[2]Изобретение относится к области медицины и биохимии, а именно к созданию реагентов, позволяющих определять активность общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
[3]Для определения активности α-амилазы были разработаны различные методы, основанные на способности фермента гидролизовать внутренние α-1,4-гликозидные связи олиго- и полисахаридов.
[4]Наиболее распространенным для определения активности общей α-амилазы является способ, включающий использование в качестве субстрата 4,6-ethylidene-(G7)-p-nitrophenil-(G1)-α,D-maltoheptaoside (4,6-этилден-(G7)-п-нитрофенил-(G1)-α,D-мальтогептазид; Et-G7PNP), одобренный Международной федерацией клинической химии (IFCC). В процессе реакции α-амилаза расщепляет Et-G7PNP до G2PNP, G3PNP, G4PNP, Et-G3, Et-G4 и Et-G5. После этого α-глюкозидаза гидролизует G2PNP, G3PNP и G4PNP с образованием глюкозы и окрашенного вещества п-нитрофенола. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности общей α-амилазы в образце (Kruse-Jarres J.D., Kaiser С., Hafkenscheid J.С.М. et al. Evaluation of a new α-amylase assay using 4,6-ethylidene-(G7)-l-4-nitrophenil-(G1)-α-D-maltoheptaoside as substrate // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. Vol.27. P.103-113).
[5]Основным недостатком известного способа является двухстадийность реакции и использование дополнительного фермента для получения окрашенного продукта.
[6]Наиболее близким к заявляемому реагенту - прототипом, является набор реагентов для определения активности общей α-амилазы кинетическим колориметрическим методом, состоящий из двух реагентов, следующих составов: реагент 1 - хлорид натрия 50-500 ммоль/л, калий роданистый (KSCN) 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, хлорид кальция 0,5-10,0 ммоль/л, MES (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) 50 ммоль/л, вода - остальное, рН реагента 5-8; реагент 2, содержащий: 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside (2-хлор-4-нитрофенил-4-O-β-D-галактопиранозилмальтозид; GalG2CNP) 2,4-12 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, вода-(остальное), рН реагента 5-8. В основу набора для определения активности общей α-амилазы положен кинетический колориметрический метод, заключающийся в том, что α-амилаза гидролизует GalG2CNP с образованием окрашенного продукта 2-chloro-4-nitrophenol и неокрашенного - 4-O-β-D-galactopyranosylmaltose. Скорость накопления окрашенного продукта прямо пропорциональна активности α-амилазы в образце (Morishita Y., IinumaY., Nakashima N., et al. Total and pancreatic amylase measured with 2-chloro-4-nitrophenyl-4-O-β-D-galactopyranosylmaltoside // Clinical Chemistry. 2000. Vol 46. P.928-933).
[7]Недостатками прототипа являются:
[8]- небольшой срок хранения реагентов: 3 месяца при температуре 4°С;
[9]- трудоемкость при использовании системы из двух реагентов.
[10]Технической задачей изобретения является повышение стабильности реагента для определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче с сохранением высокой точности и воспроизводимости результатов анализа.
[11]Поставленная техническая задача достигается предлагаемым реагентом, содержащим следующие компоненты: субстрат GalG2CNP 0,5-20 ммоль/л, хлорид натрия 50-500 ммоль/л, KSCN 50-400 ммоль/л, азид натрия 1-90 ммоль/л, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,2-5,0 ммоль/л, Triton Х-100 0,075 об.%, ацетат кальция 0,7-10,0 ммоль/л, MES 50 ммоль/л, (остальное), рН 5,5-6,5.
[12]Данный реагент характеризуется правильностью определения активности общей α-амилазы 100±5% с воспроизводимостью результатов (коэффициент вариации) менее 5%. Срок хранения реагента при температуре 2-8°С составляет 2 года.
[13]Включение в состав реагента новых компонентов - Triton Х-100, который является неионным поверхностно-активным веществом, EDTA - образующая комплексные соединения с большинством катионов, а также замена кальция хлорида на консервант кальция ацетат позволяет повысить стабильность реагента и продлить срок его годности до 2-х лет.
[14]Определение активности общей α-амилазы осуществляют при температуре реагента 37°С следующим образом: к 25 мкл пробы добавляют 1 мл реагента и через 1 мин начинают считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм, при этом количество считываний должно быть не менее трех. Активность общей α-амилазы (А) в Е/л рассчитывают по формуле:
[15]А=ΔЕ/мин×3060, где ΔЕ/мин - среднее изменение оптической плотности за минуту; 3060 - фактор пересчета по уравнению Бугера-Ламберта-Бера.
[16]Определяющими существенными отличиями предлагаемого реагента, по сравнению с прототипом, являются:
[17]- реагент дополнительно содержит Triton Х-100 и EDTA в экспериментально подобранных, оптимальных количествах, что позволяет повысить стабильность последнего при хранении;
[18]- в реагенте кальция хлорид заменен на более подходящий компонент - ацетат кальция, что позволяет повысить стабильность реагента при хранении;
[19]- жидкий реагент готов к использованию, что позволяет существенно упростить процедуру анализа;
[20]- все компоненты в реагенте использованы в оптимальных, экспериментально подобранных концентрациях, что позволяет повысить функциональность и расширить область применения реагента.
[21]Предлагаемый реагент прошел клинические испытания и разрешен к производству, продаже и применению на территории Российской, Федерации. Предлагаемый реагент доступен для любой клинико-диагностической, поликлинической и биохимической лаборатории и позволяет получать точные, достоверные результаты анализа, соответствующие зарубежным стандартам.
[23]Для приготовления реагента делают навески на аналитических весах каждого компонента. Переносят их в стеклянные стаканы и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Растворы тщательно перемешивают на магнитной мешалке. Растворы компонентов, кроме GalG2CNP, переносят в мерную колбу вместимостью 1 литр и доводят рН под контролем рН-метра до 5,73. Затем добавляют навеску GalG2CNP. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. В результате получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:
[24]Хлорид натрия, ммоль/л - 50,0
[25]KSCN, ммоль/л - 400,0
[26]Азид натрия, ммоль/л - 90,0
[28]Ацетат кальция, ммоль/л - 0,7
[29]Triton Х-100, об.% - 0,075
[30]GalG2CNP, ммоль/л - 0,5
[33]При этом значение рН реагента составляет 6,0.
[35]Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1. Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:
[36]Хлорид натрия, ммоль/л - 300,0
[37]KSCN, ммоль/л - 100,0
[38]Азид натрия, ммоль/л - 20,0
[40]Ацетат кальция, ммоль/л - 5,0
[41]Triton Х-100, об.% - 0,075
[42]GalG2CNP, ммоль/л - 10,0
[45]При этом значение рН реагента составляет 5,5.
[47]Приготовление реагента осуществляют аналогично примеру 1.
[48]Получают реагент для определения общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче, содержащий следующие компоненты:
[49]Хлорид натрия, ммоль/л - 500,0
[51]Азид натрия, ммоль/л - 1,0
[53]Ацетат кальция, ммоль/л - 10,0
[54]Triton X-100, об.% - 0,075
[55]GalG2CNP, ммоль/л - 20,0
[58]При этом значение рН реагента составляет 6,5.
[60]Определение активности панкреатической α-амилазы в контрольных сыворотках.
[61]К 1 мл реагента, прогретому до температуры 37°С, добавили 25 мкл контрольной сыворотки «Precinorm U». Через 1 мин начали считывать оптическую плотность через равные промежутки времени в течение 1-3 мин при длине волны 405 нм. Аналогичную процедуру повторили для контрольных сывороток «Precipath U», «c.f.a.s.», «Contornorm», «Contropath», «BioCal E». Результаты анализа приведены в табл.1.
[62]| Таблица 1 |
| Контрольная сыворотка | Аттестованное значение активности панкреатической α-амилазы (IFCC), Е/л | Полученный результат, Е/л |
| «Precinorm U» («Roche», Германия) | 40,8 (33,6-48,0) | 40 |
| «Precipath U» («Roche», Германия) | 102 (84-120) | 102 |
| «c.f.a.s.» («Roche», Германия) | 162 | 164 |
| «Contornorm» («Biocon», Германия) | 40,1 (32,9-47,3) | 41 |
| «Contropath» («Biocon», Германия) | 102 (84-120) | 101 |
| «BioCal E» («Biocon», Германия) | 171 | 177 |
[63]Из таблицы 1 видно, что предлагаемый реагент обеспечивает высокую точность определения активности общей α-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче.
[64]Использование предлагаемого реагента позволит по сравнению с прототипом:
[65]- увеличить срок годности реагента до 2-х лет за счет обеспечения его стабильности;
[66]- расширить область применения и повысить функциональность реагента за счет обеспечения возможности работы с ним в условиях клинико-диагностических, поликлинических и биохимических лабораторий.
