[1]Изобретение относится к технологии получения фармацевтической субстанции низкомолекулярного гепарина (НМГ), такого как надропарин кальция, и может быть использовано для производства лекарственных препаратов на его основе.
[2]Гепарин представляет собой антикоагулянт прямого действия, который синтезируется тучными клетками, являющимися разновидностью клеточных элементов соединительной ткани. В связи с этим важнейшим источником для получения гепарина в фармакологических и медицинских целях является ткань легких и печени животных методом протеолиза или деполимеризации с последующей очисткой гепарина-сырца.
[3]Гепарин является линейным гетерополисахаридом, построенным из чередующихся остатков a-D-глюкопиранозилуроновой (глюкуроновой) кислоты и 2-сульфамино-2-дезокси-а-D-глюкопиранозы (сульфатированного N-ацетилглюкозамина), связанных а-1,4-гликозидными связями. Кроме сульфатных групп гепарин содержит и сульфоэфирные группы (при С6 остатков сульфо-N-глюкозамина и, частично, при С2 глюкуроновой кислоты).
[4]Для медицинских целей получают два типа гепарина: высокомолекулярный (ВМГ) и низкомолекулярный (НМГ) гепарины.
[5]В настоящее время широкое применение получили препараты низкомолекулярного гепарина (НМГ), которые имеют достаточно высокую активность по фактору антикоагулянтной активности анти-Ха и низкую по анти-IIa активности (1).
[6]В частности, используются препараты на основе субстанций дальтепарина, тинзапарина и эноксапарина натрия, надропарина, которые отличаются высокой антикоагуляционной активностью и имеют наиболее широкий спектр показаний.
[7]Примером получения эноксипарина натрия является способ получения низкомолекулярного гепарина, включающий стадии получения бензетониевой соли гепарина, бензилирования этой соли в неводном растворителе, спиртового осаждения неполного бензилового эфира бензетониевой соли гепарина и щелочной деполимеризации этого продукта, при котором бензетониевую соль нефракционированного гепарина получают в 0,05-0,5 M водном растворе натрия хлорида при температуре 50-60°С, рН=8,2-8,8 и массовом соотношении гепарин/бензетоний хлорид 1/(2,35-2,70), бензилирование бензетониевой соли гепарина проводят в течение 2-3 часов в среде биполярного апротонного растворителя бензилхлоридом в соотношении гепаринат/бензилхлорид 1/(0,2-1,0), который предварительно подвергают активированию в апротонном растворителе в течение 15-20 мин, осаждение бензилового эфира гепарина проводят методом Спиро этиловым спиртом, предварительно насыщенным безводным натрия ацетатом, с последующим снятием защиты с сульфогрупп, проведение β-элиминирования бензилового эфира со степенью этерификации гепарина 9-13% 1±0,5 N щелочью NaOH при температуре 55±5°С, длительности процесса 40-60 мин и массовым соотношением реагентов бензиловый эфир/щелочь 1/(0,5-2) (2).
[8]Данный способ иллюстрирует общие черты получения фракций НМГ, а именно процесс деполимеризации ВМГ с последующим осаждением и фильтрацией. В результате получаются полидисперсные фрагменты полимерных макромолекул исходного гепарина более низкой молекулярной массы, в среднем 2000-10000 Да, при этом они отличаются молекулярной массой и молекулярно-массовым распределением, строением концевых групп, активностью относительно минорных факторов свертывания крови и их соотношением.
[9]Одним из таких препаратов на основе НМГ является надропарин кальция.
[10]Используемый в качестве лекарственного препарата надропарин представляет собой кальциевую соль деполимеризованного гепарина с молекулярной массой от 4000 до 5000 Да.
[11]Он обладает прямым антикоагуляционным действием, анти-Ха и анти-IIa активностью, непосредственно влияет на находящиеся в крови факторы свертывания. Усиливает блокирующий эффект антитромбина III на фактор Ха (активирует переход протромбина в тромбин). Анти-Ха активность приблизительно в 4 раза превосходит анти-IIa активность. Обладает противовоспалительными и иммуносупрессивными (подавляет кооперативное взаимодействие Т- и В-клеток) свойствами, незначительно понижает уровень холестерина и бета-липопротеидов в сыворотке крови. Улучшает коронарный кровоток.
[12]Применяется при тромбозах глубоких вен, тромбоэмболии легочной артерии, остром коронарном синдроме, профилактике тромбозов у больных с высоким риском: а) при ортопедических, онкологических и общехирургических операциях, б) при гемодиализе и гемофильтрации у больных с хронической почечной недостаточностью.
[13]Вводят в подкожную клетчатку живота (игла располагается перпендикулярно кожной складке).
[14]Известно несколько способов получения надропарина кальция.
[15]Так, известен способ, включающий деполимеризацию гепарина с получением НМГ. Далее проводят процесс очистки, в котором выполняется устранение нитрозных групп путем нагревания водного раствора, содержащего низкомолекулярный гепарин при рН, составляющем от 3,0 до 13,0 при температуре, составляющей от 40°С и 90°С; в течение времени от 15 минут до 180 минут, или путем обработки водного раствора, содержащего низкомолекулярный гепарин излучением с помощью микроволн с частотой, находящейся между 900 и 2450 МГц при мощности 600-1000 Вт, в течение периода времени между 30 и 300 секунд (3).
[16]Также известен способ получения гепарина низкомолекулярной массы нитрозной деполимеризацией гепарина природного происхождения, при котором водный раствор натриевой соли гепарина природного происхождения концентрацией 5-15 мас./об. % обрабатывают раствором нитрита щелочного металла из расчета 1,5-6,9 мас. % нитрита по отношению к взятой соли гепарина в присутствии соляной кислоты при рН 1-5 в течение 20-50 мин, при этом реакцию проводят до появления отрицательного теста на нитроионы, полученный продукт восстанавливают добавлением боргидрида натрия в количестве 0,5-2,0 мас. % от количества взятой соли гепарина, избыток которого разрушают соляной кислотой, полученную реакционную среду нейтрализуют и осаждают из нее этанолом гепарин низкомолекулярной массы в виде натриевой соли, водный раствор которой обрабатывают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 180 до 350 нм при температуре 5-50°С и при рН 3-8 с получением гепарина низкомолекулярной массы, содержащего нитрозосоединения в количестве, менее или равном 5⋅10-7 мг на мг продукта, или при рН 7 с направлением обработанного раствора на анионообменную колонку, которую промывают водой при рН приблизительно 7, и рекуперируют конечный продукт осаждением хлористым натрием и этанолом с получением гепарина низкомолекулярной массы, содержащего нитрозосоединения в количестве, менее или равном 5⋅10-8 мг на мг продукта (4).
[17]Наиболее близким аналогом предлагаемого нами способа является способ получения надропарина кальция, гепарин растворяют в воде, добавляют нитрит натрия и доводят рН раствора до 2-3 путем обработки соляной кислотой, выдерживают раствор до исчезновения нитрита и затем доводят рН раствора, до 9-11 путем добавления гидроксида натрия, после чего в раствор вводят борогидрид натрия, реакционную смесь перемешивают несколько часов, избыток борогидрида натрия разрушают соляной кислотой, а полученную реакционную среду нейтрализуют, после чего осуществляют осаждение, для чего добавляют этанол и выдерживают несколько часов, отделяют, выделившийся продукт центрифугированием, к супернатанту добавляют спирт, перемешивают несколько часов, получившийся первый продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат, после чего осадок опять растворяют в воде, добавляют нитрит натрия и доводят рН раствора до 2-3 путем обработки соляной кислотой, выдерживают раствор до исчезновения нитрита и затем доводят рН раствора до 9-11 путем добавления гидроксида натрия, после чего в раствор вводят борогидрид натрия, реакционную смесь перемешивают несколько часов, избыток борогидрида натрия разрушают соляной кислотой, а полученную реакционную среду нейтрализуют, после чего осуществляют осаждение для чего добавляют этанол и выдерживают несколько часов, отделяют выделившийся продукт центрифугированием, к супернатанту добавляют спирт, перемешивают несколько часов, получившийся второй продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат, затем первый и второй сухой продукт растворяют в воде, пропускают через сильнокислый катионит, эллюат доводят раствором гидроксида кальция до рН 6,6-7,2, фильтруют и сушат методом сублимационной сушки (лиофилизация) или с применением вакуумных сушильных шкафов (5).
[18]Однако общим недостатком данных способов получения является то, что проведение процессов в таких условиях сопровождается избыточной деполимеризацией, и в результате наблюдается повышенное содержание низкомолекулярной фракции (меньше 2000 Да). Это приводит к снижению выхода целевого продукта и дополнительным затратам на его изготовление.
[19]Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка такого способа получения надропарина, который бы позволил увеличить целевой выход продукта за счет снижения доли низкомолекулярной фракции.
[20]Способ заключается в следующем:
[21]Гепарин натрия растворяют в воде, охлаждают реакционную массу до температуры 15°С, доводят рН раствора до 2,3-2,5 концентрированной соляной кислотой и в один прием добавляют нитрит натрия, реакционную массу перемешивают 60-90 минут, по окончании перемешивания доводят значение рН реакционной массы до 10 путем добавления водного раствора гидроксида натрия, после чего в раствор добавляют борогидрид натрия и перемешивают реакционную массу в течение 2 часов, по окончании перемешивания доводят рН реакционной массы до 3,9-4,0 при помощи концентрированной соляной кислоты и перемешивают еще 20 минут, после чего реакционную массу нейтрализуют до рН 7,0 водным раствором гидроксида натрия, затем к раствору добавляют этиловый спирт, перемешивают 10 минут и оставляют на 300 мин до осаждения масла, раствор декантируют, оставшееся масло (не закристаллизовавшееся вещество) перемешивают в этиловом спирте, осадок отфильтровывают и сушат на воздухе до постоянной массы, получают надропарин натрия,
[22]затем проводят переосаждение надропарина натрия, для этого высушенный осадок растворяют в воде, добавляют хлорид натрия и доводят рН раствора, до 4 концентрированной соляной кислотой, добавляют этанол, соотношение спирта к высаживаемому веществу составляет 35:1, перемешивают и оставляют до осаждения масла на 2 часа, полученный раствор декантируют, осадок затирают в этаноле, фильтруют, сушат при комнатной температуре до постоянной массы,
[23]затем к полученному на предыдущем этапе надропарину натрия приливают воду, добавляют сильнокислый катионит в кальциевой форме, выдерживают 2 часа, затем раствор фильтруют, смолу промывают водой, раствор доводят до рН=6.8-7.0 раствором гидроксида кальция и подвергают сушке путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 34°С при остаточном вакууме 20 мм рт. ст. Получают надропарин кальция.
[24]В частном случае в качестве катеонита используют ионообменную смолу КУ-2-80 Na, которую помещают в 2% раствор серной кислоты, перемешивают 1 час и декантируют раствор со смолы, повторяют эту процедуру 2 раза, затем промывают смолу дистиллированной водой, помещают в раствор хлористого кальция и перемешивают 1 час, повторяют эту процедуру 2 раза, затем промывают смолу дистиллированной водой и получают сильнокислый катионит в кальциевой форме.
[25]На следующем этапе проводят дробное переосаждение кальциевой соли надропарина кальция. Для этого надропарин кальция, полученный на предыдущей стадии, растворяют в воде. К полученному раствору медленно приливают этиловый спирт, контролируя температуру (20±1°С). По окончании дозирования реакционную массу разливают во флаконы и центрифугируют на скорости 3500 об/мин в течение 30 минут. После центрифугирования декантируют раствор с выпавшего масла и упаривают его при помощи роторно-пленочного испарителя (РПИ) при температуре бани 34°С и остаточном давлении 20 мм рт.ст. до образования порошка. Далее данный порошок Дополнительно сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С течение 72 часов. Получают надропарин кальция.
[26]Преимуществами способа (техническими результатами) является то, что:
[27]- предлагаемый способ относится к расширению арсенала возможностей получения, надропарина кальция высокого качества.
[28]- предлагаемый способ позволяет получать надропарин натрия с максимальным количеством фракций, требуемых для синтеза надропарина кальция.
[29]- проведение повторного переосаждения надропарина кальция позволяет уменьшить содержащиеся в промежуточном продукте низкомолекулярные фракции.
[30]- использование сильнокислого катионита в кальциевой форме для получения кальциевой соли надропарина позволяет провести реакцию с высоким выходом конечного продукта.
[31]- сушка надропарина кальция путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 30°С и с применением остаточного вакуума снижает затраты на данный процесс по сравнению с использованием дорогостоящей лиофильной сушки.
[32]- стадия дробного переосаждения кальциевой соли проводится с целью отделения высокомолекулярных фракций.
[33]Краткое описание поясняющих материалов
[34]Фиг. 1 - массово-молекулярное распределение фракций в полученном препарате надропарина кальция.
[35]Изобретение поясняется следующими примерами его осуществления
[36]Пример 1. Получение надропарина кальция
[37]1) Получение надропарина натрия 8 г гепарина натрия растворяли в 36 мл воды, охлаждали реакционную массу до температуры 15°С, доводили рН раствора до 2,3 10% раствором соляной кислоты и немедленно, в один прием, добавляли 0,280 г нитрита натрия. Реакционную массу перемешивали строго 90 минут. По окончании перемешивания доводили значение рН реакционной массы до 10 с помощью 0,2 М раствора гидроксида натрия в воде. Затем добавляли 0,08 г боргидрида натрия и перемешивали реакционную массу в течение 2 часов. По окончании перемешивания доводили рН реакционной массы до значения 3,9 при помощи 10%-ного раствора соляной кислоты и перемешивали 20 минут, после чего нейтрализовали реакционную массу до рН 7,0 0,2М водным раствором гидроксида натрия. На протяжении всех этих проделанных манипуляций, температура реакционной смеси составляла 15°С. Затем к раствору добавляли 380 мл этилового спирта (с содержанием этанола около 95,5%), перемешивали 10 минут и оставляли до осаждения масла (около 300 мин). Раствор декантировали, а оставшееся масло затирали в 200 мл этилового спирта. Осадок отфильтровывали и сушили на воздухе до постоянной массы, получали 7,99 г надропарина натрия.
[38]2) Переосаждение натриевой соли надропарина 7,99 г натриевой соли надропарина, полученного на предыдущей стадии, растворили в 142 мл воды. К полученному раствору добавили 1.6 г хлорида натрия, довели значение рН раствора до 4 концентрированной соляной кислотой. Общий объем раствора довели водой до 160 мл. Контролируя скорость (не более 3 мл/минуту), прилили 190 мл этанола, перемешали и оставили на 2 часа. Декантировали раствор выпавшего масла, а к оставшемуся раствору прилили 300 мл спирта, затерли в этаноле до образования твердого осадка, отфильтровали, сушили при комнатной температуре до постоянной массы. Получили 5,41 грамм образца.
[39]3) Синтез надропарина кальция
[40]а) Приготовление смолы КУ-2-80 (Са)
[41]250 мл смолы КУ-2-80 (Na) поместили в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного 2%-ного раствора серной кислоты, перемешивали 1 час и декантировали раствор со смолы. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Смолу перенесли в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного раствора хлористого кальция (100 г CaCl2 в 1 литре воды) и перемешивали 1 час. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Перенесли в стакан и хранили до использования под слоем дистиллированной воды.
[42]б) Синтез надропарина кальция
[43]К 5,41 г переосажденной натриевой соли надропарина приливали 53 мл воды, перемешивали до полного растворения соли, прибавляли 53 мл смолы КУ-2-80 (Са), нагруженной ионами кальция, и выдерживали при перемешивании 2 часа. Далее раствор фильтровали от смолы, смолу промывали три раза по 50 мл воды. Маточный раствор подщелачивали до рН=6,8 0,1 M раствором гидроксида кальция, и подвергали сушке путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 34°С. Получили 5,22 г надропарина кальция.
[44]в) Дробное переосаждение кальциевой соли надропарина
[45]5,22 г надропарина кальция, полученного на предыдущей стадии, растворили в 218 мл воды. К полученному раствору медленно приливали 197 мл этилового спирта, контролируя температуру (20±1°С). По окончании дозирования реакционную массу разлили во флаконы и центрифугировали на скорости 3500 об/мин в течение 30 минут. После центрифугирования декантировали раствор с выпавшего масла и упаривали его при помощи роторно-пленочного испарителя (РПИ) при температуре бани 34°С и остаточном давлении 20 мм рт.ст. до образования порошка. Далее данный порошок дополнительно сушили в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С течение 72 часов.
[46]Получили 3,625 г надропарина кальция.
[48]1 ) Получение надропарина натрия
[49]8 г гепарина натрия растворяли в 72 мл воды, охлаждали реакционную массу до температуры 15°С, доводили рН раствора до 2,5 10%-ным раствором соляной кислоты и немедленно, в один прием, добавляли 0,280 г нитрита натрия. Реакционную массу перемешивали 60 минут. По окончании перемешивания доводили значение рН реакционной массы до 10 с помощью 0,2 М раствора гидроксида натрия в воде. Затем добавляли 0,08 г боргидрида натрия и перемешивали реакционную массу в течение 2 часов. По окончании перемешивания доводили рН реакционной массы до значения 4,0 при помощи 10% раствора соляной кислоты и перемешивали 20 минут, после чего нейтрализовали реакционную массу до рН 7,0 0,2 M раствором гидроксида натрия. На протяжении всех этих проделанных манипуляций, температура реакционной смеси составляла 15°С. Затем к раствору добавляли 380 мл этилового спирта, перемешивали 10 минут и оставляли до осаждения масла (около 300 мин). Раствор декантировали, а оставшееся масло затирали в 200 мл этилового спирта. Осадок отфильтровывали и сушили на воздухе до постоянной массы, получали 7,9990 г надропарина натрия.
[50]2) Переосаждение натриевой соли надропарина
[51]7,9990 т натриевой соли надропарина, полученного на предыдущей стадии, растворили в 27 мл воды. К полученному раствору добавили 0,3 г хлорида натрия, довели значение рН раствора до 4 концентрированной соляной кислотой. Общий объем раствора довели водой до 30 мл. Добавили 30 мл этанола, перемешали и оставили на 2 часа. Полученный осадок декантировали, затерли в этаноле, отфильтровали, сушили при комнатной температуре до постоянной массы. Получили 5,4070 г образца.
[52]3) Синтез надропарина кальция
[53]а) Приготовление смолы КУ-2-80 (Са)
[54]250 мл смолы КУ-2-80 (Na) поместили в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного 2% раствора серной кислоты, перемешивали 1 час и декантировали раствор со смолы. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Смолу перенесли в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного раствора хлористого кальция (100 г CaCl2 в 1 литре воды) и перемешивали 1 час. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Перенесли в стакан и хранили до использования под слоем дистиллированной воды.
[55]б) Синтез надропарина кальция
[56]К 5,4070 г переосажденной натриевой соли надропарина приливали 5 мл воды, перемешивали до полного растворения соли, прибавляли 5 мл смолы КУ-2-80 (Са), нагруженной ионами кальция, и выдерживали при перемешивании 2 часа. Далее раствор фильтровали от смолы, смолу промывали 25 мл воды. Маточный раствор подщелачивали до рН=7,0 ОДМ водным раствором гидроксида кальция и подвергали сушке путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 34°С и остаточном вакууме 20 мм рт.ст. Получили 5,22 г надропарина кальция.
[57]в) Дробное переосаждение кальциевой соли надропарина
[58]5.22 г надропарина кальция, полученного на предыдущей стадии, растворили в 218 мл воды. К полученному раствору медленно приливали 197 мл этилового спирта, контролируя температуру (20±1°С). По окончании дозирования реакционную массу разлили во флаконы и центрифугировали на скорости 3500 об/мин в течение 30 минут. После центрифугирования Декантировали раствор с выпавшего масла, которое упаривали при помощи роторно-пленочного испарителя (РПИ) при температуре бани 34°С и остаточном давлении 20 мм рт.ст. до образования порошка. Далее данный порошок дополнительно сушили в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С течение 72 часов. Получили 3,625 г надропарина кальция.
[59]Пример 3. Сопоставление количества фракций в способе - прототипе и в заявляемом способе
[60]Проводили получение надропарина кальция по технологии, согласно способу-прототипу и в соответствии с заявляемым способом. Согласно способу-прототипу получен надропарин кальция со средней молекулярной массой 3500-5000 Да, при этом наблюдается следующее соотношение фракций:
[61]более 8000 Да - 10%, 2000-8000 Да - 75%, менее 2000 Да - 15 %.
[62]Согласно заявленному способу получен надропарин кальция со средней молекулярной массой 3600-5000 Да, при этом наблюдается следующее соотношение фракций: менее 2000 Да - 5-13%, 2000-8000 Да -87-95%, из них содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000 - от 35 до 55% (фиг. 1).
[63]Пример 4. Подтверждение подлинности надропарина кальция
[64]Подтверждение структуры молекул проводили в рамках определения показателей качества: средняя относительная молекулярная масса, молярное соотношение сульфатных и карбоксильных групп, количественное определение (определение активности анти-фактор Ха и отношения активностей анти-фактор Ха и анти-фактор IIa, а также13С ЯМР-спектроскопия.
[65]Средняя молекулярная масса составляла 3600-5000 Да,
[66]Активность анти-фактор Ха составляла 125 МЕ/мг в пересчете на сухое вещество.
[67]По данным аналитических исследований выявлено, что полученные образцы соответствуют аналогичным параметрам, заданным в фармакопее для надропарина кальция.
[69]1. В.А. Макаров и др., "Применение гепаринов в клинической практике", 1998, РМЖ, № 3, с. 4.
[70]2. Патент РФ №2512768, опубл. 10.04.2014.
[71]3. Европейский патент ЕР 1773890, опубл. 18.04.2007.
[72]4. Патент РФ №2133253, опубл. 20.07.1999.
[73]5. Патент РФ №2639574 С2, опубл. 28.11.2017.
