[1]Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим бактериальным препаратам, которые могут найти применение в ветеринарии.
[2]Пробиотическими являются бактериальные препараты на основе штаммов микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью к энтеропатогенным бактериям.
[3]В классических исследованиях И.А. Мечникова эти свойства были изучены на примере молочнокислых бактерий. Затем круг продуцентов пробиотических препаратов был расширен.
[4]Пробиотики на основе штаммов спорообразующих бактерий сравнительно недавно стали применяться в ветеринарии. Антагонистические свойства этих бактерий привлекают к себе внимание многих разработчиков
[5]Сложность лечения инфекционных заболеваний заключается в возникновении у патогенных микроорганизмов полирезистентности к антибиотикам. Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм животных и вызывают дисбактериоз кишечника, отягчающий течение основного заболевания. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к решению данной проблемы.
[6]Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенных бактерий и грибов, в медицине, ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных [1].
[7]В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus, находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных. Предложены многочисленные варианты пробиотиков из спорообразующих бактерий: бактиспорин [5], бациллоспорин [6], споролакт [7], споробактерин [8], субалин [9]. Основу вышеперечисленных препаратов-пробиотиков составляют разные штаммы бактерий рода Bacillus, обладающие антагонизмом в отношении патогенных бактерий.
[8]Для повышения эффективности профилактики и лечения дисбактериозов предлагают бациллярные препараты из двух штаммов бактерий рода Bacillus - Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Считается, что бактерии вида Bacillus subtilis - строгие аэробы, тогда как представители вида Bacillus licheniformis могут расти в микроаэрофильных условиях. Считается также, что эти свойства двух видов усиливают эффективность пробиотической терапии [2-4]. Подавляющее большинство представителей рода Bacillus безвредны для теплокровных животных, проявляют антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, устойчивы к литическим ферментам, технологичны в производстве, стабильны при хранении, экологически безопасны.
[9]Учитывая возможность применения антибиотиков в кормопроизводстве, весьма перспективно использование в составе пробиотических препаратов штаммов, обладающих как высокой антагонистической активностью против энтеропатогенов, так и полирезистентностью к антибиотикам.
[10]В качестве прототипа можно рассматривать штамм Bacillus licheniformis ВКПМ-2336, входящий в состав ветеринарного препарата Ирилис [11].
[11]Задачей настоящего изобретения является получение штамма Bacillus licheniformis, обладающего антагонистической активностью к широкому спектру патогенных тест-организмов, а также резистентностью к наиболее широко применяемым антибиотикам.
[12]Технический эффект, который может быть получен при использовании полученного штамма, заключается в повышении эффективности лечения за счет возможности сочетанного применения бактериального препарата с антибиотиками.
[13]Для решения указанной проблемы предлагается штамм Bacillus licheniformis ВКМ B-2712D. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.
[14]Идентификация штамма была осуществлена по «Определителю микроорганизмов» Берги (1997 г.).
[15]Исходный почвенный изолят выделен в Кировской области. Почвенный изолят был подвергнут мутагенному воздействию нитрозогуанидина (доза от 40 до 100 мкг/мл) с последующим скринингом на селективных средах.
[16]Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма: клетки палочковидные прямые, размер: 0,5-0,7×2,0-3,0 мкм, образует термоустойчивые эндоспоры, не более 1 в клетке-спорангии, спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе, расположение центральное. Клетки неподвижны. На стандартных плотных питательных средах (МПА, LB, ГРМ-1) образует мелкие прозрачные выпуклые колонии. Колонии врастают в агар. Каталаза: положительный_тест, факультативный анаэроб. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, арабиноза, ксилоза, манит, декстроза, казеин, крахмал. Оптимум pH для роста 6,0-8,0, температура: от +4°C до +45°C.
[17]Резистентность к антибиотикам: стрептомицин -10 мкг/мл, налидиксовая кислота -20 мкг/мл.
[18]Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
[19]Пример 1. Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонистическую активность проверяли методом отсроченного антагонизма.
[20]Для этого взвесь клеток, смытых с агаровой среды, высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°C в течение 48 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18-20 часов инкубирования при 37°C по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры. Результаты приведены в таблице.
[21]Исследование антагонистических свойств культуры
[22]| Задержка роста тест-культур, мм |
| E. coli | S. typhimurium | S. typhi | Ps. aeruginosa | St. aureus | L. monocytogenes |
| 0 | 0 | 8 | 0 | 13 | 15 |
[23]Пример 2. Была изучена резистентность к следующим антибиотикам: канамицин, стрептомицин, гентамицин, триметоприм, налидиксовая кислота, цефазолин, ампициллин, бензилпенициллина натриевая соль. Проверку осуществляли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом при различных концентрациях антибиотиков. Было установлено, что штамм обладает резистентностью к антибиотикам: стрептомицин - 10 мкг/мл, налидиксовая кислота - 20 мкг/мл.
[25]Активности ферментов в культуральной жидкости определяли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом в течение двух суток. Были определены следующие значения ферментативной активности:
[26]α - амилазная активность - 0,1 Ед/мл среды при pH 6,0, протеазная активность - 1,728 Ед/мл среды при pH 7,0.
[27]Следует отметить высокую протеазную активность штамма Bacillus licheniformis ВКМ B-2712D.
[29]1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.О. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журн. - 1993. - №4. - С.92-112.
[30]2. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г., Полушкина А.Ф., Печуркина Н.И. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология. 2001, №2, С.48-56.
[31]3. Hong, Н.А., Due L.H., Cutting S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics // FEMS Microbiol.Rev. - 2005. - Vol.29, N 4. - P. 813-835.
[32]4. Probiotics Microbes: The Scientific Basis / RJ. Collier, et al. // A Report from American Academy of Microbiology - Washington, 2006. - 28 p.
[33]5. Патент РФ 2130316. Лечебно-профилактический биопрепарат бактиспорин. A61K 35/74, БИ №14,1999, приор. 23.01.97.
[34]6. Патент СССР 1710575. Штамм бактерий Bacillus sp - компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергий, C12N 1/20, БИ №5,1992.
[35]7. Патент РФ 2035186. Профилактический биопрепарат споролакт. A61K 35/66, БИ №14, 1995.
[36]8. Алешкин, А.В., Афанасьев, С.С., Давыдкин, В.Ю., Манько, Т.Н., Давыдкин, И.Ю. Бактерийный препарат нового поколения «Споробактерин» // Мед. картотека. - 2003. - №4
[37]9. Патент РФ №2035185 Профилактический биопрепарат Субалин. -1995 Приор. 31.01.1992.
[38]10. Патент РФ 2115725. Штамм Bacillus subtilis, резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактеральной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов. Приор. 23.07.1997.
[39]11. Гатауллин А.Г. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков // Дисс. канд. биол. наук Москва, 2005 г.
