[1]Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, микроскопическим грибам - продуцентам антибиотических соединений для получения лекарственных препаратов.
[2]На фоне общего снижения иммунной защиты организма наблюдают рост заболеваемости микозами [Blyth С., Hale К., Palasanthiran P., O'Brien Т, Bennett M. Antifungal therapy in infants and children with proven, probable or suspected invasive fungal infections// Cochrane Database Syst Rev. 2010. - P. 213-220] и инфекциями, вызываемыми резистентными формами патогенных бактерий [Антоньев А.А. Экспертиза трудоспособности при заболеваниях кожи / А.А. Антоньев.- M. - 1982. - 224 с.]. Довольно часты случаи смешанных инфекционных поражений, что требует одновременного применения противогрибковых и антибактериальных препаратов [Ruiz-Camps, Cuenca-Estrella Antifungals for systemic use // Enferm Infecc Microbiol Clin. 2009. V. 27(6). - P. 353-362.; Chagla Z., Salvadori M., Sontrop J.M., John M., Hussain Z., Chagla Y., Warshawsky В., Achiam C., Thompson B. Genetically typed community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a Canadian hospital //Can J Infect Dis Med Microbiol. 2009. - 20(3):e113-114]. Особенно опасно развитие грибных и бактериальных инфекций у иммуноскопрометированных и онкологических больных [Рунке M. Грибковые инфекции у иммуноскомпрометированных пациентов (Эпидемиология, диагностика, терапия, профилактика) Проблемы медицинской микологии. - 2000. - №1. - С. 4-16; В.М. Гельфонд Инфекционные осложнения у онкологических больных / Практическая онкология, Т. 10, №3 - 2009, с. 141-146]. Поэтому актуален поиск микробных продуцентов, обладающих способностью к синтезу соединений широкого спектра действия - антигрибного и антибактериального, в том числе и против резистентных форм бактерий.
[3]Известны штаммы микроскопических грибов Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acrenomium (Acremonium chrysogenum), Aspergillus fumigatus, Penicillium griseofulvum, P. nigricans - продуценты антибиотиков в отношении патогенных бактерий или грибов и простейших [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров // M.: Изд-во МГУ. - 2004. - 512 с.; Промышленная микробиология: учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» / З.А. Аркадьева, A.M. Безбородов, И.Н. Блохина и др.; под ред. Н.С. Егорова. M.: Высш. Шк., 1989. 688 с.].
[4]Известны штаммы МГ-97 Т. asperellum, обладающие фунгицидной активностью в отношении фитопатогенов рода Fusarium, Alternaria [Патент RU № 2171580. Штамм гриба Trichoderma sp.МГ-97, используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. / Громовых Т.И., Шмарловская С.В., Тюльпанова В.А., Громовых B.C. Заявка № 99126556/13 от 17.12.199 г. Опубл. 10.08.2001 г. Бюлл. № 22. 2001 г.] и Т. lignorum T13-82, проявляющий активность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий [Патент RU № 2121793. Степанова Е.В., Штерншис М.В., Репин В.Е. Штамм гриба Trichoderma lignorum, используемый против фитопатогенных грибов и бактерий. Опубл. 14.07.1998 г].
[5]Известны штаммы видов Trichoderma asperellum и Т. koningii, синтезирующие пептаиболы, которые ингибируют патогенные дрожжевые грибы и обладают антипротозойной активностью [Reino J.L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma I J.L. Reino, R.F. Guerriero, R. Hema`ndez -Gala`, I.G. Collado // Phytochem Rev. - 2008. - Vol. 7. - P. 89-123].
[6]Наиболее близким к предлагаемому изобретению, который следует принять за ближайший аналог, является штамм Trichoderma citrinoviride 2963, продуцирующий антибиотик из группы пептаиболов, который подавляет рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка [Алимова Ф.К. Trichoderma Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение / Ф.К. Алимова // Казань: Казанский гос. универ. - 2005. - 264 с]. Однако этот штамм не обладает антимикотической активностью в отношении условно-патогенных и патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов, а также против других, кроме метициллинрезистентного золотистого стафилококка, патогенных бактерий.
[7]Задачей настоящего изобретения является поиск штамма микроскопического гриба Trichoderma citrinoviride, продуцирующего антибиотики с высокой активностью к бактериям, включая резистентные формы стафилококка, и к условно-патогенным и патогенным мицелиальным и дрожжевым грибам.
[8]Техническим результатом изобретения является новый штамм TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 Trichoderma citrinoviride, который продуцирует пептаиболы с высокой антибактериальной активностью, в том числе к резистентным стафилококкам, и фунгицидной активностью - к условно-патогенным и патогенным видам грибов. Штамм предназначен для создания антибиотиков широкого спектра действия - антибактериального и антигрибного.
[9]Сущность изобретения состоит в том, что новый штамм Trichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 выращивают на жидкой питательной среде Сабуро при 22-25°С в течение 10-14 сут, от культуральной жидкости отделяют грибную биомассу фильтрованием, антибиотические соединения экстрагируют этилацетатом из отфильтрованной культуральной жидкости (при соотношении экстрагента к культуральной жидкости 3:1), полученные экстракты упаривают досуха под вакуумом при 42°С, сухой препарат хранят при 5°С. Для определения антибиотической активности применяют стандартный метод дисков, которые пропитывают экстрактом (препаратом), растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Об антибиотической активности препарата судят по величине диаметра зон подавления диском тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров.// М.: Изд-во МГУ. - 2004. - 512 с.]. Получают более высокое или сопоставимое действие препарата Trichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 в сравнении со стандартными дисками с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл) и с ампициллином («НИИ Пастера», 10 мкг/мл). В препарате методами масс-спектрометрии устанавливают наличие пептаиболов [Т. Neuhof, R. Dieckmann, I. Druzhinina, С.P. Kubicek, Н. von Do¨hren Intact-cell MALDI -TOF mass spectrometry analysis of peptaibol formation by the genus Trichoderma. Hypocrea: can molecular phylogeny of species predict peptaibol structures? // Microbiology. - 2007. - Vol. 153. - P. 3417-3437; N. Stoppacher, S. Zeilinger, М. Omann, P. Lassahn, A. Roitinger, R. Krska, R. Schuhmacher Characterisation of the peptaibiome of the biocontrol fungus Trichoderma atroviride by liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 1889-1898].
[10]Тест-культурами берут коллекционные штаммы патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, С.tropicales INA 00763, условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A. terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8К и тест-культур штаммов грамположительных бактерий - Bacillus subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, метициллинрезистентного штамма Staphylococcus aureus FDA 209P, Bacillus coagulans 429, грамотрицательных бактерий - Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461.
[11]Штамм Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 получен как моноспоровый клон путем селекции на антимикробную и противоопухолевую активность из штамма TV4-1, выделенного ранее из мульчи лесопитомника Каа-Хемского лесхоза республики Тыва РФ.
[12]Штамм Trichoderma citrinoviride депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ F-1228.
[13]Штамм TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 идентифицирован как Trichoderma citrinoviride на основе секвенирования ITS1 и ITS2 участков генома и культурально-морфологических признаков.
[14]Штамм Trichoderma citrinoviride Bissett ВКПМ F-1228 относится к митоспоровым грибам - анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Hypocrea, семейства Нуросгеасеае, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota (www.indexfungorum.org).
[15]Культурально-морфологические признаки
[16]Макроморфологические признаки. На среде Чапека при 25°С рост быстрый, край колонии бахромчатый, мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый, ватообразный, цвет спороношения яркий - яблочно-зеленый или зеленовато-желтый, образует пигмент желтого цвета, экссудат, ограниченный в мелких капельках.
[17]Микроморфология. Гифы бесцветные, гладкие, 2-8 µm в диаметре. Конидиеносцы неокрашенные, гладкие, 2,5-5 µm в диаметре. Главная ось длинная, ветвится нерегулярно, на конидидиеносце по одной-две веточки. Фиалиды расположены прямо на конидиеносце или на веточках по одной, реже мутовками по две-три. Спороношение в крупных подушечках, конидии мелкие, гладкие, 2.5-3.5 X 1.5-2.8 µm, образует хламидоспоры.
[18]Для культивирования штамма, помимо дианостической среды Чапека, используют сусло-агар и среду Сабуро.
[19]Молекулярно-генетические признаки
[20]Штамм имеет следующую последовательность, зарегистрированную в NCBI под шифром KF928670:
[21]
[22]Степень сходства нового штамма TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 с коллекционными штаммами вида Trichoderma citrinoviride составляет 98,0%, что указывает наряду с культурально-морфологическими свойствами его принадлежность к Trichoderma citrinoviride.
[23]Физиолого-биохимические признаки
[24]Аэроб, оптимальные температура роста 25-26°С, рН 5,5-5,8. Штамм усваивает различные легкодоступные углеводы - маннозу, рафинозу, лактозу и другие, минеральные и органические (пептон) источники азота, устойчив к повышенным концентрациям кадмия, никеля и свинца в среде. Хорошо растет и спороносит на средах, содержащих сусло и/или глюкозу.
[25]Штамм хранят на сусло-агаре в пробирках при температуре 5-6°С с периодическим пересевом (1 раз в 6-12 месяцев). Для длительного хранения используют методы лиофилизации и криоконсервации.
[26]Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом.
[27]Изобретение подтверждают следующие примеры
[28]Пример 1. Определение фунгицидной активности штамма TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 Т. citrinoviride в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных грибов
[29]В качестве посевного материала используют 5-суточную культуру, полученную на сусло-агаре. Штамм выращивают в жидкой стандартной среде Сабуро (300 мл) в стационарных условиях в колбах на 500 мл в течение 14 суток при 25°С. Биомассу мицелия и спор отделяют фильтрованием культуральной жидкости через мембранные фильтры на воронке Зейца под вакуумом. Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральную жидкости (кж) и грибной биомассы экстрагируют этилацетатом (при соотношении экстрагента и культуральной жидкости 3:1). Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе «Rotavapor-RBüchi» (Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют метод дисков [Егоров, 2004]. Диски пропитывают препаратом, растворенным в 60% водном растворе этанола и сушат их на воздухе в стерильных условиях.
[30]Тест-объектами берут коллекционные штаммы патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, С.tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A.terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8K. Контролем служат стандартные диски с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 5-7 сутки. Чашки Петри с дрожжами инкубируют при 37°С на среде Сабуро, с патогенными и условно-патогенными грибами, микроскопическими грибами при 28°С на среде Чапека.
[31]Этанольные и метанольные экстракты из мицелия Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 получают экстракцией метанолом или этанолом в течение 24 часов (1 г мицелия на 100 мл экстракта) и устанавливают, что они не проявляют антимикотической активности или она следовая.
[32]Экстракты культуральной жидкости штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 обладают широким спектром фунгицидной активности в отношении патогенных и условно-патогенных видов грибов. Величины зоны подавления роста тест-культур С. albicans ATCC 2091, Candida tropicales INA 00763 и A. niger INA 00760 - 25±2 мм, 28±2 мм и 31±2 мм, соответственно. Штамм ингибирует рост всех условно-патогенных тест-культур, но особенно эффективен против A. fumigatus 4K, A. tereus 4K, A. ustus 8K. Антибиотическая активность препарата из культуральной жидкости citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 в подавляющем большинстве случаев превышает активность амфотерицина В (таблица 2).
[33]
[35]Опыт проводят согласно примеру 1, но штамм Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 культивируют 10 суток при 25°С.
[36]Экстракты культуральной жидкости штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 обладают широким спектром фунгицидной активности в отношении патогенных и условно-патогенных видов грибов. Величины зоны подавления роста тест-культур патогенных грибов С.albicans ATCC 2091 и A. niger INA 00760 составляют 15±2 мм и 25±2 мм, соответственно. На 10-е сутки штамм не активен в отношении С. tropicales INA 00763.
[37]
[38]
[40]Опыт проводят согласно примеру 1, но в качестве тест-культур используют штаммы грамположительных бактерий - Bacillus subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, метициллинрезистентный штамм Staphylococcus aureus FDA 209P, Bacillus coagulans 429, грамотрицательных бактерий - Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461.
[41]Тест-культуры В. subtilis ATCC 6633 и В. mycoides 537 выращивают на среде, приготовленной на бульоне Хоттингера в разведении 1:2 следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0; NaCl - 2,0; агар - 20,0. Е. coli ATCC 25922, M. luteus NCTC 8340, S. aureus PDA 209P, С terrigena ATCC 8461- на мясо-пептонном агаре (МПА) («ЗАО НИЦФ», Россия). Используют для засева суточные культуры бактерий. Бактерии выращивают в пробирках со скошенным питательным агаром, затем клетки суспендируют в физиологическом растворе до мутности 0,5 по стандарту McFarland (1,5×108КОЕ/мл) и используют в течение 15 минут. Бациллы, стафилококки и микрококки культивируют при 37°С, Е. coli - при 42°С, В. coagulans - при 55°С. Инокуляцию культур на чашку осуществляют штрихами в 3-х направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси. Антибактериальное действие экстрактов штамма оценивают принятым методом с помощью стерильных бумажных дисков, смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях. Контролем служат стандартные диски с ампициллином («НИИ Пастера», 10 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 2-е сутки дисков [Егоров, 2006].
[42]Этанольные и метанольные экстракты из мицелия Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 не проявляют антибактериальной активности или она следовая.
[43]Экстракт КЖ предлагаемого штамма подавляет рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка S.aureus FDA 209P, который вызывает опасные «госпитальные» инфекции (табл. 3). Величина зоны подавления его роста составляет 35 мм от экстракта в сравнении с 15 мм от ампициллина. Штамм также обладает более высокой антибиотической активностью к В. subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537 и С. rigena ATCC 8461 и близкой к ампициллину к другим тест-бактериям.
[44]
[46]Опыт проводят согласно примеру 3, но культивирование предлагаемого штамма проводят 10 суток при 22°С.
[47]Экстракт КЖ предлагаемого штамма подавляет рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка S. aureus FDA 209P, который вызывает опасные «госпитальные» инфекции (табл.4). Величина зоны подавления его роста составляет 30 мм от экстракта в сравнении с 15 мм от ампициллина. Штамм также проявляет более высокую антибиотическую активность к В. coagulans 429, В. subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537 и С, rigena ATCC 8461 и близкую к ампициллину к другим тест-бактериям.
[48]
[49]Пример 5. Выделение и идентификация пептаиболов из этилацетатных экстрактов культуральной жидкости штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228
[50]Для выделения активных фракций пептаиболов из этилацетатных экстрактов применяют тонкослойную хроматографию. Образцы экстрактов (10-15 мкл) наносят на пластинки DCAlufoilien Kieselgel-60 ("Merck", Германия) размером 15×15 см с тонким слоем силикагеля и помещают системы хлороформ : метанол (40:10) и этилацетат : метанол (35:5). Биоавтографию антибиотических веществ осуществляют с тест-организмами В. subtilis ATCC 6633 и A. niger INA 00760. Активную фракцию снимают шпателем с пластинки с ТСХ, затем эллюируют в 60% этаноле, фильтруют через мембранные фильтры и упаривают досуха под вакуумом при 42°С, затем растворяют в 60% этаноле.
[51]Молекулярные массы активных соединений определяют на масс-спектрометре Ultraflex II MALDI ToF/ToF "Bruker Daltonics" (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd) в режиме получения положительных ионов с использованием рефлектрона. На мишени смешивают по 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2.5-дигидроксибензойной кислоты с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле с 0.5%-ной трифторуксусной кислотой и полученную смесь высушивают на воздухе.
[52]ИК-спектры соединений активных фракций получают на приборе ИК-Фурье спектрометре Nicolet - iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием детектора DTGS, светоделителя КВг, и приставки Smart Performer, оснащенной ZnSe кристаллом. Измерение проводят при разрешении 4 см-1; зона спектра 3000-650 см-1. ИК-спектры соединений обрабатывают по программе OMNIC-7.0, их расшифровку делают по Тарасевичу [Тарасевич Б.Н. ИК спектры основных классов органических соединений /Б.Н. Тарасевич // Справочные материалы. МГУ, 2012. - 55 с].
[53]Присутствующие во фракции активные компоненты имеют следующие (Да) массы: 1701, 1712, 1714, 1724, 1726, 1728, 1730, 1736, 1742, 1743, 1749, 1752, 1754, 1756, 1766, 1768, 1770, 1784 (фиг. 1).
[54]Для ИК-спектра активной фракции характерно присутствие следующих полос поглощения (νmax, см-1): сильно выраженная полоса поглощения в области 3360-3370 см-1, что соответствует валентным колебаниям ОН группы, небольшие пики при 2854 см-1 могут вызываться колебаниями алифатических групп СН2; пик при 1739 см-1 соответствует валентным колебаниям С=O в СООН у дикарбоновых кислот, полоса в области 1600-1560 см-1 соответствует колебаниям СО2 группы у аминокислот, поглощение с максимумом в области 1261 см-1 может быть вызвано валентными колебаниями С-О первичных и вторичных спиртовых групп.
[55]Сопоставление данных масс-спектра и ИК-спектра активной фракции этилацетатных экстрактов КЖ штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 BKHMF-1228 с таковыми у известных соединений, а также наличие у них антибактериальной и фунгицидной активности свидетельствует, что антибиотические соединения в экстракте культуральной жидкости принадлежат к группе мембраноактивных пептидов - пептаиболов [Т. Neuhof, R. Dieckmann, I. Druzhinina, С.P. Kubicek, H. von Do¨hren Intact-cell MALDI - TOF mass spectrometry analysis of peptaibol formation by the genus Trichoderma. Hypocrea: can molecular phylogeny of species predict peptaibol structures? // Microbiology. - 2007. - Vol. 153. - P. 3417-3437].
[56]Фиг. 1. Масс-спектрометрический анализ фракции Т. citrinoviride TYVI 4/11, обладающей фунгицидной активностью.
[57]Фиг. 2. ИК-спектр активной фракции Т. citrinoviride TYVI 4/11, обладающей фунгицидной активностью.
