[1]Изобретение относится к медицине, а именно цитохимической лабораторной диагностике, и может быть использовано для подбора in vitro оптимального (наилучшего, наиболее благоприятного в данных условиях) криопротектора на доклиническом этапе гемотрансфузионной терапии и предупреждения постгрансфузионных осложнений криопротекторного генеза. Для осуществления способа у больного до начала криогемотрансфузионной терапии получают порцию венозной крови, делят на равные части в пробирки, в одной из которых контрольная проба (КП) крови не содержит криопротектора, в другие добавляют по одной равной дозе тестируемых криопротекторов - опытные пробы (ОП); пробирки герметизируют пробками, содержимое перемешивают на шейкере при температуре плюс 37°C в течение 4 ч, капли ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают 2-3 мазка, быстро высушивают на воздухе при комнатной температуре, фиксируют в 10% спирт - формалиновой смеси, окрашивают на гликоген по методу Шабадаша, лейкоциты микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) сегментоядерных (с/я) нейтрофилов и лимфоцитов ОП и КП по Кэплоу (1955) в модификации Астальди и Верга (1957); при равности показателей СЦК ОП и СЦК КП тестируемый криопротектор оценивают как оптимальный для конкретного больного и пригодным к использованию (ПКИ); при значениях СЦК ОП, отличных от СЦК КП, делают заключение как о непригодном к использованию криопротекторе. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике современного лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ).
[2]Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике по подбору оптимального криопротектора на доклиническом этапе гемотрансфузионной терапии и предупреждению посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза.
[4]В современной клинической медицине посттрансфузионные реакции и осложнения рассматривают как один из универсальных механизмов патогенеза различных заболеваний, характеризующихся накоплением в тканях организма избытка токсических продуктов обмена веществ или клеточного реагирования, маркерами которых служат качественные и полуколичественные характеристики определенных цитохимических ферментативных реакций в лейкоцитах крови до и после смешивания с криопротекторами. Эти процессы могут развиваться как по типу яркой многосимптомной реакции, так и скрытно развивающихся труднокупируемых в последующем посттрансфузионных осложнений (Цитохимия замороженной клетки / Обозная Э.И., Пушкарь Н.С.. Маркова О.П.. Панков Е.Я. - Киев: Наук. Думка, 1981. - 176 с.). Поэтому возникает проблема выявления ранних признаков вредного влияния токсичных криопротекторов на организм и эффективного предупреждения посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза.
[5]Известные методы биологического и биохимического исследования сыворотки крови (определение концентрации молекул средней массы, продуктов перекисного окисления липидов, билирубина и т.д.) имеют ряд недостатков:
[6]- необходимость вводить криопротектор или гемоконсервант на его основе в сосудистое русло больного, то есть производить инвазивную манипуляцию, которая может быть сопряжена с техническими трудностями, осложнениями технического характера или непереносимостью субъектом лекарственного препарата;
[7]- необходимость использования лабораторных технологий и специальной биохимической лаборатории, оснащенной сложным оборудованием и реактивами, что делает анализы не всегда доступными и дорогими как для лечебно-профилактических учреждений, так и для пациентов.
[8]Эти недостатки ограничивают количество и частоту необходимых исследований.
[9]На основании предложенных в литературе лабораторных модификаций для оценки полноценности ядерных клеток крови на этапах низкотемпературного консервирования и прогнозирования предполагаемых результатов криогемотрансфузионной терапии широко используются методы клинической и полуколичественной оценки цитохимических показателей активаторов жизненно важных клеточных ферментов в периферической крови пациентов.
[10]Известен метод цитохимического обнаружения гликогена для оценки нормальных и патологических процессов (Углеводы и углеводный обмен: Материалы Второй Всесоюз. конф. по пробл. «Химия и обмен углеводов». 24-27 янв. 1961 г. М.: Изд-во АН СССР, 1962. - С. 157-163).
[11]За прототип предлагаемого изобретения выбран способ, позволяющий выявить содержание гликогена в лейкоцитах высушенных мазков донорской крови (Архагов Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей: Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2003. - 155 с.). Основным недостатком способа - прототипа является отсутствие сравнительных исследований СЦК лейкоцитов на гликоген в мазках проб венозной крови, смешанных с 15% раствором гексаметиленбистетра-оксиэтилмочевины (15% ГМБТОЭМ). 3,3% раствором глицерола (3,3% Гл). 10% раствором диметилсульфоксида (10% ДМСО), гемоконсервантом Тромбокриодмац (ТКД) или гемоконсервантом на основе 55% раствора диметилацетамида (ДМАЦ) с 5% раствором гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) (55% ДМАЦ+5% ГЭК). со значениями СЦК КП. Вместе с тем, подбор оптимального криопротектора на этапе. предшествующем криогемотрансфузионной терапии, очень важен для больного, так как позволяет снизить риск посттрансфузионных осложнений криопротекгорного генеза.
[12]Целью изобретения является устранение отмеченного недостатка и создание такого способа, который бы позволял подобрать in vitro для конкретного больного оптимальный криопротектор на этапе, предшествующем плановой криогемотрансфузионной терапии.
[13]Раскрытие изобретения.
[14]Техническим результатом изобретения является доступность, простота подбора оптимального криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии.
[15]Технический результат в заявляемом способе подбора оптимального криопротектора по содержанию гликогена в лейкоцитах консервированной крови достигается тем, что, как и в способе-прототипе, анализ содержания гликогена в лейкоцитах осуществляют по методу Шабодаша.
[16]Новым в способе является то, что подбор оптимального криопротектора проводят путем сравнительных исследований СЦК ОП на гликоген с 15% ГМБТОЭМ, 3,3 Гл, 10% ДМСО, гемоконсервантом ТКД или комбинированным гемоконсервантом 55% ДМАЦ с 5% ГЭК со значениями СЦК КП. При этом: об оптимальности криопротектора и его пригодности к использованию судят в случаях аналогичности значений показателей СЦК ОП и СЦК КП.
[17]Необходимое оборудование:
[18]1. Предметные стекла.
[19]2. Пробирки для крови на 20 мл с винтовой герметичной пробкой.
[20]3. Световой микроскоп с проходящим светом.
[21]4. Набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению М3 России.
[22]5. Набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах.
[23]Заявляемый способ имеет основное преимущество в сравнении с прототипом - проведение подбора оптимального криопротектора путем сравнительных исследований значений СЦК ОП аутологичной крови на гликоген, смешанных с тест-дозами 15% ГМБТОЭМ, 3.3% Гл, ТКД. 10% ДМСО или 55% ДМАЦ +5% ГЭК, со значениями СЦК КП.
[24]Заявляемый способ осуществляют следующим образом. У обследуемого натощак до начала внутривенных трансфузий криоконсервированных компонентов крови (криогемотрансфузионной терапии) готовят в пробирках «линейку» из тест-доз с 15% ГМБТОЭМ, 3,3% глицерола, гемоконсервантом ТКД, 10% ДМСО или комбинированным гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК по 1,5 мл в каждой; эксфузируют 25 мл аутологичной венозной крови на стабилизирующем растворе цитрата натрия и фасуют с помощью дозаторной пипетки в 6 помеченных маркером пробирок по 4,0 мл в каждую; затем в пробирку №1 вносят 0,25 мл тест-дозы 15% ГМБТОЭМ, в пробирку №2 - 0,25 мл тест-дозы 3,3% Гл, в пробирку №3 - 0,25 мл тест-дозы ТКД, в пробирку №4 - 0,25 мл тест-дозы 10% ДМСО, в пробирку №5 - 0,25 мл тест-дозы гемоконсерванта на основе 55% ДМАЦ +5% ГЭК, в пробирку №6 с контрольной пробой крови (КП) криопротектор не вносят; компоненты в пробирках №№1-6 герметизируют пробками, содержимое перемешивают на шейкере при температуре плюс 37°C в течение 4 ч (модель трансфузии); из каждой пробирки биопробы раскапывают с помощью дозаторной пипетки на чистые предметные стекла, из них готовят по 2-3 тонких мазка, высушивают на воздухе при комнатной температуре, фиксируют в 10% растворе спирт-формалина и окрашивают по методу Шабодаша (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.); окрашенные и высушенные мазки микроскопируют в проходящем свете, производят качественный и полуколичественный анализ содержания гликогена в с/я нейтрифилах и лимфоцитах с подсчетом значений СЦК лимфоцитов по Кэплоу (1955) в модификации Астальди и Верга (1957). При этом: об оптимальности криопротектора и его пригодности к использованию с лечебной целью конкретному пациенту судят в случаях аналогичности значений показателей СЦК ОП и СЦК КП. При значениях СЦК ОП, отличающихся от СЦК КП, делают заключение о биопробах с высоким клиническим риском и непригодными для криогемотрансфузии.
[25]Необходимое оборудование: предметные стекла, пробирки для крови на 5 и 20 мл с винтовой герметичной пробкой, световой микроскоп с проходящим светом, набор тест- доз различных криопротекторов или гемоконеервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению М3 России, набор реагентов для цитохимического определения гликогена в лейкоцитах in vitro диагностики фирмы Диахим-ЦитоСтейн - ПАС (Россия).
[26]В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого способа подбора оптимального криопротектора по содержанию гликогена в лейкоцитах консервированной крови приводим 3 примера (Табл. 1), которые подтверждают практическое применение данного способа.
[27]
[28]Примечание: жирным шрифтом обозначены оптимальные значения СЦК ОП и СЦК КП.
[29]Пример №1. Результаты исследования крови донора П-ва 45 лет показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является 3,3% раствор Глицерола (СЦК с/я нейтрофилов 2,42% (в КП 2,42%); СЦК лимфоцитов 0,92% (в КП 0,92%). Заключение: ПКИ является криопротектор 3,3% Глицерол, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, ТКД, 10% ДМСО и комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.
[30]Пример №2. Результаты исследования крови донора Н-н 33 лет показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальными являются комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМАЦ +5% ГЭК и 3,3% Глицерол, у которых СЦК с/я нейтрофилов 2,00% (в КП 2,00%). Согласно СЦК лимфоцитов в ОП и КП оптимальным также является криопротектор, содержащий 55% ДМАЦ +5% ГЭК 0,76%. Заключение: ПКИ является криопротектор на основе 55% ДМАЦ +5% ГЭК и 3,3% Глицерола, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, ТКД и 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.
[31]Пример №3. Результаты исследования крови донора С-ва 47 лет показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является 3,3% раствор Глицерола (СЦК с/я нейтрофилов в КП и ОП составляет 2,41%, а СЦК лимфоцитов - по 0,94%. Заключение: ПКИ является криопротектор 3,3% Глицерол, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, ТКД, 10% ДМСО и комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.
[32]Представленные примеры иллюстрируют применимость предлагаемого способа подбора оптимального криопротектора по содержанию гликогена в лейкоцитах консервированной крови. Способ дешев и может быть внедрен в практику гематологического центра, использующего трансфузии криоконсервированных компонентов крови или костного мозга.
[33]Таким образом, благодаря использованию более чувствительного способа диагностики оптимального криопротектора по содержанию гликогена в лейкоцитах консервированной крови удается оценить эффективность и снизить риски планируемой криогемотрансфузионной терапии криопротекторного генеза.
[34]Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования является возможность проведения индивидуального скрининга криопротекторов на доклиническом этапе их применения.
