[1]Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Техническим результатом изобретения является увеличение уровня антибиотической активности, сокращение времени ферментации и уменьшение содержания предшественника в культуральной жидкости, что достигается использованием нового штамма - продуцента цефалоспорина С Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, новой технологии биосинтеза антибиотика и приводит в целом к повышению рентабельности промышленного производства субстанции цефалоспорина С.
[2]Мицелиальные грибы Acremonuim chrysogenum являются продуцентами β-лактамного антибиотика цефалоспорина С. Природный цефалоспорин С обладает слабой антибактериальной активностью, но он является исходным материалом для химического синтеза различных лекарственных субстанций, обладающих широким спектром антибактериального действия и более устойчивых к действию β-лактомаз, чем пенициллины. Благодаря этому β-лактамные антибиотики цефалоспоринового ряда нашли широкое применение в антимикробной химиотерапии (1).
[3]Процесс микробиологического образования цефалоспорина C с помощью гриба-продуцента из рода Acremonium широко изучен и документирован. Известна способность различных штаммов Acremonium chrysogenum к биосинтезу цефалоспорина С. Одним из близких является штамм Acremonium chrysogenum 12/9.
[4]Культивирование гриба Acremonium chrysogenum осуществляют на питательных средах, содержащих различные источники углерода, азота, неорганические соли, аминокислоты, жиры в условиях интенсивной аэрации и перемешивания. Изучению влияния компонентного состава питательных сред посвящено большое число исследований (2, 3).
[5]Образование цефалоспорина С у многих штаммов Acremonium chrysogenum стимулируется добавлением в среду культивирования аминокислоты метионин. Одним из механизмов этого влияния на синтез цефалоспорина С является роль метионина в процессе дифференциации культуры (4). Образование из фрагментируемого мицелия клеток типа артроспор в присутствии метионина является определяющим фактором развития высокопродуктивных культур. Однако добавление метионина в питательную среду удорожает процесс и неблагоприятно влияет на экологию окружающей среды за счет выделения меркаптана.
[6]Наиболее близким к заявляемому является способ получения цефалоспорина C с использованием культуры Acremonium chrysogenum при культивировании продуцента в жидкой питательной среде в отсутствие метионина. Процесс антибиотикообразования заканчивается на 140 часов роста при активности культуральной жидкости 24000 мкг/мл (5). Недостатком этого процесса является длительность ферментации при относительно невысоком уровне активности культуральной жидкости.
[7]Задача, решение которой предусмотрено настоящим изобретением, заключается в интенсификации процесса биосинтеза цефалоспорина С путем использования нового штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D и оптимизации питательных сред в условиях глубинного культивирования. Сущность изобретения заключается в том, что согласно способу микробиологического синтеза цефалоспорина С используют новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, а в составе питательных сред используют новые соединения различной химической природы.
[8]Новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D отличается от штамма Acremonium chrysogenum 12/9 повышенной чувствительностью к метионину, замедленным ростом на твердых питательных средах, ускоренным биосинтезом цефалоспорина С при культивировании в глубинных условиях культивирования и более высоким уровнем антибиотикообразования. Штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками:
[9]на среде, содержащей бакто-пептон 10 г/л, мальтозу 40 г/л, мальт-экстракт сухой 20 г/л на 15 сутки роста имеет диаметр колонии 0,7 мм. Колонии приподнятые, конусообразные, нерегулярно складчатые, поверхность молодых колоний игольчатая, цвет слоновой кости или розоватые, пигмента в среду не выделяют, воздушный мицелий очень слабо выраженный. Прототроф, строгий аэроб, оптимальная температура роста на агаровой среде - 24-28°С. Видимый рост колоний проявляется на 8 сутки инкубации при 28°С. На вышеприведенной среде с добавлением 0,1% метионина на 15 сутки роста диаметр колоний в среднем 0,9 мм. Колонии приподнятые, слабо нерегулярно складчатые, светло бежевые, воздушный мицелий практически отсутствует, пигмента в среду не выделяет (таблица 1).
[10]| Таблица 1 |
| Сравнение скорости роста и накопления биомассы штаммов 12/9 (родительский штамм) и ВКМ F-4081D (новый штамм) |
| Штамм | Появление видимого роста колоний на среде без метионина (сутки) | Диаметр (мм) колоний на агаровой среде на 15 сутки роста | Сухая биомасса, при ферментации в колбах (г/мл) |
| Среда без метионина | Среда с метионином | На посевной среде, 48 час | На ферментационной среде, 120 час |
| без метионина | с метионином |
| 12/9 (контроль) | 4 | 3,9 | 2,7 | 0,0474 | 0,1176 | 0,1206 |
| ВKМ F-4081D (новый штамм) | 8 | 2.8 | 0,9 | 0,0314 | 0,1087 | 0,1012 |
[11]Указанный штамм получен путем многоступенчатой селекции на средах, содержащих низкие концентрации метионина: 0,3-0,01%. Штамм Acremonium chrysogenum депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВKМ) под номером F-4081D.
[12]Биосинтез цефалоспорина С, с использованием нового штамма Acremonium chrysogenum ВKМ F-4081D, осуществляют на ферментационной питательной среде, содержащей источники углеводов, такие как глюкоза, крахмал кукурузный, декстрин, и источники азота, такие как кукурузный экстракт, Фармамедиа, сульфат аммония. Питательная среда содержит также неорганические соли, такие как фосфорнокислый калий, сернокислый магний, микроэлементы, и отличается от заявленной в прототипе (5) тем, что в качестве растительного жира содержит рапсовое масло. Кроме того, в среду вводят сложные органические соединения такие, как фосфолипид и ситостерин. Фосфолипиды являются источником «метаболического топлива», наряду с полиненасыщенными жирными кислотами входят в состав рапсового масла. Ситостерин, добавленный к ферментационной среде, способствует более раннему началу дифференциации мицелия и образованию артроспороподобных клеток с укороченной стадией прорастания в гифы. Это имеет большое значение в условиях промышленного производства, так как раннее образование артроспор и быстрая смена генераций улучшает реологические свойства культуральной жидкости, в первую очередь вязкость, что немаловажно для протекания биохимических процессов в стадии ферментации и дает возможность заканчивать биосинтез на более ранний срок при достижении высокого уровня антибиотикообразования. Культивирование осуществляют в колбах при перемешивании при температуре 24-28°С или в ферментаторе вместимостью 20 л в условиях регулируемой ферментации. Активность культуральной жидкости в нерегулируемом процессе в колбах 15000-17000 мкг/мл на 115-120 час, при культивировании в ферментаторе 32000-34000 мкг/мл на 106-110 часов. Количество цефалоспорина определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
[13]Преимуществами заявляемого способа являются:
[14]1. Новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D со сниженным уровнем образования мицелия в поверхностных и глубинных условиях роста.
[15]2. Увеличение уровня антибиотикообразования по сравнению с прототипом при нерегулируемом процессе биосинтеза в 2 раза, а в условиях регуляции на 40%.
[16]3. Сокращение времени ферментации на 20%.
[17]4. Промежуточный продукт дазацетилцефалоспорин С образуется в количестве не более 5%.
[18]Следующие примеры иллюстрируют антибиотикообразующую способность штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D.
[20]Культуру штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D смывают с агаровой среды, суспензию дезинтегрируют, вносят в колбы Эрленмейера вместимостью 0,75 л, содержащие 0,04 л посевной среды следующего состава, г/л:
[21]| дрожжевой экстракт | 28,0 |
| пептон (мясной) | 10,0 |
| мальт-экстракт | 28,3 |
| мел | 4,0 |
| рапсовое масло | 3,0 (вносится в каждую колбу отдельно) |
| вода дистиллированная | остальное. |
[22]Значение pH доводят до стерилизации до 7,0-7,1 конц. NaOH.
[23]Инокулюм выращивают 48 часов при 28°С на качалке, делающей 230-240 об/мин. В выросшем посевном мицелии определяют количество биомассы методом центрифугирования при 3000 об/мин 15 мин. Биомасса составляет 28-30 об.%.
[24]Инокулюм в количестве 15 об.% вносят в колбу Эрленмейера вместимостью 0,75 л, содержащую 0,04 л питательной среды следующего состава, г/л:
[25]| кукурузный экстракт | 93,0 |
| крахмал кукурузный | 32,0 |
| Фармамедиа | 12 |
| декстрин | 43,0 |
| глюкоза | 4,0 |
| СаСО3 | 11,0 |
| (NH4)2SO4 | 13,5 |
| MgSO4 | 3,5 |
| KH2PO4 | 4,0 |
| CuSO4·5H2O | 0,017 |
| ZnSO4·7H2O | 0,16 |
| MnSO4·7H2O | 0,03 |
| FeSO4·7H2O | 0,08 |
| масло рапсовое | 30,0 (вносится в каждую колбу отдельно) |
| вода дистиллированная | остальное |
[26]Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.
[27]Ферментацию осуществляют на круговой качалке, делающей 230-240 об/мин, первые сутки при 28°С, затем до конца ферментации при 24°С. Содержание цефалоспорина С в культуральной жидкости на 115 часов составляет 15500 мкг/мл.
[29]Для выращивания инокулюма используют среду следующего состава, г/л:
[30]| Сахароза | 32,0 |
| мясной экстракт | 17,0 |
| кукурузный экстракт | 6,0 |
| рапсовое масло | 3,0 (вносится в каждую колбу отдельно) |
| вода дистиллированная | остальное |
[31]Значение рН до стерилизации 7,0.
[32]Инокулюм выращивают 48 часов при 28°С на качалке с 230-240 об/мин. Количество биомассы на 48 часов роста составляет 28-29 об.%. Ферментацию проводят как указано в примере №1. Активность культуральной жидкости на 120 часов 15000 мкг/мл.
[34]Инокулюм культуры Acremonium chrysogenum BKM F-4081D выращивают, соблюдая условия культивирования и посевную среду как в примере №1.
[35]Инокулюм в количестве 15% вносят в ферментационную среду следующего состава, г/л:
[36]| кукурузный экстракт | 105,0 |
| крахмал кукурузный | 38,0 |
| Фармамедиа | 16,0 |
| декстрин | 42,0 |
| глюкоза | 4,5 |
| СаСО3 | 11,0 |
| ситостерин | 0,1 |
| (NH4)2SO4 | 13,5 |
| MgSO4 | 3,5 |
| KH2PO4 | 4,0 |
| CuSO4·5H2O | 0,017 |
| ZnSO4·7H2O | 0,16 |
| MnSO4·7H2O | 0,03 |
| FeSO4·7H2O | 0,08 |
| масло рапсовое | 35,0 (вносится в каждую колбу отдельно) |
| вода дистиллированная | остальное |
[37]Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.
[38]Ферментацию осуществляют согласно примеру №1. Активность культуральной жидкости на 115 часов роста составляет 16000 мкг/мл.
[40]Выращивание инокулюма культуры Acremonium chrysogenum BKM F-4081D и ферментацию осуществляют как в примере 1. Для ферментации используют среду следующего состава, г/л:
[41]| кукурузный экстракт | 105,0 |
| крахмал кукурузный | 38,0 |
| Фармамедиа | 16,0 |
| декстрин | 43,0 |
| глюкоза | 4,0 |
| СаСО3 | 11,0 |
| фосфатидилхолин | 1,0 |
| (NH4)2SO4 | 13,5 |
| MgSO4 | 3,5 |
| KH2PO4 | 4,0 |
| CuSO4·5H2O | 0,017 |
| ZnSO4·7H2O | 0,16 |
| MnSO4·7H2O | 0,03 |
| FeSO4·7H2O | 0,08 |
| масло рапсовое | 35,0 (вносится в каждую колбу отдельно) |
| вода дистиллированная | остальное |
[42]Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.
[43]Ферментацию осуществляют согласно примеру №1. Активность культуральной жидкости на 115 часов роста составляет 16600 мкг/мл.
[45]Способ ферментации осуществляют согласно примеру №4 с содержанием фосфатидилхолина 2 г/л и рапсового масла 40 г/л. Активность культуральной жидкости на 120 часов ферментации 16400 мкг/мл.
[47]Культуру Acremonium chrysogenum BKM F-4081D для засева ферментационной среды получают согласно примеру №1. Ферментацию проводят как в примере №1 на следующей среде, г/л:
[48]| кукурузный экстракт | 105,0 |
| крахмал кукурузный | 38,0 |
| Фармамедиа | 16,0 |
| декстрин | 43,0 |
| глюкоза | 4,0 |
| СаСО3 | 11,0 |
| фосфатидилхолин | 1,0 |
| ситостерин | 0,1 |
| (NH4)2SO4 | 13,5 |
| MgSO4 | 3,5 |
| KH2PO4 | 4,0 |
| CuSO4·5H2O | 0,017 |
| ZnSO4·7H2O | 0,16 |
| MnSO4·7H2O | 0,03 |
| FeSO4·7H2O | 0,08 |
| масло рапсовое | 40,0 (вносится в каждую колбу отдельно) |
| вода дистиллированная | остальное |
[49]Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.
[50]Содержание цефалоспорина С в культуральной жидкости на 115 часов ферментации составляет 17000 мкг/мл. Содержание дезацетилцефалоспорина С составляет 4,8%.
[52]Вегетативный посевной материал культуры Acremonium chrysogenum ВKМ F-4081D передают в количестве 15 об.% в ферментатор вместимостью 20 л, содержащий 12 л ферментационной среды, состав которой указан в примере №1. Процесс культивирования ведут при следующем режиме: температура 28°С от начала культивирования до 30 часов, а затем 24°С до конца ферментации. Вводимая мощность 4,5 кВт/час. При вспенивании добавляют пеногаситель пропинол Б-400. Аэрацию и перемешивание осуществляют таким образом, чтобы поддерживалась максимальная интенсивность дыхания при избыточном воздушном давлении (0,04±0,01 МПа) и парциальном давлении растворенного кислорода не ниже 30% от насыщения. Значение рН на уровне 5,7±0,2 поддерживают дозированием аммиачной воды и 12%-ных растворов NaOH, (NH4)2SO4 и дозированием рапсового масла. При этом массовая доля аммонийного азота должна быть в пределах 0,04-0,1%, а слой масла на поверхности при определении влажной биомассы методом центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 15 минут не превышал 1 мм. Расход масла 9,06% от объема загружаемой среды.
[53]Через 110 часов культивирования активность культуральной жидкости, определенной методом ВЭЖХ, составляет 32000 мкг/мл. Дезацетилцефалоспорин - 4,8%.
[55]Вегетативный посевной материал Acremonium chrysogenum BKM F-4081D передают в количестве 15 об.% в ферментатор вместимостью 20 л, содержащий 12 л ферментационной среды, состав которой указан в примере №6. Процесс культивирования ведут при следующем режиме: температура 28°С от начала культивирования до 25 часов, а затем 24°С до конца ферментации. Значение водородного показателя, массовой доли аммонийного азота, рапсового масла и парциального давления растворенного кислорода поддерживают в пределах, указанных в примере №7. Расход масла 8,0%. Содержание цефалоспорина С на 106 часов ферментации составляет 34000 мкг/мл, дезацетилцефалоспорина С - 4,1%.
[57]1. Elander R.P. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003,v61, №5-6, p.385-392.
[58]2. Shen Y-Q, Heim J., Solomon N.A., Demain A.L. The journal of Antibiotics. May 1984, v.37 n 5, p.503-511.
[59]3. Demain A.L., Vaishnar P. Critical Reviews in Biotechnology, 2006, v 26, n 2, p.67-82.
[60]4. Queener S.W., Ellis L.F. Canadian Journal of Microbiology. 1975, v 21, n 12, p.1981-1996.
[61]5. Патент РФ «Способ биосинтеза цефалоспорина С», №2241038, 27 ноября 2004 г.
