[2]Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине для получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью.
[3]Предшествующий уровень техники
[4]Лидаза - это энзимный препарат, полученный из семенных желез крупного рогатого скота. Активным компонентом препарата служит фермент гиалуронидаза. Данный фермент активирует процесс расщепления главного элемента промежуточного вещества соединительной ткани - гиалуроната (гликозаминогликана, метаболиты которого обеспечивают прочность соединительной ткани). Гиалуронидаза обладает следующими положительными свойствами: снижает вязкость соединительной ткани; усиливает проницаемость тканей и кровеносных сосудов; облегчает перемещение межтканевых жидкостей; уменьшает предрасположенность к отекам; способствует заживанию рубцов; стимулирует заживание гематом; увеличивает подвижность суставов; снижает выраженность контрактур и предупреждает их развитие.
[5]Лидазу используют по различным назначениям: при рубцовых поражениях подкожно (под рубцово-измененные ткани) или внутримышечно (вблизи места поражения), при травматических поражениях нервных сплетений и периферических нервов, в офтальмологической практике, при лечении туберкулеза легких (назначают в комплексной терапии для повышения концентрации антибактериальных лекарственных средств в очагах поражения), наружно, в виде повязок, пропитанных раствором препарата, при электрофорезе для повышения эффективности.
[6]Способы получения данного препарата известны из предшествующего уровня техники.
[7]Известен способ получения лидазы по патенту SU 566875 (опубл. 30.07.1977), включающий экстракцию уксусной кислотой из семенников крупного рогатого скота, отделение экстракта с последующим высушиванием целевого продукта, при этом полученный экстракт концентрируют и отделяют балластные белки, затем экстракт обрабатывают спиртом и полученный осадок промывают многократно ацетоном, а затем серным эфиром. Недостатки данного способа: использование в производстве пожароопасных и экологически опасных веществ, а также невысокий выход конечного продукта (1,3% в расчете на массу исходного сырья) со сравнительно низкой удельной активностью (5,12 у.е./мг).
[8]Немного иной способ получения лидазы описан в RU 1448443 (опубл. 15.08.1994). По этому способу осуществляют обработку сырья уксусной кислотой, центрифугирование, осаждение ацетоном, растворение осадка в воде с последующими фильтрацией и высушиванием целевого продукта, при этом используют жмых семенников после отделения вещества, обладающего гиалуронидазной активностью, или смесь семенников и жмыха, обрабатывают уксусной кислотой при рН 3,5-4,0 в течение 12-24 ч. при температуре 10-15°С с добавлением 0,5 г/л хлористого цинка, а целевой продукт получают осаждением тремя объемами ацетона при температуре от -5 до -10°С. Данный способ предполагает сложный, длительный и многостадийный процесс, включая осаждение при достаточно низких температурах пожароопасным и летучим реагентом (ацетоном), что приводит к повышению опасности при производстве и снижению экологической безопасности.
[9]Также известен способ получения лидазы по патенту SU 111012 (опубл. 01.01.1957), включающий автолиз тестикулярной ткани половозрелого скота крупного в присутствии уксусной кислоты при рН 4,6, очистку полученного лизата известным образом ацетоном с последующим центрифугированием и растворением в дистиллированной воде, с дальнейшей стерилизацией и фильтрованием. Конечный продукт лиофилизуют и ампулируют. Данный способ также предполагает применение пожароопасного реагента - ацетона, что в значительной степени усложняет производственный процесс, делает его пожароопасным и снижает экологическую безопасность.
[10]Получение лидазы известно также из патента SU 827068 (опубл. 07.05.1981). Способ включает обработку семенников крупного рогатого скота в присутствии уксусной кислоты, осаждения ацетоном, растворения осадка в воде с последующей фильтрацией и сублимационной сушкой, при этом, экстрагирование проводят 0,1N уксусной кислотой при температуре 5-10°С, перед фильтрацией проводят переосаждение при 0-1°С, и после фильтрации диализ при 0-10°С в течение 12-16 ч. Данный способ не позволяет получить высокий выход продукта (максимально - до 1,2 г/кг исходного сырья). Удельная активность полученного препарата составляла 2,55 у.е./мг. Этот способ также является экологически нецелесообразным и не безопасным, т.к. предполагает использование ацетона, легколетучего и токсичного вещества.
[11]Недостаток способа: высокая температура экстракции, что в сочетании с высокой концентрацией кислоты приводит к высокому выходу в раствор балластных белков и, как следствие, низкий выход по удельной активности конечного продукта (на мг/белка).
[12]Патент SU 1666534 (с приоритетом от 12.05.1989) описывает способ получения лидазы, включающий экстракцию измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 и температуре 2-40°С в течение 2-4 ч с последующим отделением экстракта и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения выхода и удельной активности препарата, экстракцию осуществляют в атмосфере инертного газа, а очистку проводят сорбцией экстракта белой глиной в количестве 25-50 г. на 1 л экстракта в течение 1-2 ч и десорбцией целевого продукта водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 при массовом соотношении сорбента и раствора 1:10-15. При этом данный способ имеет достаточно низкий выход по сравнению с заявленным способом (всего 7,5-9% от массы исходного сырья), а активность полученной лидазы составляет 1020-2050 у.е. на 100 мг. Дополнительно, при осуществлении данного способа необходимо обеспечить атмосферу инертного газа и герметичность используемого оборудования, что, в свою очередь, приводит к дополнительным тратам и повышению себестоимости продукта.
[13]Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является способ получения гиалуронидазы, описанный в патенте RU 2027759 (опубликовано 27.01.1995). Способ включает экстракцию фермента из измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты, отделение экстракта центрифугированием, очистку целевого продукта на сорбенте и сушку, при этом полученный после центрифугирования экстракт концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке с пределом задержания по молекулярной массе до 50 КДа и проводят осаждение балластных белков полиэтиленгликолем, очистку ведут катионообменной хроматографией с сорбцией фермента при рН 4,5-4,9 и элюцией при этом же рН 0,6 MNaCl. Однако, данный способ имеет свои недостатки. В частности, сравнительно невысокий выход продукта (0,078% от массы исходного сырья) и низкую удельную активность полученой лидазы (140 усл.ед./мл). Кроме того, использование для осаждения балластных белков полиэтиленгликоля (ПЭГ) может приводить к повышению вязкости системы, сложностям при хроматографии и элюировании, а несвязанный ПЭГ может оставаться в конечном продукте, что является крайне нежелательным для инъекционных форм.
[14]Таким образом, необходимо разработать способ получения препарата гиалуронидазы, не предусматривающий использования токсичных и/или опасных веществ, имеющий высокий выход продукта и по возможности отвечающий требованиям экологически безопасного производства (см. Фиг. 1).
[16]Фиг. 1 иллюстрирует основные стадии способов получения препарата гиалуронидазы согласно предшествующему уровню техники (слева) и способа согласно настоящему изобретению (справа)
[17]Фиг. 2 показывает динамику накопления общего белка в зависимости от времени экстракции;
[18]Фиг. 3 показывает динамику накопления фермента гиалуронидазы в зависимости от времени экстракции;
[19]Фиг. 4 показывает динамику накопления общего количества активного фермента гиалуронидазы в зависимости от времени экстракции.
[20]Фиг. 5 представляет электрофоретограмму полученного экстракта (проводился электрофорез проб, полученных в результате концентрирования и отмывки экстракта семенников КРС, в ПААГ). Рамкой показаны полосы, соответствующие молекулярной массе фермента гиалуронидаза. Цифрами на Фиг. 5 обозначены:
[21]1 - Маркер фирмы Bio Rad (молекулярные массы 97,4; 66,2; 45; 31; 21,5; 14,4 кДа)
[23]3 - Экстракт семенников КРС
[24]4 - Концентрат, полученный на кассете 8 кДа
[25]5 - Концентрат, полученный после отмывки на кассете 8 кДа
[26]6 - Концентрат, полученный на кассете 30 кДа
[27]7 - Концентрат, полученный после отмывки на кассете 30 кДа
[28]8 - Концентрат, полученный на кассете 50 кДа
[29]9 - Концентрат, полученный после отмывки на кассете 50 кДа
[30]Краткое описание изобретения
[31]Способ получения препарата гиалуронидазы включает следующие стадии:
[32]1) измельчение репродуктивной ткани крупного рогатого скота (семенников);
[33]2) экстракцию 0,1 н уксусной кислотой в течение не более 2 часов при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании;
[34]3) центрифугирование экстракта, полученного на предыдущей стадии;
[35]4) концентрирование полученного центрифугата с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающей частицы выше 30 к Да;
[36]5) диафильтрацию через мембраны с аналогичным размером пор,
[37]6) стерилизующую фильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм;
[38]7) розлив препарата в ампулы;
[39]8) сублимационную сушку.
[40]Способ отличается от способов получения, описанных в предшествующем уровне техники тем, что не используют ацетон в качестве экстрагента или осаждающего агента.
[41]Также, согласно изобретению, предложен препарат гиалуронидазы, полученный согласно описанному способу. Полученный препарат также отличается тем, что не содержит ацетон.
[42]Подробное описание изобретения
[43]Цель изобретения - создание экологически чистого производства, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта при снижении себестоимости.
[44]Задача, решаемая настоящим изобретением создание экологически чистого производства, снижение себестоимости, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта.
[45]Технический результат заключается в повышении выхода и увеличении удельной активности конечного продукта.
[46]В результате исследования было обнаружено, что можно повысить выход препарата и его удельную активность, если осуществлять получение препарата способом, включающим стадии:
[47]1) измельчение репродуктивной ткани крупного рогатого скота (семенников);
[48]2) экстракцию 0,1 н уксусной кислотой в течение не более 2 часов при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании;
[49]3) центрифугирование экстракта, полученного на предыдущей стадии;
[50]4) концентрирование полученного центрифугата с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающей частицы выше 30 к Да;
[51]5) диафильтрацию через мембраны с аналогичным размером пор,
[52]6) стерилизующую фильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм;
[53]7) розлив препарата в ампулы;
[54]8) сублимационную сушку.
[55]При этом, именно сочетание оптимального экстрагента (0,1 н уксусная кислота), времени и постоянного перемешивания позволяют достичь максимального выхода и высокой удельной активности получаемой гиалуролидазы.
[56]Кроме того, было обнаружено, что в данных условиях процесс экстракции можно существенно сократить по времени, до 2 ч., т.к. именно в этих условиях экстрагирование проходит наиболее эффективно, и при экстракции свыше 2 ч. происходит снижение выхода целевого продукта (см. Фиг. 2).
[57]Частный вариант осуществления настоящего изобретения включает способ, согласно которому замороженную репродуктивную ткань крупного рогатого скота (семенники) измельчают, экстрагируют в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 2 ч при температуре 4-10°С при постоянном перемешивании, отделяют балластные вещества на центрифуге (3000 об/мин, 30 мин, 4-10°С), затем проводят осветляющую фильтрацию на мембранах с размером пор 9 мкм, затем полученный раствор подают на ультрафильтрацию через мембраны с размером пор, пропускающей частицы выше 30 кДа, далее проводят диафильтрацию (отмывка в 10-кратном объеме) через мембраны с аналогичным размером пор, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают во флаконы (ампулы) из расчета 1500 ME на флакон, сублимируют.
[58]Другой вариант реализации предполагает способ, в котором замороженную репродуктивную ткань крупного рогатого скота (семенники) измельчают, экстрагируют в 2 объемах 0,1 н уксусной кислоты в течение 2 ч при температуре 4-10°С при рН 4,3-4,7 при постоянном перемешивании, концентрируют в 5 раз с помощью мембран для ультрафильтрации с размером пор, пропускающей частицы выше 30 кДа, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают в ампулы и сублимируют.
[59]Полученный препарат имеет имеет выход готовой продукции, увеличенный в 2,4-4,5 раза по сравнению с известными способами получения при сохранении и увеличении удельной активности до.
[61]Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине для получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью.
[63]Известен способ получения лидазы, согласно которому замороженные семенники половозрелых быков измельчают, измельченную массу дефростируют, добавляют раствор 12%-ной уксусной кислоты из расчета 100 мл на 1 кг сырья. Автолиз проводят в течение 18-20 ч при рН 4,5-4,6, при температуре 39-40°С, после чего жидкую фракцию отделяют, стерилизуют путем фильтрации через фильтр типа Зейтца. Профильтрованный лизат охлаждают до температуры 1-3°С и вливают в 4 объема ацетона с той же температурой, отстаивают 3-5 ч. на холоду и жидкий слой отделяют. Осадок гиалуронидазы растворяют в дистиллированной воде, охлажденной до 2-3°С из расчета 300 мл на 1 л исходного лизата. Раствор передают на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы, сушат сублимационной сушкой. Недостаток способа: высокая температура экстракции, что в сочетании с высокой концентрацией кислоты приводит к высокому выходу в раствор балластных белков и, как следствие, низкий выход по удельной активности конечного продукта (на мг/белка).
[65]Существует способ получения лидазы, включающий измельчение семенников половозрелых быков, экстракцию в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4-10°С, фильтрование, осаждение сырца лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 4 объема ацетона на 1 объем экстракта при температуре не выше 0°С, перемешивание и отстаивание в течение не менее 4 ч. при температуре не выше 5°С, отделение осадка, растворение осадка в воде из расчета 200-250 мл на 1 кг исходного сырья, фильтрацию, переосаждение лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 6 объемов ацетона на 1 объем фильтрата при температуре не выше 0°С, отстаивания в течение 4 ч. при температуре не выше 5°С, промывки 99%-ным ацетоном при температуре не выше 0°С, сушку, стерильный розлив во флаконы и сублимационную сушку конечного продукта. Полученный продукт имеет удельную активность 0,14 у.е./мг.
[67]Замороженную репродуктивную ткань крупного рогатого скота (семенники) измельчали, экстрагировали в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 2 ч. при температуре 4-10°С, отделяли балластные вещества на центрифуге (3000 об/мин, 30 мин, 4-10°С), затем проводили осветляющую фильтрацию на мембранах с размером пор 9 мкм, затем полученный раствор подавали на ультрафильтрацию через мембраны с размером пор, пропускающей частицы выше 30 кДа, далее проводили диафильтрацию (отмывку в 10-кратном объеме) через мембраны с аналогичным размером пор, после чего концентрат стерильно фильтровали, разливали во флаконы (ампулы) из расчета 1500 ME на флакон, и подвергали сублимационной сушке.
[68]Выход составлял не менее 3,42 г / кг исходного сырья.
[69]Удельная активность полученной лидазы составляла не менее 7,39 у.е./мг.
[71]Проводились исследования по сравнению влияния времени экстракции на выход белка, удельную и общую активность фермента. Экстракцию сырья проводили на протяжении 1, 2 и 4 ч. Результаты приведены в таблице 1 и на Фиг. 2.
[72]
[73]По результатам исследования можно сделать вывод, что продолжительность экстракции не оказывает существенного влияния на выход белка, удельную и общую активность.
[75]Удельную активность измеряли по способу, известному в литературе и являющемуся стандартным для измерений подобного рода.
[77]Для определения молекулярного состава белков в полученном препарате лидазы был проведен электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (SDS PAGE). Данные, полученные при проведении ультрафильтрации на кассетах с разным размером пор (8, 30 и 50 кДа), представлены на Фиг. 5.
[78]Как видно из результатов анализа, полученный экстракт содержит фермент гиалуронидазу.
[80]Полученные по способу 3 ампулы с препаратом гиалуронидазы упаковывают в коробки по 10 ампул или флаконов, вкладывают инструкцию по применению и используют в случае необходимости по назначению.
