[2]Техническое решение относится к биотехнологии, а именно к системам на основе микроорганизмов, иммобилизованных в матрицу синтетического носителя.
[3]Известна полимерная композиция для иммобилизации микроорганизмов на основе криогеля поливинилового спирта (ПВС). Криогели ПВС образуются при замораживании 10-20% водных растворов при -20 - -30°С в течение 10-24 часов и последующем оттаивании при 4-20°С. [Пат. РФ 2253677. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора]. Иммобилизованные в данной композиции микроорганизмы мало пригодны для применения в качестве рецепторных элементов биосенсорных анализаторов, так как в виде тонких пленок криогель ПВС обладает очень низкой механической прочностью.
[4]Известно, что микроорганизмы иммобилизуют в гель ПВС, выливая 20% водный раствор ПВС, содержащий живые клетки, при перемешивании в раствор борной кислоты и выдерживая в течение 1 часа для формирования сферических гранул. [J.Wang, Y.Zhang, Y.Wang, R.Xu, Z.Sun, Z.Jie. An innovative reactor-type biosensor for BOD rapid measurement // Biosensors and Bioelectronics. 2010. V.25 (7). p.1705-1709]. Недостатком этого метода является губительное действие борной кислоты на многие микроорганизмы.
[5]Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является полимерная композиция для иммобилизации ферментов, основанная на сополимере ПВС и N-винилпиридина [В.Li, L.Niu, W.Kou, Q.Deng, G.Cheng, S.Dong. Synthesis of a self-gelatinizable grafting copolymer of poly(vinyl alcohol) for construction of an amperometric peroxidase electrode // Analytical biochemistry. 1998. 256. p.130-132]. Для приготовления сополимера поливинилового спирта с N-винилпиридином к 20 мл 5%-ного водного раствора поливинилового спирта прибавляют 5 мл 1 моль/л раствора азотной кислоты, 0,2 мл церия аммония-нитрата [(NH4)Се(NO3)6] (Т=0,1 г/мл) и небольшое количество 4-винилпиридина. Смешивание проводят при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов. Полученную смесь осаждают метанолом и собирают фильтрацией. Гомополимер отмывают от непрореагировавшего ПВС извлечением при помощи метанола в аппарате Сокслета. Для приготовления рецепторного элемента биосенсора 2 мг пероксидазы хрена растворяют в 500 мкл 5% водного раствора сополимера ПВС и N-винилпиридина. Полученный рецепторный элемент выдерживают 24 часа при температуре 4°С.
[6]Процедура приготовления рецепторных элементов на основе описанной полимерной композиции является трудоемкой и требует больших временных затрат, кроме того, приготовленные данным способом рецепторные элементы обладают невысокой долговременной стабильностью и чувствительностью.
[7]Задачей технического решения является повышение основных характеристик биосенсора путем получения полимерной композиции на основе ПВС для иммобилизации микроорганизмов, обеспечивающей отсутствие токсичного действия на биоматериал.
[8]Технический результат, который может быть получен при использовании заявляемой композиции для получения полимерной пленки, заключается в том, что полученные тонкие, эластичные, не растворимые в воде пленки могут быть использованы для иммобилизации микроорганизмов при создании рецепторных элементов биосенсорных анализаторов.
[9]Сущность технического решения заключается в том, что композиция для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах состоит из поливинилового спирта и сополимера, в качестве сополимера содержит N-винилпирролидон, при этом исходные компоненты взяты в мольном соотношении ПВС:N-ВП 239:(9,0-56,2).
[10]На фиг.1 представлен механизм сополимеризации, приводящий к образованию сетчатой структуры композиции для получения полимерной пленки.
[11]В таблице 1 приведены характеристики биосенсора на основе иммобилизованных в представленной композиции для получения полимерной пленки бактерий Gluconobacter oxydans при анализе глюкозы.
[12]Композицию для получения полимерной пленки получают из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном. Модификацию проводят в токе азота в присутствии нитрата церия-аммония в качестве катализатора при мольном соотношении реагентов ПВС:N-ВП:катализатор - 239:(9,0-56,2):(0,7-6,0). Для приготовления рецепторных элементов биосенсора полученный раствор композиции для получения полимерной пленки смешивают с бактериальными клетками и высушивают в течение 2 ч при 20°С.
[13]При приготовлении рецепторных элементов биосенсоров с иммобилизованными микроорганизмами с использованием описанной композиции для получения полимерной пленки не требуется длительное замораживание, что позволяет упростить процедуру иммобилизации и избежать потери чувствительности биорецепторных элементов, вследствие губительного действия низкой температуры на микроорганизмы. Полученные с использованием описанной композиции для получения полимерной пленки тонкие пленки с иммобилизованными микроорганизмами используют в работе в качестве рецептора на кислородном электроде.
[15]Для приготовления ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном, к 20 мл 5% водного раствора ПВС (молярная масса 70000-100000) прибавляли 0,2-0,8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH4)2Се(NO3)6 (Т=0,1 г/мл) и 0,3-0,1 мл N-винилпирролидона при постоянном перемешивании. Перемешивание проводили при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов.
[16]Для иммобилизации бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius BKM В-1280 раствор поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, охлаждали до комнатной температуры, отбирали необходимое количество микропипеткой и добавляли в него бактериальные клетки Gluconobacter oxydans (30 мг биомассы на 250 мкл полученного раствора полимера), смесь переносили на предметное стекло и высушивали в течение 2 часов при 20°С. Из полученной пленки толщиной 0,2-0,5 мм вырезали рецепторные элементы размером 3×3 мм, которые хранили в холодильнике (+4°С) в сухом виде или в фосфатно-цитратном буферном растворе (рН=6,0).
[17]Кислородный электрод с размещенным на нем биорецептором погружали в измерительную ячейку объемом 3 мл, содержащую 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.5), и регистрировали силу тока при добавлении разных концентраций определяемых веществ.
[18]Таким образом, разработанная композиция для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах обеспечивает высокую чувствительность биосенсора при стабильной работе до 40 суток.
[19]
