[1]Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов - метабиотиков из симбионтных бактерий, которое может быть использовано в медицине и ветеринарии для стимуляции и коррекции иммунного статуса при первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях, связанных с инфекционными, аллергическими, онкологическими, соматическими заболеваниями, путем оптимизации иммунного гомеостаза и микробиоты макроорганизма.
[2]Симбионтные микроорганизмы являются неотъемлемой частью многочисленных микробиоценозов человека и животных, которые вместе с макроорганизмом составляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия. Бондаренко В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях. Consilium medicum, 2005, т. 7, №6, с. 437-443.
[3]Коринебактерии входят в состав микробиоценозов всех открытых полостей: т.е кожи, дыхательных путей, ротоглотки, гениталий и т.д., и их метаболиты оказывают влияние на макроорганизм, поддерживая его иммунный гомеостаз, тем самым влияя на сохранение здоровья.
[4]Профилактическая и терапевтическая активность бактериальных метаболитов-иммуномодуляторов подтверждается их действием на распознающие рецепторы клеток врожденного иммунитета.
[5]Современные исследования и открытия в области иммунологии позволяют оценить активность микробных метаболитов и их роль в стимуляции или коррекции иммунного статуса при первичных или вторичных иммунодефицитных состояниях, сопряженных прежде всего с инфекционными заболеваниями бактериальной и вирусной природы.
[6]Роль врожденного иммунитета, естественной и приобретенной невосприимчивости к инфекциям открывают возможность более целенаправленного управления инфекционным процессом. Так, отпадает прессинг на иммунную систему специфической вакцинацией или массированным использованием антибиотиков, приводящий к появлению еще более устойчивых видов патогенов и дисбиотическим микроэкологическим нарушениям.
[7]Известен иммуномодулятор, подавляющий активность продукции антител класса IgE, выделенный из продукта разложения клеточной стенки Corynebacteriae, полученного путем растворения клеточных стенок Corynebacterium glutamicum с одним из ферментов глюкозидазой и эндопептидазой. Степень распада определяется по растворению гексозамина или глюкозамина в надосадочной жидкости. В частном случае реализации изобретения штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 15354 инокулируют в питательном бульоне и инкубируют со встряхиванием при температуре 30°C в течение 18 ч. Клетки собирают центрифугированием, чтобы получить приблизительно 3 г осадка. Влажные клетки отмывают центрифугированием один раз физиологическим раствором. Затем 500 мл физиологического раствора добавляют к осадку, суспендируют клетки и добавляют при перемешивании 4 мг лизоцима яичного белка. После перемешивания при температуре 37°C в течение 2 ч добавляют 4 мг сератиопептидазы и дополнительно инкубируют при температуре 37°C в течение 2 ч при перемешивании, чтобы получить материал разложения по настоящему изобретению. Полученную смесь нагревают при температуре 80°C в течение 30 мин и подвергают сублимационной сушке с получением 3 г сухого материала. US 5506388 В1, опубл. 14.01.2003.
[8]Способ получения препарата из целых клеток Corynebacterium glutamicum представляет собой процесс приготовления с помощью ферментов лизата целых клеток (лизоцим) и лизата клеточных стенок (сератиопептидаза). Введение такого лизата (сублимационно высушенного) приводит к снижению показателей гуморального иммунитета, т.е. антител изотипа IgE, отражающих наличие аллергического статуса организма.
[9]Наиболее близким по технической сущности к заявленному является симбионтный штамм Corynebacteriae diphtheriae tox- №108 - депонированный в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», используемый для приготовления иммуномодулятора, создающего неспецифическую резистентность против инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы у сельскохозяйственных животных. Для получения иммуномодулятора штамм выращивают в течение 16 ч на плотной питательной среде на основе рыбного гидролизата с добавлением сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37°C. Затем культуру смывают жидкой питательной средой на основе гидролизата казеина и после 5 ч культивирования вносят в емкости с той же питательной средой большего объема. Проводят выращивание биомассы при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 16 ч. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают физиологическим раствором при центрифугировании в режиме 5000 g в течение 20 мин. Влажный осадок взвешивают, суспендируют в забуференном физиологическом растворе с pH 7,2 до концентрации клеток 5%. Затем целые клетки дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм и охлаждением (льдом или водой) до температуры 30°C. Полученную после ультразвуковой обработки гомогенную суспензию дезинтеграта центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок. Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. Осадок, представляющий собой препарат клеточных стенок, ресуспендируют в физиологическом растворе и снова центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин. Отмывание клеточных стенок от примеси цитоплазмы повторяют 3 раза. Отмытые клеточные стенки ресуспендируют в дистиллированной воде, полученный маточный раствор стерилизуют при температуре 100°C, и подвергают лиофильному высушиванию. Полученный сухой препарат - порошок беловатого цвета, после разведения в физиологическом растворе образует суспензию. RU 2477751 С1, опубл. 20.03.2013.
[10]Полученный таким способом препарат из симбионтного штамма C.diphtheriae tox- №108 (Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры ФБУН «МНИИЭМ» им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) предлагается использовать в качестве иммуномодулятора для создания неспецифической резистентности у сельскохозяйственных животных.
[11]Технической задачей является разработка способа получения метабиотического препарата-иммуномодулятора для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных, использующего клеточные стенки симбионтного штамма Corynebacteriae tox- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
[12]Технический результат от реализации заявленной группы изобретений заключается в получении безопасного и эффективного метабиотического препарата-иммуномодулятора для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных, обеспечивающего поддержание иммунного гомеостаза, что так же способствует и коррекции микроэкологического статуса того или иного биотопа.
[13]Технический результат достигается тем, что симбионтный штамм Corynebacterium diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича выращивают на плотной питательной среде, содержащей рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в соотношении 3:1 в течение 60-70 ч, затем культуру смывают жидкой питательной средой на основе гидролизата казеина и после 5 ч культивирования проводят наращивание биомассы в той же жидкой питательной среде при постоянном перемешивании в течение 16 ч, микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают раствором хлорида натрия при центрифугировании при 5000 g в течение 20 мин, полученный влажный осадок суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия до концентрации клеток 5-6 мас.% и дезинтегрируют в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм, при температуре не выше 30°C, полученный дезинтеграт клеток центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин, осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, полученный осадок ресуспендируют в растворе хлорида натрия и центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, отмывают клеточные стенки от примеси цитоплазмы и питательной среды 3 раза, полученный осадок клеточных стенок ресуспендируют в растворе стабилизатора - глицина в концентрации 15 мг/мл и стерилизуют.
[14]Полученный метабиотический препарат-иммуномодулятор для укрепления врожденного иммунитета у человека и животных содержит клеточные стенки симбионтного штамма Corynebacteriae tox- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
[15]Приготавливают препарат в форме спрея или высушивают методом лиофилизации. Препарат пригоден для использования в различных лекарственных формах - капсулах, порошках, инъекционных растворах, мазях, аэрозолях, свечах, каплях и др.
[16]Изобретение поясняется примером его осуществления.
[18]Штамм Corynebacteriae tox- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича выращивают на плотной питательной среде известного состава - рыбный гидролизат с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в соотношении 3:1 при температуре 37°C в течение 65 ч. Затем культуру смывают жидкой питательной средой, содержащей, г/л: гидролизат казеина - 2,0, пептон - 10,0, глюкоза - 10,0, дрожжевой экстракт - 2,0, натрия хлорид - 6,0, вода - остальное. После 5 ч культивирования при температуре 37°C вносят в рабочие емкости с той же жидкой питательной средой и проводят наращивание биомассы при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 16 ч. Микробные клетки осаждают центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин и трижды промывают раствором хлорида натрия при центрифугировании в режиме не менее 5000 g в течение 20 мин. Полученный влажный осадок взвешивают, суспендируют в забуференном растворе хлорида натрия с pH 7,2 до концентрации клеток 5 мас.%. Затем суспензию целых клеток дезинтегрируют на ультразвуковой установке в течение 20 мин при частоте 20 кГц, амплитуде 14 мкм, при температуре не выше 30°C. Полученный дезинтеграт клеток центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин с целью отделения неразрушенных клеток и их фрагментов от клеточных стенок. Осадок удаляют, надосадочную жидкость центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин, отмывают клеточные стенки от примеси цитоплазмы и питательной среды 3 раза, полученный осадок клеточных стенок ресуспендируют в растворе стабилизатора - глицина в концентрации 15 мг/мл и стерилизуют.
[19]Оценка влияния препарата на систему врожденного иммунитета.
[20]При оценке препаратов-модуляторов ориентируются не только на конечный результат невосприимчивости к инфекциям, но и на отдельные наиболее информативные показатели состояния иммунной системы. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, ч. 2, глава 11, доклинические исследования иммуномодуляторов микробного происхождения. М., 2013. С. 284.
[22]Влияние препарата на устойчивость к Klebsiella, pneumonia.
[23]Важной характеристикой неспецифической активности иммуномодуляторов является их способность стимулировать естественную резистентность организма к различным микробным инфекциям.
[24]Изучение защитной роли препарата при заражении Klebsiella, pneumonia проводили на беспородных мышах. На фиг. 1 показано влияние препарата на устойчивость беспородных мышей к заражению Klebs. pneumonia. По оси ординат представлено количество погибших животных в %, по оси абсцисс - заражающие дозы Klebs. Pneumonia, * - достоверные различия между выживаемостью опытных и контрольных животных. За 1 сутки до заражения мышам подкожно ввели препарат в разных дозах. Как видно, гибель животных, получивших препарат в дозах 200 мкг и 400 мкг, ниже, чем у контрольных животных. Введение препарата в дозе 100 мкг повышает выживаемость мышей только при заражающих дозах 10-3; 10-5 микробных клеток.
[26]Влияние препарата на устойчивость к St. aureus представлено в таблице 1.
[27]
[28]* - в скобках отмечено количество выживших животных.
[29]Как видно из данных таблицы, защитное действие препарата проявляется в обеих группах животных, но у мышей F1(CBA×C57B1/6) оно выражается сильнее. У них выше выживаемость, а локальный очаг воспаления у большинства выживших отсутствует (т.е. все зажило). Наибольший защитный эффект отмечен при вакцинирующей дозе 100 мкг как у беспородных мышей, так и у гибридов.
[31]Влияние препарата на активность мембранного фермента макрофагов перитонеального экссудата (МПЭ) 5'-нуклеотидазы лабораторных животных.
[32]В реализации биологической активности иммуномодуляторов важнейшую роль играют мембранные структуры. Большое значение для понимания механизма действия модуляторов и оценки их активности имеет изучение экзоферментов цитоплазматической мембраны макрофагов, в частности 5'-нуклеотидазы. 5'-нуклеотидаза (5'-н) - это один из основных ферментов пуринового обмена, который является ключевым звеном, опосредующим влияние различных факторов на жизнедеятельность клеток, в том числе клеток иммунной системы.
[33]Снижение активности 5'-н - маркера цитоплазматической мембраны МПЭ является одним из характерных признаков активации этих клеток.
[34]Препараты, обладающие иммуностимулирующим действием, вызывают снижение активности 5'-н в МПЭ беспородных мышей, а иммуносупрессивным, наоборот - повышение ферментативной активности. Препараты, не обладающие иммуномодулирующим эффектом, не изменяют уровня активности 5'-нуклеотидазы в МПЭ.
[35]Активность 5'-нуклеотидазы в МПЭ мышей гибридов F1(CBA×C57B1/6) в течение 30 суток после подкожного введения разных доз препарата показана на фиг.2. По оси абсцисс представлено время в сутках, по оси ординат - активность 5'-н у вакцинированных животных по отношению к контрольным, * - достоверные различия между уровнем активности 5'-н у вакцинированных и контрольных мышей.
[36]Видно, что при применении препарата в дозах 100 мкг и 200 мкг наблюдается стабильное снижение активности фермента относительно контрольных значений в течение всего срока исследования. Препарат в дозе 400 мкг вызывает повышение активности фермента к 23 суткам, а к 31 - эта активность падает.
[37]Полученные данные свидетельствуют о наличии у препарата длительного иммуностимулирующего эффекта. Глубина этого эффекта зависит от вводимой животным дозы и срока наблюдения.
[39]Влияние препарата на продукцию ИЛ-2 представлено в таблице 2.
[40]Под воздействием иммуномодулятора микробного происхождения возрастает продукция противовоспалительных цитокинов, необходимых для инициации клеточного и гуморального иммунитета.
[41]Определение продукции ИЛ-2 под влиянием препарата-иммуномодулятора в дозах 10 мг/кг при 2-кратном введении мышам линии F1(CBA×B6) приведены в таблице 2. Видно, что введение препарата стимулирует продукцию ИЛ-2 спленоцитами, активированными конкавалином А, что выражается в усилении пролиферации клеток на 50-70% (индекс стимуляции 1,0). Препарат в дозах 1, 0,1 мг/кг стимулирует ИЛ-2 меньшим процентом клеток, что и отражает индекс стимуляции (2,1±0,25 и 1,2±0,3).
[42]
[43]Стимулирующий эффект препарата на продукцию ИЛ-2 по сравнению со стимулирующим эффектом некоторых известных иммуномодуляторов (например, полисахаридами), то последние существенно уступают препарату из коринебактерий.
[44]Выявленное усиление синтеза ИЛ-2 у животных, иммунизированных препаратом, усиливает общую экспрессию иммунокомпетентных клеток, что повышает уровень неспецифической резистентности в ответ на контакт с бактериальными и вирусными антигенами.
[46]Влияние препарата на образование Т-киллеров in vivo у животных, иммунизированных препаратом, в ответ на введение аллогенных опухолевых клеток.
[47]
[48]* - Указаны средние трех независимых опытов; соотношение киллер:мишень - 30: 1.
[49]Видно, что у животных, иммунизированных препаратом, выявлена высокая неспецифическая активность киллеров в отношении аллогенных опухолевых клеток. Более высокая активность выявлена при иммунизации животных дозой 10 мг/кг.
[51]Влияние препарата на количественное содержание лимфоцитов в крови у 40 взрослых лиц - носителей возбудителя дифтерии.
[52]Проблема носительства возбудителя дифтерии C. diphtheriae tox+ и заболевания привитых остается актуальной. Санация антибиотиками и антисептиками не предотвращает длительного и рецидивирующего носительства возбудителя, которое преимущественно наблюдается у привитых лиц с хронической патологией ЛОР-органов, отягощенных аллергическим статусом и вторичным иммунодефицитным состоянием.
[53]В таблице 4 представлены клинические показатели содержания лимфоцитов в крови длительных носителей C.diphtheriae tox+ до и после введения препарата.
[54]
[56]n - число обследованных,
[57]отличие от нормы значимо при р*<0,05; **<0,01; ***<0,001.
[58]До введения препарата регистрировались индивидуальные отклонения в содержании лимфоцитов по сравнению с их содержанием в крови здоровых лиц. Поэтому все обследованные в зависимости от исходных показателей были разделены на три группы. В первую группу вошли носители с низким исходным содержанием лимфоцитов, во вторую - с высоким, и в третью - с показателями, соответствовавшими норме.
[59]У всех лиц первой группы показатели содержания лимфоцитов достоверно ниже, чем в контрольной группе. После введения препарата содержание лимфоцитов в первой группе увеличилось, приближаясь к показателям нормы.
[60]В группе №2 носителей с высоким содержанием лимфоцитов в крови после введения препарата их показатели содержания лимфоцитов снизились, приближаясь к показателям контрольной группы.
[61]У носителей третьей группы, в крови которых исходное содержание лимфоцитов соответствовало норме, после введения препарата количество лимфоцитов в крови осталось прежним, т.е. оно колебалось в пределах верхней и нижней границы нормы.
[62]Представленные данные свидетельствуют об избирательном воздействии препарата на иммунную систему человека. Так, при низкой исходной концентрации после введения препарата происходит стимуляция их содержания, при высокой - снижение, при концентрации, соответствующей норме, их содержание не меняется. Следовательно, метабиотический препарат-иммуномодулятор из симбионтных коринебактерий обладает иммуномодулирующей активностью, безвредностью и иммунокорегирующими свойствами. Изменение количественного состава лимфоцитов в крови длительных носителей в сторону физиологического оптимума сопровождалось положительным санирующим эффектом.
[63]Итак, представленные характеристики иммуностимулирующих свойств препарата свидетельствуют о его неспецифической активности.
[64]Выраженная способность макроорганизма под воздействием препарата-метабиотика стимулировать резистентность к инфекционным возбудителям повышает активность системы макрофагов, ИЛ-2, активность Т-киллеров, что позволяет говорить о возможности использования метабиотического препарата-иммуномодулятора из симбионтных коринебактерий для повышения неспецифической резистентности (адаптивного иммунитета) макроорганизма.
