[1]Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в пищевых продуктах, клиническом материале и других объектах.
[2]Для бактериологического контроля в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XII издание, регламентирующей перечень питательных сред для выявления Staphylococcus aureus, рекомендовано использование агара Фогель-Джонсона (Vogel-JohnsonAgarMedium) ОФС 42-0067-07.
[3]Ведущими зарубежными фирмами Merck «Микробиология, 2004/2005, стр. 102), HiMedia (HiMedia LaboratoriesPvt. Limited (Индия), 1993, стр. 241, Fluka (Scientifi cresearch 2005/2006, стр. 1858) и др. выпускаются: основа агара для стафилококков (по Вогелу-Джонсону),Vogel-Johnson Agar Base (V.J. Agar) нa основе гидролизатов казеина, дрожжевого экстракта и маннита. Высокая селективность сред обусловлена наличием хлорида лития и теллурита калия, а наличие в средах глицина и маннита компенсирует их ингибирующее действие на S. aureus.
[4]В России нет коммерческой сухой питательной среды для выявления патогенных маннитположительных стафилококков. Данное изобретение относится к дифференциально-диагностическим питательным средам, является аналогом агара Фогель-Джонсона, может быть использовано в клинической и санитарной микробиологии.
[5]Белковая основа и дрожжевой экстракт являются в среде источниками азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов. Фосфат калия обеспечивает буферные свойства среды, а высокая селективность обусловлена наличием хлорида лития и теллурита калия, которые вместе с гидролизатом казеина неглубокой степени расщепления, в течение первых 24 ч инкубации подавляют рост почти всех сопутствующих микроорганизмов. Возможное угнетение роста стафилококков на данной среде компенсируется наличием маннита и глицина. Стафилококки восстанавливают теллурит-анионтеллуритредуктазой и образуют колонии черного цвета. У патогенных коагулазоположительных стафилококков наблюдается четкая корреляция между восстановлением теллурита и ферментацией маннита с образованием кислоты, что выявляется по изменению цвета индикатора, содержащегося в среде, с красного на желтый.
[6]Стафилококки-сапрофиты (S. epidermidis и S. intermedins) образуют серо-черные колонии, но не ферментируют маннит.
[7]До настоящего времени в России для выделения стафилококков используются: элективно-солевой агар, стафилококкагар и питательная среда №10 различных производителей. Коммерческий выпуск сухого питательного агара для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в РФ отсутствует. Компонентный состав агара для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков различных фирм производителей в г/л представлен в таблице 1.
[8]
[9]Для приготовления коммерческой среды навески ингредиентов размешивают в 1 л дистиллированной воды. Среда стерилизуется автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Затем, после охлаждения до температуры 45°С, асептично добавляют 20 мл стерильного 1%-ного раствора теллурита калия.
[10]Биохимическая характеристика коммерческих сухих питательных агаров для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков представлена в таблице 2.
[11]
[12]Аминный азот в растворе глицина с концентрацией 10,0 г/л составляет 218 мг/%, или 2,18% в сухом препарате. Учитывая, что в коммерческих препаратах фирм Biolife и Fluka суммарное значение аминного азота глицина, белковой основы и дрожжевого экстракта составляет 4,3% и 2,9% соответственно, следует вывод:
[13]1. О несоответствии расчетных данных по аминному азоту в среде Vogel-Johnson Agar фирмы Fluka с экспериментально установленным содержанием аминного азота, что указывает на некорректный компонентный состав среды этой фирмы (содержание глицина в среде ниже заявленного).
[14]2. Рост стафилококков подавляется при добавлении во все импортные среды, регламентированного в инструкциях по приготовлению, 20,0 мл/л 1%-ного раствора теллурита калия или 10,0 мл/л 2%-ного раствора теллурита калия.
[15]Техническим результатом изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для выявления патогенных маннитположительных стафилококков, обладающей стабильностью результатов, сбалансированностью по питательным потребностям стафилококков, обеспечивающей ингибицию сопутствующей микрофлоры и выявление факторов патогенности при диагностике заболеваний, вызванных стафилококками. Технический результат достигается сбалансированностью компонентного состава среды в экспериментально установленных концентрациях с использованием в основном сырья отечественного производства. Среда содержит: панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления (ТУ 9385-075-78095326-2007), пептон мясной, дрожжевой экстракт, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, маннит, литий хлористый, глицин, феноловый красный и агар при следующем соотношении сухих компонентов, г/л:
[16]| Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени | |
| расщепления | 12,0-18,0 |
| Пептон мясной | 2,0-4,0 |
| Дрожжевой экстракт | 3,0-7,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 4,0-6,0 |
| Маннит | 7,0-13,0 |
| Литий хлористый | 2,5-3,5 |
| Глицин | 4,0-6,0 |
| Феноловый красный | 0,02-0,03 |
| Натрий хлористый | 2,0-4,0 |
| Агар | 9,0-15,0 |
| рН | 7.2±0.2 |
| Теллурит калия 2%-ный раствор | 5,0 мл |
[17]Для приготовления среды навески ингредиентов размешивают в 1 л дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Затем, после охлаждения среды до температуры 45°С, асептично добавляют 5,0 мл стерильного 2%-ного раствора теллурита калия (ТУ 9385-025-78095326-2007).
[18]Отличием предлагаемой среды от прототипа является использование в качестве белковой основы панкреатического гидролизата казеина неглубокой степени расщепления. Наиболее распространенным показателем степени гидролиза белка является отношение массовой доли аминного азота к массовой доле общего азота. Для триптона и пептона казеинового это соотношение составляет не менее 30%, при содержании NaM - (3,5-4,0)% и Nобщ - (11,0-12,0)%, а для панкреатического гидролизата казеина невысокой степени расщепления - не более 23%, при содержании NaM - (2,2-2,5)% и Noбщ - (10,0-10,5)%. Так как содержание свободных аминокислот находится в линейной зависимости от содержания аминного азота, а гидролизаты содержат еще свободные аминогруппы пептидов и белков, следовательно, при меньшей степени расщепления идентичного белкового сырья уровень свободных аминокислот будет ниже, а пептидов и белков выше. Таким образом, панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов. С целью поддержания уровня осмотического давления для сохранения жизнедеятельности микроорганизмов среда дополнительно содержит натрий хлористый. Определено количественное соотношение основных компонентов питательной среды, обеспечивающих рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры. В течение культивирования на данной питательной среде полностью отсутствует рост других бактерий, поэтому возможно проводить густой посев исследуемого материала.
[19]Для достижения этих целей и получения питательной среды для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в клиническом материале и других объектах, сухие ингредиенты смешивают в экспериментально установленных пропорциях.
[20]Пример 1. Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:
[21]| Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени | |
| расщепления | 12,0 |
| Пептон мясной | 2,0 |
| Дрожжевой экстракт | 3,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 4,0 |
| Маннит | 7,0 |
| Литий хлористый | 2,5 |
| Глицин | 4,0 |
| Феноловый красный | 0,02 |
| Натрий хлористый | 2,0 |
| Агар | 9,0 |
| рН | 7.2±0.2 |
| Теллурит калия 2%-ный раствор | 5 мл |
[22]Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Охлаждают до температуры 40-50°С, асептично добавляют 5,0 мл стерильного 2%-ного раствора теллурита калия и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают при комнатной температуре, соблюдая правила асептики в течение 40-60 мин.
[23]Предлагаемая среда, обеспечивает рост следующих тест-штаммов при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6:
[26]S. aureus 6538-P S. saprophyticusCCM 883 S. epidermidis ATCC 14990 и ингибицию при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов: Р. mirabilis 3177, P. vulgaris НХ 19 222, Е. faecalis ATCC 19433, P. aeruginosa 27/99, E. coli ATCC 25922, S. typhimurium 79, E. coli 3912/41 (055:K59) и B. subtilis 6633 из разведения 10-4 через 48 часов инкубации посевов при температуре (37±1)°С.
[27]При этом ферментирующие маннит стафилококки образуют на среде черные колонии, окруженные желтой зоной, а не ферментирующие маннит стафилококки - черные колонии без пожелтения среды вокруг, диаметром 1,0-3,0 мм.
[28]Результаты биологического контроля представлены в табл. 3.
[29]Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
[30]| Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени | |
| расщепления | 15,0 |
| Пептон мясной | 3,0 |
| Дрожжевой экстракт | 5,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 5,0 |
| Маннит | 10,0 |
| Литий хлористый | 3,0 |
| Глицин | 5,0 |
| Феноловый красный | 0,025 |
| Натрий хлористый | 3,0 |
| Агар | 12,0 |
| рН | 7.2±0.2 |
| Теллурит калия 2%-ный раствор | 5 мл |
[31]Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
[32]Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
[33]| Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени | |
| расщепления | 18,0 |
| Пептон мясной | 4,0 |
| Дрожжевой экстракт | 7,0 |
| Калий фосфорнокислый 2-замещенный | 6,0 |
| Маннит | 13,0 |
| Литий хлористый | 3,5 |
| Глицин | 6,0 |
| Феноловый красный | 0,03 |
| Натрий хлористый | 4,0 |
| Агар | 15,0 |
| рН | 7.2±0.2 |
| Теллурит калия 2%-ный раствор | 5 мл |
[34]Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.
[35]Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.
[36]| Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени | |
| расщепления | 9,0 |
| Пептон мясной | 1,0 |
| Дрожжевой экстракт | 1,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 3,0 |
| Маннит | 4,0 |
| Литий хлористый | 2,0 |
| Глицин | 3,0 |
| Феноловый красный | 0,015 |
| Натрий хлористый | 1,0 |
| Агар | 7,0 |
| рН | 7.2±0.2 |
| Теллурит калия 2%-ный раствор | 5 мл |
[37]Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды ведет к резкому ухудшению ростовых свойств агара для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков в отношении стафилококков и ингибирующих свойств к микробам ассоциантам.
[38]Результаты биологического контроля представлены в таблице 3.
[39]Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.
[40]| Панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени | |
| расщепления | 21,0 |
| Пептон мясной | 5,0 |
| Дрожжевой экстракт | 8,0 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 7,0 |
| Маннит | 16,0 |
| Литий хлористый | 4,0 |
| Глицин | 7,0 |
| Феноловый красный | 0,035 |
| Натрий хлористый | 5,0 |
| Агар | 17,0 |
| рН | 7.2±0.2 |
| Теллурит калия 2%-ный раствор | 5 мл |
[41]Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и показывают ухудшение ростовых свойств питательной среды для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков.
[42]Из таблиц видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает высокой чувствительностью, стабильностью ростовых свойств в отношении стафилококков, подавляет рост сопутствующих микроорганизмов.
[43]Изменение количественного соотношения компонентов предлагаемой среды ведет к нарушению биологических показателей качества питательной среды для селективного выявления патогенных маннитположительных стафилококков.
[44]Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается снижение чувствительности среды, выраженное в изменении количества и диаметра выросших колоний контрольных штаммов стафилококков, а также ухудшение ингибирующих свойств в отношении сопутствующей микрофлоры, при концентрации компонентов ниже минимальных параметров.
[45]Таким образом: по сравнению со средой прототипом Vogel-Johnson Agar фирмы Fluka предлагаемая питательная среда имеет ряд преимуществ:
[46]- в качестве белковой основы используют панкреатический гидролизат казеина неглубокой степени расщепления, который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов;
[47]- среда содержит в качестве стимулятора роста стафилококков, обладающих различными питательными потребностями, пептон мясной ферментативный;
[48]- содержание глицина составляет 5,0 г/л вместо 10,0 г/л, заявленных в коммерческих аналогах, что способствует снижению себестоимости среды без ухудшения чувствительности;
[49]- уменьшена концентрация 2%-ного раствора теллурита калия до 5,0 мл/л, что также способствует снижению себестоимости среды без ухудшения ингибиторных и дифференциально-диагностических свойств.
