttg ataacagatt ccagaacacc taatgaattt atcaatctat 1080
[887]acataataac tattcatctc taatcacgaa aaaagtttaa ataaacatat caaattgagc 1140
[894]gaguuucgag aagcguuccg gcuguucgac aaggauaaug acggcucaau caccaaggaa 60
[895]gaacugggaa cugucaugag gucguuggga caauuugcuc gcguggaaga auuacaagag 120
[896]auguuacugg agauugaugu ugauggcgau ggaaacguaa guuucgaaga guuugucgac 180
[897]aucaugucca acaugacgga uaccguggcg gaaacaucgg ccgaccagga ggaacgugag 240
[898]cuacgugaug ccuuccgugu cuucgacaag cacaaucgag guuacauuac ggcaucagau 300
[902]<213> Culex quinquefasciatus
[904]atgtcggccc actcgctcac cgacgaacag cagcgccagt accggcaaat gttcgaaacg 60
[905]ttcgacaagg atggcaacgg ttccatcacg acgacggaac tgggaacgct agtgcgagcg 120
[906]ctaggtctta atccttcgat cgccgagatc gagcagatga tccacgaggt cgacctggac 180
[907]ggaagcggga cgatcgagct gaacgagttt tacgtgctga tggcccggaa gcatcgggaa 240
[908]gcctcgtcgg aggacgagct gaggcaggct ttcaaggtgt ttgacaagaa cgaggatggg 300
[909]ttcttgacgg tggaggaact gtcgatggtg atgaagaact ttggtgagcg gttgagcgat 360
[910]gaagagttgg cggatttgtt ggaggaggcg gatgttgaca aggacggtcg gattaattac 420
[911]gaggaatttg tgaccatgtt gaccaagtag 450
[915]<213> Culex quinquefasciatus
[917]acagcagcgc caguaccggc aaauguucga aacguucgac aaggauggca acgguuccau 60
[918]cacgacgacg gaacugggaa cgcuagugcg agcgcuaggu cuuaauccuu cgaucgccga 120
[919]gaucgagcag augauccacg aggucgaccu ggacggaagc gggacgaucg agcugaacga 180
[920]guuuuacgug cugauggccc ggaagcaucg ggaagccucg ucggaggacg agcugaggca 240
[921]ggcuuucaag guguuugaca agaacgagga uggguucuug acgguggagg aacugucgau 300
[925]<213> Culex quinquefasciatus
[927]atgtcatcgt cttcccgcca ccccaaaccc accgcggacc ccctgaccaa ggagcaaatc 60
[928]gaagaactgc gcgaagcgtt caccctgttc gacaccaacg gcgacggaac gatttccggc 120
[929]tcggaactgt ccaccgtgct gcgggccctc ggcaagaacg tctcggacgc cgaagtcgag 180
[930]gaactgctga aggaggtccg caccgacgac gagggccgca tccggttcgg ggactttgtg 240
[931]gccatgatga cggtccggtt gaaggacttt aacaacgagg accagctgca ggaggcgttt 300
[932]cggatcttcg atcgggacgg gaatgggcgg atttcggcgg aagagctacg ggtcgcgttg 360
[933]aggtcgtttg gggagcagtt gaccgaagag gagctggagg agttgctgcg cgaggcggac 420
[934]gtcaacagtg acggccagat tgactacggg gagtttgtgc ggatgataac gcagtga 477
[938]<213> Culex quinquefasciatus
[940]gcgaagcguu cacccuguuc gacaccaacg gcgacggaac gauuuccggc ucggaacugu 60
[941]ccaccgugcu gcgggcccuc ggcaagaacg ucucggacgc cgaagucgag gaacugcuga 120
[942]aggagguccg caccgacgac gagggccgca uccgguucgg ggacuuugug gccaugauga 180
[943]cgguccgguu gaaggacuuu aacaacgagg accagcugca ggaggcguuu cggaucuucg 240
[944]aucgggacgg gaaugggcgg auuucggcgg aagagcuacg ggucgcguug aggucguuug 300
[948]<213> Culex quinquefasciatus
[950]atgaccgatt ttctccagct tccccaatgc aatactcgac aaaccaacga cccaaacagc 60
[951]gccgagcagc aacaacagag cgaacccgaa tcgaaccaga gcagcacgca ccagagcagc 120
[952]agccacagct accagcagcc gtcgtcaacg cagcaccggt tggccggatc tccgtcgagc 180
[953]agtgccaacg cgagtcccgt gatcggccgg aacatgcccc gccaccagca ccaggacacc 240
[954]gcgcccagtg acgatgggac ctcgagcagt ctggacggga gtgtctttgc cgccgacgga 300
[955]actccgaccg ctccgggggc gttggccagg acgcgccgct cgcagacctc ggaatcgatc 360
[956]acctccagca acttcaacta cagtttgaac cggaggttca tctccaagaa ccagatgaaa 420
[957]gagttccggg aggcgttccg gctgtttgac aaggacaacg acgggtcgat cacgaaggag 480
[958]gagctgggca cggtgatgcg atcactgggg cagtttgccc gtgtcgagga actgcaggag 540
[959]atgctgctgg agattgacgt cgatggtgat ggcaacgtca gcttcgagga gtttgtcgac 600
[960]atcatgtcca acatgaccga cacggtggcg gaggcatccg ccgaccagga ggagcgcgaa 660
[961]ctccgggatg cgttccgcgt gtttgacaag cacaaccggg gctacatcac ggcgtctgat 720
[962]ctgcgggcgg ttctgcagtg tctgggagaa gatttggacg aggaagaaat cgaagacatg 780
[963]atcaaggagg tggacgtcga cggcgatgga cggatcgact tttacgagtt tgtgcacgcc 840
[964]ctcggagagc cggaagattc acaggagaac gacgacgagg aggaccccct gtcacctccg 900
[965]tcactgtcgt gtgacgtaaa cgcctaa 927
[969]<213> Culex quinquefasciatus
[971]gaguuccggg aggcguuccg gcuguuugac aaggacaacg acgggucgau cacgaaggag 60
[972]gagcugggca cggugaugcg aucacugggg caguuugccc gugucgagga acugcaggag 120
[973]augcugcugg agauugacgu cgauggugau ggcaacguca gcuucgagga guuugucgac 180
[974]aucaugucca acaugaccga cacgguggcg gaggcauccg ccgaccagga ggagcgcgaa 240
[975]cuccgggaug cguuccgcgu guuugacaag cacaaccggg gcuacaucac ggcgucugau 300
[979]<213> Culex quinquefasciatus
[981]atggtcggtg tccaagctgg ccatttgata tctcaatcac ggcggggcgg ctccgcgtgc 60
[982]gaaaacgggg aaattttgat tgatgacggc ggcggcgggg agcggcgggt tttaaacctg 120
[983]ttctacaagg ggaataaaaa tgccgatcaa cttacagagg aacagatcgc cgagttcaaa 180
[984]gaagcgttct cgctgttcga caaagacggt gacggcacga tcacgaccaa ggagctgggc 240
[985]accgtgatgc gatcgttagg ccagaacccc acagaagcag agctgcaaga catgataaac 300
[986]gaggtcgatg cggacggact gcatccgctt taa 333
[990]<213> Culex quinquefasciatus
[992]gucggugucc aagcuggcca uuugauaucu caaucacggc ggggcggcuc cgcgugcgaa 60
[993]aacggggaaa uuuugauuga ugacggcggc ggcggggagc ggcggguuuu aaaccuguuc 120
[994]uacaagggga auaaaaaugc cgaucaacuu acagaggaac agaucgccga guucaaagaa 180
[995]gcguucucgc uguucgacaa agacggugac ggcacgauca cgaccaagga gcugggcacc 240
[996]gugaugcgau cguuaggcca gaaccccaca gaagcagagc ugcaagacau gauaaacgag 300
[1000]<213> Acyrthosiphon pisum
[1002]gctgtgcacg ttttgtttac ccgaaaaatg tgattcaaac tttcagtttt ttaaatctta 60
[1003]actgcgttgt ttaagaaaaa aaaaacccta aatttattat tgtttattaa taataaatca 120
[1004]atcgatcgaa taatcgtttg cgggtatacc taagtacgaa gtaaaatatg agtgcacaaa 180
[1005]atagtgataa tgaccgttat aaaaaggaat attcgagaat aaggaaactg acgagtagat 240
[1006]atgacatacg gactcaatca aatgaatttg gtttgtcgga agatcaagtt gcggaattca 300
[1007]aagaagcatt tatgttgttc gataaagacc atgatggacg gattactgag gcagaactag 360
[1008]gagtggtcat gagatctttg ggtcaaaggc ctactgaaac tgatttgcga ggtatggtta 420
[1009]aagaagtgga taaagatggc aatggtagta ttgagtttga tgaattcctg ctaatgatgg 480
[1010]ctagaaaact aaaagcagca gatggcgagg aagaaatgca ccaagctttt aaagtatttg 540
[1011]acaaaaatgg cgatggattc ataacatttg atgaactcaa acgtgttatg tgcagtatcg 600
[1012]gagaaaggct cactgatgaa gaaattgagg acatgataaa agaagcagat ttaaatggtg 660
[1013]ataaaaaaat tgattataaa gaatttatta caataataag ttctaagaaa taaaacgaat 720
[1014]tacggacttg gatgtaccct catatggcat tcgttcctca tctgcatctg tgtcattggc 780
[1015]tgctaagact ttacttaata ataaaccttg atcttctcta ctagaataaa atagctctgg 840
[1016]atcctaaagt aaaatataca gtataatttt aaaatagtcg tatacaaatt tttttttaaa 900
[1017]tattgagtgt acctcatcca ttccagcaag tttc 934
[1021]<213> Acyrthosiphon pisum
[1023]ucaaguugcg gaauucaaag aagcauuuau guuguucgau aaagaccaug auggacggau 60
[1024]uacugaggca gaacuaggag uggucaugag aucuuugggu caaaggccua cugaaacuga 120
[1025]uuugcgaggu augguuaaag aaguggauaa agauggcaau gguaguauug aguuugauga 180
[1026]auuccugcua augauggcua gaaaacuaaa agcagcagau ggcgaggaag aaaugcacca 240
[1027]agcuuuuaaa guauuugaca aaaauggcga uggauucaua acauuugaug aacucaaacg 300
[1028]uguuaugugc aguaucggag aaaggcucac ugaugaagaa auugaggaca ugauaaaaga 360
[1033]<213> Acyrthosiphon pisum
[1035]gatttttcgt ttaaataacc cccccgggtt tcggataaac tcggtgtgcg tgtggacgcc 60
[1036]gccgccgccg cgtgagcgtt atttcgctcg ctgtgattac gaacgctcgt gcagtcgtcg 120
[1037]tcatgcagca tctccgagac ccggcgaaag accatcagag tacgtgaaca ctgcacatca 180
[1038]cactccatcg cgatatactt atctgtagga cgacaccctt taccgaggac acaatgatat 240
[1039]acacgttata atactatcgt acatcgtata tattgtattc ttatcatcta atattatatt 300
[1040]atcacaatcg ttatattgta ttatagaatt attgtatatc gttttaattt gacacgatac 360
[1041]gacatttggt gttgagaatc gcgcagagag agaaagagag agagaaaaag agagaataga 420
[1042]tattttgatg taaataatta ttacaatata atattgtatt tgaaaataga aacagataat 480
[1043]tggtcgttga ggcagttctc acctttttaa gatatacata ttatattata tataaacagt 540
[1044]attttgtttt actcctttga gtgaacattt cgtttaacta taccacaatt tattaatatt 600
[1045]atataatatc tatcatggac ggtaaaatat catcggtatt cgaaaaatac ttttcacctt 660
[1046]caccgctggt gaaccaaata aggaattttg tcaatcggca aatagacgag caaacgccac 720
[1047]aaaacgtaag cacacaacca accgctgtag cgaaacttca cagtaataat gtagtgaacg 780
[1048]gcaccactcc gaaacccatc acaagcaacg aaaaaccaac ggaagtccaa gtacatccac 840
[1049]aacccactca gcctgccgat agaaacttag tgcacgttac taaagcacag atgaaagaat 900
[1050]ttcaagaagc atttaggtta tttgataaag acggtgacgg cagcatcact aaagaggaat 960
[1051]tgggtcgagt tatgcggagt cttggacagt ttgctagaga agaagaattg gagacaatgt 1020
[1052]tacaagaagt cgacatcgat ggcgatggag cgttcagttt tcaagagttt gtagaaattg 1080
[1053]tgtacaatat gggtggtaca gcagaaaaga cggcggacca agaggaaaaa gagctccgag 1140
[1054]acgcatttag ggtatttgac aaacataacc gaggatatat aagtgcgtcg gacttgagag 1200
[1055]ctgtccttca atgtttgggt gaagatttgt cagaagaaga aatcgaggat atgatcaagg 1260
[1056]aagtagacgt ggacggagat ggaagaatcg atttttacga atttgtgaat gcccttggag 1320
[1057]aaccaggaga tgattatgat gaaaacgacg aagatgaaga agatatttat ccccaattgg 1380
[1058]acattcaaac ataacttata aacaattaca cgttttagta tgatgcgata acaagttcag 1440
[1059]ttaaaattga attatcaaaa atgataacaa tattttttgt aaacttaggt taaaatgtta 1500
[1060]aaaacttacc cattttgtaa tttctatcag gaataaacac accaatatct gttttttttt 1560
[1061]tgccaactaa tgatctctaa taagtaaaac atattttact ttaatatcaa tgtactactg 1620
[1062]tagtattgtt aagtaattta tgtcattttc aatgtttaat gtataaatta atcatttaat 1680
[1063]ggtacaatca gtaattcacc ttaagaccca attatttatt aaaaacatat tatatcatta 1740
[1064]atttacttaa tgtatacatt ttagtcaaaa aacattcagt tatatgttat aagtcgttat 1800
[1065]aactatttat ttaagaaact ataaaaaatt attatttatt ataatagttt acgtatctat 1860
[1066]ttacttccat ggaaggtatt tataaataga aaatgttaag gtaacttaat taaaacaata 1920
[1067]attatgaaca agtattttta ctttaaaaaa attacataat tatattgtca gtattctttc 1980
[1068]aaatacaatt aattcaaatt tgtgaaattg tccattcctc ctttatgctt tgtgaactaa 2040
[1069]atttaaatac attaagaacc agagtacaat taaaggaaat agtcagctgc gtgttttttt 2100
[1070]gttggcattc ctcggttttc ttgtggtgct gcctcaaata ttgtaaaatc tctttgaagt 2160
[1071]gtttcactga gttccaatat tgccgcaacg ttaccacatc tattatttac aattagtatt 2220
[1072]aacaattaaa taacagcatt aataaataaa tagtataatg taatttttag agtagtattt 2280
[1073]accgataaca atagttgggt gctgaccaaa cagtaagcac ggtttcatca aaatgccatt 2340
[1074]tatatccttc catgactagt tgatgagctc gacaaataat atctatatca tttgtagtat 2400
[1075]taaactggga gacaacatca gaaccaaata ggtatccagc accccgagga ctcacacccc 2460
[1076]atccctgagt atctaaaata attgtgtatg ttaaaaatct atttttttt 2509
[1080]<213> Acyrthosiphon pisum
[1082]acagaugaaa gaauuucaag aagcauuuag guuauuugau aaagacggug acggcagcau 60
[1083]cacuaaagag gaauuggguc gaguuaugcg gagucuugga caguuugcua gagaagaaga 120
[1084]auuggagaca auguuacaag aagucgacau cgauggcgau ggagcguuca guuuucaaga 180
[1085]guuuguagaa auuguguaca auaugggugg uacagcagaa aagacggcgg accaagagga 240
[1086]aaaagagcuc cgagacgcau uuaggguauu ugacaaacau aaccgaggau auau 294
[1090]<213> Pediculus humanus
[1092]atggccgacg aaacgacgac ggaattaccg gaggaaaatc tttcggttga aaaaatcgca 60
[1093]gaattccgcg aagctttcaa ccttttcgac aaagatggcg acggtaacat aacgaccaaa 120
[1094]gaattgggta cttgcatgag gtctctcggg cagaatccga cggaagcgga aatcgcggag 180
[1095]ctgatttgcg aagtagacgt agagggaaca ggtttaatcg atttcacatc gttcgttttg 240
[1096]ataatggcta aaaagataaa agacgtcgac aacgaggaag aactcagaga agcttttaga 300
[1097]atattcgata aggaaggtaa cggattcata accgcatccg agctcaggca cataatgatg 360
[1098]aacttgggtg aaaaattaac ggaagaagaa tgcgacgaaa tgattaggga agcggatgtc 420
[1099]atgggtgacg gaaatatcaa ttacgaagaa ttcgtcacca tgatgatgtc aaagtga 477
[1103]<213> Pediculus humanus
[1105]aaaaaucgca gaauuccgcg aagcuuucaa ccuuuucgac aaagauggcg acgguaacau 60
[1106]aacgaccaaa gaauugggua cuugcaugag gucucucggg cagaauccga cggaagcgga 120
[1107]aaucgcggag cugauuugcg aaguagacgu agagggaaca gguuuaaucg auuucacauc 180
[1108]guucguuuug auaauggcua aaaagauaaa agacgucgac aacgaggaag aacucagaga 240
[1109]agcuuuuaga auauucgaua aggaagguaa cggauucaua accgcauccg agcucaggca 300
[1110]cauaaugaug aacuugggug aaaaauuaac ggaagaagaa ugcgacgaaa ugauuaggga 360
[1111]agcggauguc augggugac 379
[1115]<213> Pediculus humanus
[1117]atggatgcta ggaatgaagt ttacaacacc gaatataatc gtttaagaaa attgacgtgt 60
[1118]agaacggaaa ttaaattatc ttgctctgaa tatggtctta cggaggaaca agtcgctgaa 120
[1119]tttaaagaag cttttatgct ttttgacaaa gatgaagatg gacaaataac aatggccgaa 180
[1120]ttaggagtcg ttatgagatc tttgggacaa cgtccgacag aaacggaatt aagagacatg 240
[1121]gttaaagagg ttgatcaaga tggaaatggt acaatcgaat tcaatgaatt tttacaaatg 300
[1122]atggcaaaaa aaatgaaagg agctgatggt gaagaagaac ttcgagaagc attcagggtg 360
[1123]tttgataaaa ataacgatgg actcatttca tccattgaac ttcgacatgt catgacaaat 420
[1124]ttaggtgaga aactttcaga cgaagaagtt gatgatatga taaaagaagc agatttagat 480
[1125]ggagatggta tggttaacta caatgaattt gtaacgatat taacatcaaa aaattaa 537
[1129]<213> Pediculus humanus
[1131]acaagucgcu gaauuuaaag aagcuuuuau gcuuuuugac aaagaugaag auggacaaau 60
[1132]aacaauggcc gaauuaggag ucguuaugag aucuuuggga caacguccga cagaaacgga 120
[1133]auuaagagac augguuaaag agguugauca agauggaaau gguacaaucg aauucaauga 180
[1134]auuuuuacaa augauggcaa aaaaaaugaa aggagcugau ggugaagaag aacuucgaga 240
[1135]agcauucagg guguuugaua aaaauaacga uggacucauu ucauccauug aacuucgaca 300
[1136]ugucaugaca aauuuaggug agaaacuuuc agacgaagaa guugaugaua ugauaaaaga 360
[1137]agcagauuua gauggagaug guaugguuaa cuacaaugaa uuuguaacga uauuaac 417
[1141]<213> Pediculus humanus
[1143]atgactacga aacataatat atctggaaga atacgggacg aaccaggggg acaaagggaa 60
[1144]aaaaatggaa atgtaaccgg tcgaacaata acatatccaa caacagggaa caaaagaaat 120
[1145]attgatacaa tgacgaaaaa taacatatca aaatcgcaaa tgaaggaatt tcgagaagct 180
[1146]tttcgacttt ttgacaaaga tggtgatggt agtataactc aagaagaact tggaagagtt 240
[1147]atgagatctt taggacaatt tgccagagaa gaagaactac aagaaatgct taaggaagtt 300
[1148]gatatagatg gagatggaaa ttttagcttt gaagaatttg ttgaaatcgt atcaaatatg 360
[1149]ggaggtgcag caactgaaaa aacagctgat gaagaagaga aagaacttag agatgctttt 420
[1150]agagtatttg ataaacataa tcgaggtttt ataagtgctt ctgatcttcg agctgttttg 480
[1151]caatgtctgg gtgaagaatt atcagaagaa gaaaaaatga taagagaagt tgatgtggat 540
[1152]ggagatggta gaattgattt tttcgaattt gttcgagctt tgggtacaca ctacaggcaa 600
[1153]aatttctttt tcaggtttct atccatttat attattagca cagtttga 648
[1157]<213> Pediculus humanus
[1159]aucgcaaaug aaggaauuuc gagaagcuuu ucgacuuuuu gacaaagaug gugaugguag 60
[1160]uauaacucaa gaagaacuug gaagaguuau gagaucuuua ggacaauuug ccagagaaga 120
[1161]agaacuacaa gaaaugcuua aggaaguuga uauagaugga gauggaaauu uuagcuuuga 180
[1162]agaauuuguu gaaaucguau caaauauggg aggugcagca acugaaaaaa cagcugauga 240
[1163]agaagagaaa gaacuuagag augcuuuuag aguauuugau aaacauaauc gagguuuuau 300
[1164]aagugcuucu gaucuucgag cuguuuugca augucugggu gaagaauuau cagaagaaga 360
[1165]aaaaaugaua agagaaguug auguggaugg agaugguaga auugauuuuu ucgaauuugu 420
[1166]ucgagcuuug gguacacacu acaggcaaa 449
[1170]<213> Pediculus humanus
[1172]atgatgaaaa acaaaactga cagcagtctc ggagctgagc attcagattt gaaacattcg 60
[1173]acgagtgaaa ccgaagaact ccaatcctcg gaactcgaag tgataaaaga tgaagagcct 120
[1174]caaatagatc tgagacagtt tctgacgaaa gaacaagtgc aagaattcaa aagaattttc 180
[1175]caggcttacg atgtcaacaa cgaagataaa atcccggtca aagccatcgg aatcattttg 240
[1176]agaaacatgg gattgaatcc gtccaaggcg attctcaaga gaatgacaaa ggaaatcgat 300
[1177]ccggataaaa acggttacgt ggatttcgaa atgtttttac atcccatggc acgaatgata 360
[1178]cacgaagtcc cggaaaatca cgaggacata atcgcagcat tcaaagtttt cgacgaagac 420
[1179]gacgaaggtt tcgtatccgt taaagctttg accgaatacc tcacgaacct gggcgaagat 480
[1180]ttggaagatt tcgaaattga taatttgatt aaaatggcgg atcccaaagg cacgggccga 540
[1181]gtctactacg aaggattcgt cgagaaaatt ttcggaatcg taagaaacgg gaaaaaaaag 600
[1182]aaaaatctca aagggaaaaa gggaaaaaaa cgaaaaaaaa atgaatga 648
[1186]<213> Pediculus humanus
[1188]ucaaauagau cugagacagu uucugacgaa agaacaagug caagaauuca aaagaauuuu 60
[1189]ccaggcuuac gaugucaaca acgaagauaa aaucccgguc aaagccaucg gaaucauuuu 120
[1190]gagaaacaug ggauugaauc cguccaaggc gauucucaag agaaugacaa aggaaaucga 180
[1191]uccggauaaa aacgguuacg uggauuucga aauguuuuua caucccaugg cacgaaugau 240
[1192]acacgaaguc ccggaaaauc acgaggacau aaucgcagca uucaaaguuu ucgacgaaga 300
[1193]cgacgaaggu uucguauccg uuaaagcuuu gaccgaauac cucacgaacc ugggcgaaga 360
[1194]uuuggaagau uucgaaauug auaauuugau uaaaauggcg gaucccaaag gcacgggccg 420
[1195]agucuacuac gaaggauucg ucgagaaaau u 451
[1199]<213> Varroa destructor
[1201]guuuagccca uuuucgcgcu gugucugucg gcgacugcgg aaguacugag cuagcugagu 60
[1202]cguggugcuu agaaggcagu ggcagugagu ggcaucagcg guaauaagug agggacaaca 120
[1203]gccggagagu cgugucgguu gguaggucgg uucguugccg auuaaugccc cacaugugag 180
[1204]uuacgugcgg ugcuuguucc gcugugcauu ggacguuaca uacagagagu cagguguagu 240
[1205]uuauuuuaga cgaaaaacua ccagcacuac cugauacagc gacccaacgu agagagggaa 300
[1206]agagaaagag cuguuguuuc gcuagguuag uucugaacaa uuggauugau ucgcaaaugu 360
[1207]acgcuuguac ggcuaacggu ugaacggacu gugcaaacug cggauagugc gugaacuagc 420
[1208]agacaacaua uccaauaacu aacuacacgg uuauuauuga uacaaacacc uaguucagac 480
[1209]agacaauuuc gguuugcuuu guuggcacua uaaggaguaa gugauauugu uuuuuguuua 540
[1210]ucagucggcc uaguauuguc ggugcacuua cggauaacag gagaggcagu acaaaggcaa 600
[1211]cucgauucac uaucguucac gggcgcuaau acagcgaaau auuaauaggc aaagcaagca 660
[1212]agccagccgg ccaagcccaa accccgggcg aaacgcagau accaacagcg cugaagugcg 720
[1213]uggcaaacga caacgggaca guagggcaua agcuagacag cauauagcuu uucuaaccau 780
[1214]ggcugaucag cuaacugagg aacagaucgc cgaguucaaa gaggcguuua gccuguuuga 840
[1215]caaggacgga gauggcacga ucacgacaaa ggagcucggu acgguaaugc gaucucucgg 900
[1216]ccagaacccc acugaggcug aacugcagga caugaucaac gaggucgacg ccgacggcuc 960
[1217]cggaacgaua gauuucccug aguuccucac aaugauggca agaaagauga aggacaccga 1020
[1218]cucggaggag gagauccgag aggcguuccg cguauucgac aaggauggca acgguuucau 1080
[1219]uucggcggcc gagcucaggc acguuaugac caaccuuggc gagaagcuua cggacgagga 1140
[1220]gguagaugag augauucggg aggcagauau ugacggugau ggucagguca acuacgagga 1200
[1221]guucgucacc augaugacgu ccaaguaaau auaugauaau guuggcuguc ucguguaaug 1260
[1222]ucgugagaaa gaaagcgcgc gcgaaagaaa gagagaaagg aauagaaaac uauaaauagc 1320
[1223]uuguuguuaa agcaacgcaa caacaagcug uaagcaacaa acaauauuua cgaaguauac 1380
[1224]gauaaugaaa gucgacaggg aagcaagcac ggauauauau gaaaacuaag cgaaaugacg 1440
[1225]ucgucaucau caccagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc accaccacca 1500
[1226]ccaccaucac gaccaccacc accaccacca ccaucacgac caccac 1546
[1230]<213> Varroa destructor
[1232]guucggcucg gggacuagcu gaucggucgg uguguauugu uggcuauugg caaagaccgu 60
[1233]uguugagugg gcucgcugca cugagcguuu aaaucuggug aaaucguugg caauggcgga 120
[1234]ucagcugacc gaggagcaaa ucgccgaauu caaggaggcu uucagccugu ucgauaaaga 180
[1235]cggugauggc acaauuacga ccaaggaacu agggaccguc augcgguccc ucggccagaa 240
[1236]cccuacugag gcugagcuuc aagacaugau caacgagguc gacgcugacg guaacggcac 300
[1237]uauugacuuu ccagaguuuc ucacgaugau ggcgcguaaa augaaggaca ccgacuccga 360
[1238]ggaggagauc cgggaagcuu uuaggguuuu ugauaaagac ggaaauggcu ucauuucggc 420
[1239]ugcagagcug aggcacguaa ugaccaaccu uggcgaaaag cucacggacg aggaagugga 480
[1240]cgagaugauc cgcgaggcgg auaucgacgg cgacggacag gucaacuacg aggaguucgu 540
[1241]cacgaugaug acaucaaaau gaagggcuca cuauugcgcg ggaaaagcag cccaacaaag 600
[1242]aaaccuagag ugcgaaagcg agaacguuaa acacgaugau augcuaauga uaauacauac 660
[1243]gacuagagga cagaaagaca gacagacaga cugagcagac gaacgggcaa guugaagaaa 720
[1244]agccgaguug aacuggcuaa ccguugggua cucauucaua uucgauaguu acagacaaca 780
[1245]acaugaaaaa cgacagcaac aauccgcaac aaacacacgg agauugcaca caaugagggu 840
[1246]aaacugaaca uggugcagcg gaaguuggau ggcagcggua cacagugcug cuacugcugc 900
[1247]ugcugcaaau gcuaacacuc aauaaugaua auaauaauua uaauuauaga aauaugauua 960
[1248]uguuguccaa aagagaaaca aacaacacaa acaaagcuau uaaaaaucug aauaaaagcu 1020
[1249]aagaagaaau caaguagcag ucgacauggg gaguggcaaa cgauaagagu ccacagaaaa 1080
[1250]cugaagcggc cgaaagaaaa cacgaggcaa aaggcaaugu auucauuaag acgagg 1136
[1254]<213> Искусственная последовательность
[1256]<223> Синтетическая последовательность
[1258]guuuagccca uuuucgcgcu gugucugucg gcgacugcgg aaguacugag cuagcugagu 60
[1259]cguggugcuu agaaggcagu ggcagugagu ggcaucagcg guaauaagug agggacaaca 120
[1260]gccggagagu cgugucgguu gguaggucgg 150
[1264]<213> Искусственная последовательность
[1266]<223> Синтетическая последовательность
[1268]uucguugccg auuaaugccc cacaugugag uuacgugcgg ugcuuguucc gcugugcauu 60
[1269]ggacguuaca uacagagagu cagguguagu uuauuuuaga cgaaaaacua ccagcacuac 120
[1270]cugauacagc gacccaacgu agagagggaa 150
[1274]<213> Искусственная последовательность
[1276]<223> Синтетическая последовательность
[1278]agagaaagag cuguuguuuc gcuagguuag uucugaacaa uuggauugau ucgcaaaugu 60
[1279]acgcuuguac ggcuaacggu ugaacggacu gugcaaacug cggauagugc gugaacuagc 120
[1280]agacaacaua uccaauaacu aacuacacgg 150
[1284]<213> Искусственная последовательность
[1286]<223> Синтетическая последовательность
[1288]uuauuauuga uacaaacacc uaguucagac agacaauuuc gguuugcuuu guuggcacua 60
[1289]uaaggaguaa gugauauugu uuuuuguuua ucagucggcc uaguauuguc ggugcacuua 120
[1290]cggauaacag gagaggcagu acaaaggcaa 150
[1294]<213> Искусственная последовательность
[1296]<223> Синтетическая последовательность
[1298]cucgauucac uaucguucac gggcgcuaau acagcgaaau auuaauaggc aaagcaagca 60
[1299]agccagccgg ccaagcccaa accccgggcg aaacgcagau accaacagcg cugaagugcg 120
[1300]uggcaaacga caacgggaca guagggcaua 150
[1304]<213> Искусственная последовательность
[1306]<223> Синтетическая последовательность
[1308]agcuagacag cauauagcuu uucuaaccau ggcugaucag cuaacugagg aacagaucgc 60
[1309]cgaguucaaa gaggcguuua gccuguuuga caaggacgga gauggcacga ucacgacaaa 120
[1310]ggagcucggu acgguaaugc gaucucucgg 150
[1314]<213> Искусственная последовательность
[1316]<223> Синтетическая последовательность
[1318]ccagaacccc acugaggcug aacugcagga caugaucaac gaggucgacg ccgacggcuc 60
[1319]cggaacgaua gauuucccug aguuccucac aaugauggca agaaagauga aggacaccga 120
[1320]cucggaggag gagauccgag aggcguuccg 150
[1324]<213> Искусственная последовательность
[1326]<223> Синтетическая последовательность
[1328]cguauucgac aaggauggca acgguuucau uucggcggcc gagcucaggc acguuaugac 60
[1329]caaccuuggc gagaagcuua cggacgagga gguagaugag augauucggg aggcagauau 120
[1330]ugacggugau ggucagguca acuacgagga 150
[1334]<213> Искусственная последовательность
[1336]<223> Синтетическая последовательность
[1338]guucgucacc augaugacgu ccaaguaaau auaugauaau guuggcuguc ucguguaaug 60
[1339]ucgugagaaa gaaagcgcgc gcgaaagaaa gagagaaagg aauagaaaac uauaaauagc 120
[1340]uuguuguuaa agcaacgcaa caacaagcug 150
[1344]<213> Искусственная последовательность
[1346]<223> Синтетическая последовательность
[1348]uaagcaacaa acaauauuua cgaaguauac gauaaugaaa gucgacaggg aagcaagcac 60
[1349]ggauauauau gaaaacuaag cgaaaugacg ucgucaucau caccagcagc agcagcagca 120
[1350]gcagcagcag cagcagcagc accaccacca 150
[1354]<213> Искусственная последовательность
[1356]<223> Синтетическая последовательность
[1358]guucggcucg gggacuagcu gaucggucgg uguguauugu uggcuauugg caaagaccgu 60
[1359]uguugagugg gcucgcugca cugagcguuu aaaucuggug aaaucguugg caauggcgga 120
[1360]ucagcugacc gaggagcaaa ucgccgaauu 150
[1364]<213> Искусственная последовательность
[1366]<223> Синтетическая последовательность
[1368]caaggaggcu uucagccugu ucgauaaaga cggugauggc acaauuacga ccaaggaacu 60
[1369]agggaccguc augcgguccc ucggccagaa cccuacugag gcugagcuuc aagacaugau 120
[1370]caacgagguc gacgcugacg guaacggcac 150
[1374]<213> Искусственная последовательность
[1376]<223> Синтетическая последовательность
[1378]uauugacuuu ccagaguuuc ucacgaugau ggcgcguaaa augaaggaca ccgacuccga 60
[1379]ggaggagauc cgggaagcuu uuaggguuuu ugauaaagac ggaaauggcu ucauuucggc 120
[1380]ugcagagcug aggcacguaa ugaccaaccu 150
[1384]<213> Искусственная последовательность
[1386]<223> Синтетическая последовательность
[1388]uggcgaaaag cucacggacg aggaagugga cgagaugauc cgcgaggcgg auaucgacgg 60
[1389]cgacggacag gucaacuacg aggaguucgu cacgaugaug acaucaaaau gaagggcuca 120
[1390]cuauugcgcg ggaaaagcag cccaacaaag 150
[1394]<213> Искусственная последовательность
[1396]<223> Синтетическая последовательность
[1398]aaaccuagag ugcgaaagcg agaacguuaa acacgaugau augcuaauga uaauacauac 60
[1399]gacuagagga cagaaagaca gacagacaga cugagcagac gaacgggcaa guugaagaaa 120
[1400]agccgaguug aacuggcuaa ccguugggua 150
[1404]<213> Искусственная последовательность
[1406]<223> Синтетическая последовательность
[1408]cucauucaua uucgauaguu acagacaaca acaugaaaaa cgacagcaac aauccgcaac 60
[1409]aaacacacgg agauugcaca caaugagggu aaacugaaca uggugcagcg gaaguuggau 120
[1410]ggcagcggua cacagugcug cuacugcugc 150
[1414]<213> Искусственная последовательность
[1416]<223> Синтетическая последовательность
[1418]ugcugcaaau gcuaacacuc aauaaugaua auaauaauua uaauuauaga aauaugauua 60
[1419]uguuguccaa aagagaaaca aacaacacaa acaaagcuau uaaaaaucug aauaaaagcu 120
[1420]aagaagaaau caaguagcag ucgacauggg 150
[1424]<213> Искусственная последовательность
[1426]<223> Синтетическая последовательность
[1428]ggcaacgguu ucauuucggc ggccgagcuc aggcacguua ugaccaaccu uggcgagaag 60
[1429]cuuacggacg aggagguaga ugagaugauu cgggaggcag auauugacgg ugauggucag 120
[1430]gucaacuacg aggaguucgu caccaugaug acgucc 156
[1434]<213> Искусственная последовательность
[1436]<223> Синтетическая последовательность
[1438]ggcggaucag cugaccgagg agcaaaucgc cgaauucaag gaggcuuuca gccuguucga 60
[1439]uaaagacggu gauggcacaa uuacgaccaa ggaacuaggg accgucaugc ggucccucgg 120
[1440]ccagaacccu acugaggcug agcuucaaga caugaucaac gaggucgacg cugacgguaa 180
[1441]cggcacuauu gacuuuccag aguuucucac gaugauggcg cguaaaauga aggacaccga 240
[1442]cuccgaggag gagaucc 257
[1446]<213> Искусственная последовательность
[1448]<223> Синтетическая последовательность
[1450]ggaacagauc gccgaguuca aagaggcguu uagccuguuu gacaaggacg gagauggcac 60
[1451]gaucacgaca aaggagcucg guacgguaau gcgaucucuc ggccagaacc cacugaggcu 120
[1452]gaacugcagg acaugaucaa cgaggucgac gccgacggcu ccggaacgau agauuucccu 180
[1453]gaguuccuca caaugaugca agaaagauga aggacaccga cucggaggag gagaucgaga 240
[1454]ggcguuccgc guauucgaca aggaugcaac gguuucauuu cggcggccga gcucaggcac 300
[1455]guuaugacca accuuggcga gaagcuuacg gacgaggagg uagaugagau gauucgggag 360
[1456]gcagauauug acggugaugg ucaggucaac uacgaggagu ucgucaccau gaugacgucc 420
[1460]<213> Искусственная последовательность
[1462]<223> Синтетическая последовательность
[1464]ggaacagauc gccgaguuca aagaggcguu uagccuguuu gacaaggacg gagauggcac 60
[1465]gaucacgaca aaggagcucg guacgguaau gcgaucucuc ggccagaacc cacugaggcu 120
[1466]gaacugcagg acaugaucaa cgaggucgac gccgacggcu ccggaacgau agauuucccu 180
[1467]gaguuccuca caaugaugca agaaagauga aggacaccga cucggaggag gagaucgaga 240
[1468]ggcguuccgc guauucgaca aggaugcaac gguuucauuu cggcggccga gcucaggcac 300
[1469]guuaugacca accuuggcga gaagcuuacg gacgaggagg uagaugagau gauucgggag 360
[1474]<213> Искусственная последовательность
[1476]<223> Синтетическая последовательность
[1478]ggcggaucag cugaccgagg agcaaaucgc cgaauucaag gaggcuuuca gccuguucga 60
[1479]uaaagacggu gauggcacaa uuacgaccaa ggaacuaggg accgucaugc ggucccucgg 120
[1480]ccagaacccu acugaggcug agcuucaaga caugaucaac gaggucgacg cugacgguaa 180
[1481]cggcacuauu gacuuuccag aguuucucac gaugauggcg cguaaaauga aggacaccga 240
[1482]cuccgaggag ggauccggga agcuuuuagg guuuuugaua aagacggaaa uggcuucauu 300
[1483]ucggcugcag agcugaggca cguaaugacc aaccuuggcg aaaagcucac ggacgaggaa 360
[1484]guggacgaga ugauccgcga ggcggauauc gacggcgacg gacaggucaa cuacgaggag 420
[1485]uucgucacga ugaugacauc aaaaugaagg gcucacuauu gcgcgggaaa agcagcc 477
[1489]<213> Искусственная последовательность
[1491]<223> Синтетическая последовательность
[1493]ggagatcgcc gagttcaaag aggcgtttag cctgtttgac aaggacggag atggcacgat 60
[1494]cacgacaaag gagctcggta cggtaatgcg atctctcggc cagaacccca ctgaggctga 120
[1495]actgcaggac atgatcaacg aggtcgacgc cgacggctcc ggaacgatag atttccctga 180
[1496]gttcctcaca atgatggcaa gaaagatgaa ggacaccgac tcggaggagg agatccgaga 240
[1497]ggcgttccgc gtattcgaca aggatggcaa cggtttcatt tcggcggccg agctcaggca 300
[1498]cgttatgacc aaccttggcg agaagcttac ggacgaggag gtagatgaga tgattcggga 360
[1503]<213> Искусственная последовательность
[1505]<223> Синтетическая последовательность
[1507]ggaacagauc gccgaguuca aagaggcguu uagccuguuu gacaaggacg gagauggcac 60
[1508]gaucacgaca aaggagcucg guacgguaau gcgaucucuc ggccagaacc ccacugaggc 120
[1509]ugaacugcag gacaugauca acgaggucga cgccgacggc uccggaacga uagauuuccc 180
[1510]ugaguuccuc acaaugaugg caagaaagau gaaggacacc gacucggagg aggagauccg 240
[1511]agaggcguuc cgcguauucg acaaggaugg caacgguuuc auuucggcgg ccgagcucag 300
[1512]gcacguuaug accaaccuug gcgagaagcu uacggacgag gagguagaug agaugauucg 360
[1513]ggaggcagau auugac 376
