[1]Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.).
[2]Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (1).
[3]Трава монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.) является перспективным источником БАС, обладающим антимикробным, противовоспалительным, фунгицидным, антигельминтным, спазмолитическим, антисеборейным действием. Однако проблема стандартизации данного вида сырья остается не решенной (2).
[4]Известен способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в траве монарды дудчатой с использованием дифференциальной спектрофотометрии (3). Данная методика включает такие стадии, как трехкратную экстракцию сырья 70% этиловым спиртом, реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 390 нм и расчет содержания суммы флавоноидов на основе значений оптической плотности комплекса государственного стандартного образца рутина с алюминием хлоридом.
[5]Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются низкая специфичность, неполнота экстракции (экстрагент выбран не оптимальный), трудоемкость методики (трехкратная экстракция сырья) и невозможность определения в анализируемом сырье суммы флавоноидов в пересчете на вещество, специфическое для травы монарды дудчатой, так рутин в данных условиях спектрофотометрии имеет максимум поглощения в области 412-415 нм.
[6]Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой, обладающего более высокой специфичностью и точностью.
[7]Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой в пересчете на цинарозид.
[8]Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 60% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, количественное определение суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой проводят при длине волны 394 нм в пересчете на цинарозид; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
[9]
[10]где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
[11]Do - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;
[13]mo - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;
[14]W - потеря в массе при высушивании, %.
[15]В случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 350:
[16]
[17]где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
[19]350 - удельный показатель поглощения (
- оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
[20]W - потеря в массе при высушивании, %.
[21]При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно цинарозид определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения монарды дудчатой наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов Фигура 1, как и в случае цинарозида Фигура 2, где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой или исходный раствор цинарозида соответственно, а кривая 2 - раствор водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой в присутствии алюминия хлорида или раствор цинарозида в присутствии алюминия хлорида соответственно.
[22]Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор цинарозида, а кривая 2 - раствор цинарозида с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО цинарозида в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 394 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из травы монарды дудчатой в дифференциальном варианте на фигуре 3 так же обнаруживается при длине волны 394 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму спиртового раствора цинарозида.
[23]Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой при аналитической длине волны 394 нм.
[24]Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 представлена зависимость выхода флавоноидов травы монарды дудчатой от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 60% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
[25]Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 представлена зависимость выхода флавоноидов травы монарды дудчатой от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 60 минут.
[26]В таблице 3 представлена зависимость выхода флавоноидов травы монарды дудчатой от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
[27]Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
[28]Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 60% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50.
[29]Принимая по внимание тот факт, что специфическим для травы монарды дудчатой является цинарозид, а максимумы поглощения раствора цинарозида и водно-спиртового извлечения травы монарды дудчатой находятся в области 394 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид при длине волны 394 нм.
[30]Способ реализуется следующим образом.
[31]Аналитическую пробу сырья травы монарды дудчатой измельчают до размера частиц 1 мм. Около 1 г точная навеска измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр с красной полосой (извлечения из травы).
[32]Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор).
[33]Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).
[34]Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 394 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
[35]Приготовление раствора стандартного образца цинарозида
[36]Около 0,0025 г точная навеска цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). После чего 5 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б цинарозида). Раствор сравнения готовят следующим образом: 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
[37]Измерение оптической плотности проводят при длине волны 394 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
[38]Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
[39]
[41]D - оптическая плотность испытуемого раствора;
[42]Do - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца цинарозида;
[44]mo - масса Государственного стандартного образца цинарозида, г;
[45]W - потеря в массе при высушивании, %.
[46]В случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 350:
[47]
[49]D - оптическая плотность испытуемого раствора;
[51]350 - удельный показатель поглощения (
- оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
[52]W - потеря в массе при высушивании, %.
[53]Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
[55]Аналитическую пробу сырья монарды дудчатой измельчают до размера частиц 1 мм (заготовлено в г. Самаре, Ботанический сад, июль 2017 г.). 0,9976 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).
[56]Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).
[57]Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).
[58]Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 394 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
[59]Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.
[60]0,0026 г цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). После чего 5 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.
[61]Измерение оптической плотности проводят при длине волны 394 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.
[62]Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
[63]
[65]0,567 - оптическая плотность испытуемого раствора;
[66]0,7812 - оптическая плотность раствора стандартного образца цинарозида;
[67]0,9976 - масса сырья, г;
[68]0,0026 - масса стандартного образца цинарозида, г.
[69]5 - потеря в массе при высушивании, %.
[70]Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид = 4,27%.
[72]При необходимости определения суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой в отсутствии стандартного образца цинарозида, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца цинарозида.
[73]После измерения оптической плотности извлечения из травы монарды дудчатой при длине волны 394 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения цинарозда, равное 350:
[74]
[76]0,567 - оптическая плотность испытуемого раствора;
[77]0,9976 - масса сырья, г;
[78]350 - удельный показатель поглощения (
- оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
[79]5 - потеря в массе при высушивании, %.
[80]Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозида = 4,27%, что совпадает со значением, полученном в примере 1.
[81]Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±1,57%.
[82]Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в траве монарды дудчатой с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
[83]1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 60% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
[84]2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для травы монарды дудчатой вещество - цинарозид.
[85]3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±1,57% (в прототипе данное значение составляет ±2,14%), что свидетельствует об объективности разработанного способа и более высокой точности.
[86]Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.).
[87]
[88]
[89]
[91]1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.
[92]2. Куркин В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие. - Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.
[93]3. Саргсян Е.Э., Никитина А.С., Степанюк С.Н. Изучение флавоноидов травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.). В сборнике: Беликовские чтения материалы IV Всероссийской научно-практической конференции. 2015. - 128-129 с.
,
,
Государственного стандартного образца цинарозида при длине волны 394 нм;
