[1]Пробиотический штамм Bacillus megaterium - продуцент антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов.
[2]Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к средствам профилактики и лечения инфекционных болезней, вызываемых патогенными микроорганизмами, аллергических заболеваний, повышения иммунной резистентности организма, коррекции дисбиозов различной этиологии.
[3]Известно, что пробиотики - класс микроорганизмов и веществ микробного и иного происхождения, использующихся в терапевтических целях, а также пищевые продукты и биологически активные добавки, содержащие живые микрокультуры. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus (см. Химическая и биологическая безопасность. 2007. №2-3 (32-33)).
[4]В патенте ЕР 0363491 (B1), NIKITENKO, 02.02.1994 описан препарат для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов различной локализации и пищевой аллергии, использующий штамм Bacillus subtilis 534, депонированный за №1666 D. Препарат обеспечивает усиление лечебного эффекта за счет проникновения бактерий в очаг повреждения, где они вырабатывают биологически активные вещества, тем самым подавляя развитие инфекции и способствуя очищению от некротизированных тканей. Препарат «Споробактерин» (RU 2217154 С2, Никитенко М.В., 20.06.2003), который содержит жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtilis ВКМ 1666D в концентрации 107-1015 КОЕ/мл в растворе хлорида натрия, проявляет антагонистическую активность к бактериям золотистого стафилококка, протея мирабильного, грибкам рода Candida. В патенте (RU 2035185 С1, ИМиВ АН Украины и др., 20.05.1995) описан биопрепарат для профилактики желудочно-кишечных заболеваний на основе рекомбинантного штамма В. Subtilis ВКПМ В-4759, который характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, антивирусной активностью за счет синтеза интерферона.
[5]Известно, что штаммы Bacillus megaterium (В-4440 и В-200) использовались ранее в сельском хозяйстве для восстановления плодородия почвы, увеличения всхожести семян, укрепления иммунной системы растений, сопротивляемости болезням и вредителям (RU 2322061 С2, НПО "Экобиотех+", 20.04.2008).
[6]Ближайшим аналогом патентуемого штамма является пробиотический штамм Bacillus megaterium LJ2014 (регистрационный № KCCM11676P), используемый в составе фармацевтической композиции для лечения или профилактики воспалительных заболеваний или аллергических заболеваний, которая проявляет иммунологическую активность и отбеливающий эффект (KR 101583600 (В1), 21.01. 2016 - прототип). Композиция (пищевая или косметическая) содержит штамм, лизат штамма, культуры штамма, концентрат культуры и высушенного материала из культуры Bacillus megaterium.
[7]Настоящее изобретение направлено на решение технической проблемы - расширение арсенала пробиотических штаммов, направленных на профилактику и лечение дисбактериозов различной этиологии, инфекционных заболеваний человека и животных, вызываемых широким спектром патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также аллергических заболеваний, повышения иммунной резистентности организма, что и является техническим результатом изобретения.
[8]Патентуемый штамм Bacillus megaterium 874 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером В-12251, является продуцентом антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов. Штамм В. megaterium 874 обладает иммуномодулирующей способностью и может быть использован для снижения аллергии и, например, может быть добавлен в пищевые продукты. Штамм обладает, подобно антибиотику широкого спектра действия, выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др. Штамм продуцирует следующие ферменты: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Обладает лизоцимной активностью.
[9]Характеристика штамма Bacillus megaterium 874
[10]Штамм Bacillus megaterium 874 выделен из почвы. Это грубая палочка размером (4-7)×(1,5-2) мкм. Располагается одиночно, попарно или цепочками, подвижна. Образует споры, капсул не образует, грамположительна. Аэроб, на плотной среде колонии круглые, белые, с ровным или слегка волнистым краем. В бульоне - белесоватая пленка на поверхности и небольшой придонный осадок.
[11]Штамм В. megaterium 874 хорошо растет на простых питательных средах в течение 18-24 часов. Оптимальная температура культивирования - 37°C.
[12]Штамм ферментирует без выделения газа глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, манит. Не разлагает лактозу. Не образует индол, сероводород. Штамм продуцирует протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Не образует уреазу. Основные физиолого-биохимические свойства представлены в таблице 1.
[13]
[14]Специфическая активность В. megaterium 874
[15]Специфическая активность штамма В. megaterium 874 изучена методом отсроченного антагонизма в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов (Таблица 2). В качестве контроля использованы тест-штаммы: Staphylococcus aureus "Никифоров", Staphylococcus aureus "Филиппов", E.coli 157, Pr.mirabilis. Определяли антагонистическую активность по зоне задержки роста тест-штаммов (в мм), при этом антагонистическую активность считали положительной при задержке роста тест-культур не менее 10 мм.
[16]
[17]Безопасность В. megaterium 874
[18]Изучали острую и хроническую токсичность штамма В. megaterium 874. Опыты проводили на крысах и мышах (Таблицы 3, 4). При изучении острой токсичности животным вводили культуру В. megaterium 874 внутримышечно и внутрибрюшинно в различных концентрациях.
[19]При исследовании острой токсичности гибели животных за весь период наблюдения на протяжении 15 дней не наблюдалось.
[20]
[21]
[22]При наблюдении за животными.
[23]Первые сутки после введения препарата
[24]Общее состояние удовлетворительное, поведение обычное, движения координированы, судорог не отмечалось. Реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители идентична наблюдавшейся до эксперимента в обеих группах. Волосяной и кожный покров не изменялся. Потребление корма и воды обычное.
[25]В последующие 14 дней наблюдения изменений в поведении, реакции на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, в потреблении корма и воды, в характере, режиме дефекации и мочеиспускания не было.
[26]Результаты измерения массы тела крыс отражены в таблице 5. Статистически достоверных различий в прибавке массы за 14 суток не выявлено. Средняя прибавка массы крыс за время наблюдения в опытных группах составила: группа, получавшая 0,5 мл препарата - 21±1,8 г; группа, получавшая 1,5 мл препарата - 20±2,6 г; группа, получавшая 5,0 мл препарата - 20±1,9 г. Средняя прибавка массы за время наблюдения в контрольных группах составила: группа, получавшая 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 18±1,5 г; группа, получавшая 1,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 19±2,7 г; группа, получавшая 5,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 20±2,5 г. Статистически достоверных различий в прибавке массы тела крыс в опытных и контрольных группах не выявлено (p>0,1).
[27]
[28]Результаты измерения массы тела мышей отражены в таблице 6. Статистически достоверных различий в прибавке массы за 14 суток не выявлено. Средняя прибавка массы мышей за время наблюдения в опытных группах составила: группа, получавшая 0,1 мл препарата - 2,3±0,9 г; группа, получавшая 0,5 мл препарата - 1,9±1,2 г; группа, получавшая 1,0 мл препарата - 2,2±0,9 г. Средняя прибавка массы за время наблюдения в контрольных группах составила: группа, получавшая 0,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,2±0,7 г; группа, получавшая 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,8±0,7 г; группа, получавшая 1,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,0±1,0 г. Статистически достоверных различий в прибавке массы тела мышей в опытных и контрольных группах не выявлено (p>0,1).
[29]
[30]В связи с тем, что летальности во всех группах не наблюдалось, клинические анализы крови, патоморфологические и гистологические исследования выполнялись в группах животных, получавших максимальное количество препарата или физиологического раствора. Для крыс это количество составило 5,0 мл внутримышечно, для мышей - 1,0 мл внутрибрюшинно.
[31]Клинический анализ крови выполнялся на вторые, седьмые и четырнадцатые сутки опыта. Результаты анализов крови лабораторных крыс показаны в таблице 7. Нормальные показатели отражены в таблице 8.
[32]
[33]
[34]При внешнем визуальном осмотре тел животных различий между опытной и контрольной группами также не выявлено. Кожа эластичная, подвижная; шерсть гладкая, блестящая; видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъязвлений и посторонних наложений; подкожная клетчатка умеренно выражена; патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали.
[35]При макроскопическом исследовании внутренних органов различий между опытной и контрольной группами не обнаружено. Раздражающего воздействия тестируемого вещества в месте введения (брюшинная полость) не выявлено.
[36]При изучении острой токсичности штамма В. megaterium 874 установлено, что при парентеральном введении препарата в максимальной дозе он не вызывает летального и токсического эффекта.
[37]При изучении хронической токсичности животным вводили культуру перорально по 109 микробных клеток ежедневно в течение 10 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Результаты изучения хронической токсичности культуры представлены в таблице 9.
[38]
[39]Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней.
[40]Через 1 и 7 суток по 5 животных из каждой группы умерщвляли глубоким эфирным наркозом и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, а также отбирали различные органы для гистологического изучения: печень, почки, легкие, селезенку, кишечник, мезентериальные лимфатические узлы, головной мозг, тимус, мягкие ткани в области глотки (последние только при оральном введении). Материал фиксировали в растворе формалина, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
[41]Проводили в таком же объеме гистологические исследования органов контрольных животных.
[42]В течение всего периода наблюдения животные были здоровы, хорошо поедали пищевые рационы, поведенческие реакции не нарушены, шерстный покров не изменен. Макроскопическое и гистологическое изучение внутренних органов животных не выявило никаких патологических изменений даже в группах животных, получавших максимальное количество бактериальных клеток.
[43]Промышленная применимость штамма подтверждается следующими примерами.
[44]Пример 1. Использование штамма B. megaterium 874 в качестве продуцента антибактериальных веществ
[45]Штамм отличается выраженной антагонистической активностью, подобно антибиотику широкого спектра действия, он обладает активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др. Антагонистическая активность штамма дает возможность добавлять его в препарат для использования в плановой предоперационной подготовке и послеоперационном периоде для лечения заболеваний легких и верхних дыхательных путей (бронхиты, пневмонии, синуситы, тонзиллиты и т.п., вызванные стафилококками, клебсиеллой и грамотрицательными бактериями), для профилактики и лечения послеоперационных инфекционных осложнений, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.
[46]Пример использования штамма В. megaterium 874 для получения препарата
[47]1-й пассаж: Стерильно вскрывают ампулу лиофилизированного штамма В. megaterium 874. Содержимое ампулы разводится в 1 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида. Затем полученную взвесь микроорганизмов засевают на жидкую питательную среду (ПБ). Инкубируют при температуре 37±1°C в течение 18-20 часов.
[48]2-й пассаж: Выросшую культуру разводят 0,9% раствором натрия хлорида до получения суспензии, количество живых клеток в которой составляет не менее 10×109.
[49]Полученную суспензию высевают в бактериологические матрацы с питательным агаром стерильным шприцом из расчета примерно 5,0±1,0 мл на матрац. Засеянные матрацы инкубируют при температуре (37±1)C в течение 120±12 ч.
[50]Смыв биомассы с питательного агара после выращивания.
[51]Смыв биомассы, выросшей на поверхности питательной среды, осуществляют 5% раствором натрия хлорида с помощью микробиологических петель. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду. Полученная биомасса представляет собой жидкий концентрат бактерий штамма В. megaterium 874, который можно использовать в качестве лекарственного препарата. Предварительно биомассу разводят 5% раствором натрия хлорида, до получения суспензии, количество живых клеток в которой составляет не менее 109. Готовый продукт разливают по 10 мл во флаконы и укупоривают.
[52]Пример 2. Использование штамма В. megaterium 874 как продуцента иммуномодуляторов
[53]При изучении штамма В. megaterium 874 как продуцента иммуномодуляторов опыты проводили на мышах, животным вводили культуру перорально по 109 микробных клеток каждый день в течение 10 дней. Под влиянием этих процедур усилились функциональные свойства фагоцитов (повысился фагоцитоз), возросла продукция провоспалительных цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета. В результате увеличилась продукция антител, активировалось образование антигенспецифических Т-хелперов и Т-киллеров.
[54]Учитывая результаты проведенных исследований, можно рекомендовать использовать данный штамм в качестве иммуномодулятора.
[55]1-й пассаж: Лиофилизированную культуру штамма В. megaterium 874 разводят стерильным раствором натрия хлорида, полученную суспензию засевают в 50 мл пептона. Инкубируют 18-20 часов при температуре (37±1)C.
[56]2-й пассаж: Выросшую культуру, с содержанием живых бактерий не менее 109 вносят в минеральную среду М9 с казаминовыми кислотами, выращивают в биореакторе при температуре (37±1)C 18-20 часов.
[57]
[58]После завершения процесса культивирования клетки отделяют центрифугированием. После осаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют с использованием установки для ультрафильтрации. Полученный раствор имеет молекулярный вес в диапазоне 10-100 тыс. дальтон. Он свободен также от нуклеиновых кислот, жиров и органических кислот. Изолированный таким образом и очищенный раствор обладает иммуномодуляторными свойствами. Полученный раствор осаждают спиртом (этанол : вода - 3:1 по объему). Осажденный спиртом продукт лиофилизируют.
[59]Пример 3. Использование штамма В. megaterium 874 в качестве продуцента протеолитических ферментов.
[60]Штамм продуцирует протеазу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Это свойство штамма можно использовать, добавляя бесклеточную культуральную жидкость штамма В. megaterium 874.
[61]Протеолитические ферменты, лизоцим, липазы, амилазы и другие способствуют очищению ран и воспалительных очагов от некротизированных тканей, эта способность штамма может быть использована для профилактики и лечения заболеваний полости рта (глоссит, гингивит, пародонтит, стоматит). Поскольку штамм способен вырабатывать протеолитические ферменты, его можно использовать для лечения ферментной недостаточности поджелудочной железы.
[62]Культивирование штамма проводят при посевной дозе (3-5)×109 кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70-90%. Культуральную жидкость отделяют от биомассы микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика. Протеолитическая активность культуральной жидкости 36±6 ПЕ/г.
[63]1-й пассаж: Штамм В. megaterium 874 высевают на 2 матраса с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы и на 18-20 ч помещают в термостат при температуре 37C.
[64]2-й пассаж: Смытую с агара микробную взвесь засевают для подращивания на жидкой среде того же состава в объеме 5 л и растят 3-4 часа.
[65]3-й пассаж: Полученную культуру в дозе (1,0±0,5)×109 КОЕ используют в качестве посевного материала для проведения основного процесса в биореакторе. Выращивание проводят при температуре 37C, насыщении среды кислородом 70-80%, перемешивании со скоростью вращения мешалки 400 об/мин, в течение 16-20 ч до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.
[66]В полученной при этом способе культуральной жидкости уровень протеолитической активности колеблется в пределах 10±3 ПЕ/г, а количество микробных клеток составляет (20±5)×109 КОЕ.
[67]Протеолитическую активность культуральной жидкости определяют методом Ансона при нейтральных значениях pH.
[68]После завершения процесса культивирования клетки отделяют центрифугированием. После осаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют с использованием установки для ультрафильтрации.
[69]После микрофильтрации протеолитическая активность культуральной жидкости падает до 2,0-4,0 ПЕ/г из-за неспецифической сорбции фермента на мембранах.
[70]Для снижения неспецифической сорбции фермента мембраны установки перед ультрафильтрацией обрабатывают 0,5%-ным раствором альбумина, а затем отмывают нейтральным фосфатным буфером. Фермент концентрируют до объема достижения активности (36+6) ПЕ/г. После чего проводят стерилизующую фильтрацию. Разливают полученный продукт во флаконы по 10 мл и герметично укупоривают.
[71]Таким образом, исследования показали, что штамм В. megaterium 874 является продуцентом антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов. Штамм В. megaterium 874 обладает иммуномодулирующей способностью, и может быть использован для снижения аллергии. Штамм отличается выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др.. Продуцирует ферменты: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу; обладает лизоцимной активностью и характеризуется высокой степенью безопасности.
