[1]Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается способа культивирования штаммов бактерий Serratia marcescens, продуцентов хитиназы.
[2]Хитиназы (КФ
3.2.1.14) - ферменты, катализирующие гидролиз β -1,4 гликозидных связей в хитине - полисахариде, входящем в состав патогенных грибов и членистоногих. В связи с этим использование хитиназ
перспективно для решения различных прикладных задач в растениеводстве и ветеринарии, связанных с защитой растений и животных от грибковых заболеваний и насекомых-вредителей, а также в рыбной
промышленности для утилизации содержащих хитин отходов после промышленной переработки ракообразных [1]. Хитиназы обнаружены у самых разных групп организмов, включая бактерии, грибы, растения,
членистоногие и позвоночные, но наиболее перспективными источниками этих ферментов являются микроорганизмы.
[3]Среди микроорганизмов, способных продуцировать хитиназу, энтеробактерии
Serratia marcescens являются одними из самых эффективных [2]. Различные штаммы S.marcescens, в том числе и с искусственно измененным геномом, обладают способностью секретировать во внеклеточное
пространство комплексы хитинолитических ферментов. Однако эти ферменты являются индуцируемыми и уровень их продукции зависит от условий культивирования и состава питательной среды [2, 3]. В связи с
этим разработка способов культивирования S.marcescens с высоким выходом хитиназы является актуальной задачей.
[4]Известен способ культивирования мутантного штамма S.marcescens IMR-1E1
- суперпродуцента хитиназы [4]. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов коллоидный хитин (1,5%) и дрожжевой экстракт (0,5 г/л), при 30° С в течение 5
суток. Выход хитиназы в культуральную жидкость составляет 0,36 Е/мл.
[5]Существенными недостатками известного способа культивирования является нестабильность продуктивности по хитиназе,
связанная с генетической природой мутации в штамме, сложность питательной среды, содержащей дорогостоящий коллоидный хитин, и длительность культивирования.
[6]Наиболее близким к заявляемому
способу культивирования - прототипом является способ культивирования стабильного мутантного штамма S.marcescens В-10 М-1 (ВКПМ В-3237) - суперпродуцента хитиназы [5] на питательной среде следующего
состава, г/л:
[7]Хитин порошкообразный 10-30
[8]Дрожжевой экстракт 5,0
[12]рН питательной среды доводят до значения 8,0-8,4, добавляя буферную смесь одно- и двузамещенных фосфатов калия (1,5 г/л). Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при температуре
28-30° С с аэрацией в течение 5-7 суток. Выход хитиназы в культуральную жидкость составляет 0,3-0,5 Е/мл.
[13]Существенными недостатками известного способа культивирования является
длительность культивирования, недостаточно высокий уровень продукции хитиназы, а также сложность состава питательных факторов среды, включающих дорогостоящие порошкообразный хитин и дрожжевой экстракт,
а также сульфаты аммония и магния.
[14]Технической задачей изобретения является уменьшение длительности культивирования при увеличении выхода хитиназы, а также упрощение состава
питательной среды.
[15]Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающемся в следующем.
[16]Для культивирования S.marcescens с целью получения
хитиназы применяют питательную среду следующего состава, г/л (на сухое вещество):
[17]Дрожжи Saccharomyces cerevisiae 50-150
[19]рН питательной среды
доводят до значения 8,0-8,4
[20]добавляя буферную смесь одно- и двузамещенных фосфатов калия (1,5 г/л). Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при температуре 28-30°
С с аэрацией в течение 3-5 суток. Выход хитиназы составляет 0,77-1,02 Е/мл.
[21]Концентрацию жизнеспособных клеток S.marcescens в культуральной жидкости определяют методом высева на чашки с
мясопептонным агаром.
[22]Активность хитиназы (ХА) определяют следующим образом. После окончания культивирования отделяют клетки и нерастворимые компоненты центрифугированием при 5000
об/мин в течение 30 мин. Культуральную жидкость собирают. К 0,3 мл суспензии коллоидного хитина (10 мг/мл) добавляют 0,1 мл 0,5 М натрий ацетата - уксусной кислоты (рН 5,5), аликвоту анализируемого
образца культуральной жидкости, воду до конечного объема 1,0 мл и инкубируют при температуре 37° С в течение 15 мин. После этого реакционную смесь центрифугируют и в надосадочной жидкости
определяют концентрацию N-ацетилглюкозамина с помощью динитросалицилового реагента [6]. За единицу ХА принимают такое количество фермента, которое в описываемых условиях реакции вызывает прирост
концентрации N-ацетилглюкозамина на 1,0 мкмоль х мин-1·мл-1.
[23]На фиг.1 представлена зависимость роста клеток S.marcescens В-10 М-1 (столбцы) и
выхода хитиназы (линия) от концентрации в питательной среде пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Время культивирования 3 суток. По оси Х - концентрация биомассы дрожжей (по сухому весу) в
питательной среде, г/л. По левой оси Y - хитиназная активность в культуральной жидкости, Е/мл. По правой оси Y - концентрация клеток S. marcescens, 10 кл/мл.
[24]Из фиг.1 видно, что
наибольший выход хитиназы наблюдается в диапазоне концентраций дрожжей 50-150 г/л с максимумом ХА=0,8 Е/мл при 90-150 г/л. При концентрации дрожжей ниже 50 г/л выход хитиназы снижается более чем на
25% от максимального. Увеличение концентрации дрожжей выше 150 г/л нецелесообразно, поскольку не приводит к дополнительному повышению выхода хитиназы.
[25]На фиг.2 представлены зависимости
выхода хитиназы от времени культивирования S.marcescens В-10 М-1 при использовании в качестве питательных факторов среды пекарских дрожжей (кривая 1) или приведенных в прототипе порошкообразного
хитина, дрожжевого экстракта и сульфатов магния и аммония (кривая 2). Концентрация дрожжей 90 г/л, хитина 20 г/л. По оси Х - время культивирования, сут. По оси Y - хитиназная активность в
культуральной жидкости, Е/мл.
[26]Из фиг.2 видно, что культивирование заявляемым способом, по сравнению с прототипом, приводит к повышению продукции хитиназы и сокращению продолжительности
культивирования. Уже на 3-и сутки роста выход хитиназы в два раза превышает соответствующий показатель при 6 сутках культивирования на порошкообразном хитине. После 5 суток роста накопление ХА
замедляется, поэтому более длительное культивирование представляется нецелесообразным.
[27]На фиг.3 представлены сравнительные данные по ХА в культуральной жидкости трех природных штаммов
S.marcescens: В-10, HY+ и 209 при культивировании в течение 3-х суток на средах, содержащих 20 г/л хитина (столбцы серого цвета) и 90 г/л пекарских дрожжей (штрихованные столбцы). По оси Х - названия
исследованных штаммов S.marcescens. По оси Y - хитиназная активность в культуральной жидкости, мЕ/мл.
[28]Из фиг.3 видно, что по сравнению с прототипом дрожжи в 5-30 раз сильнее стимулируют
продукцию хитиназы клетками различных природных штаммов S.marcescens. Эти результаты подтверждают, что использование заявляемого способа культивирования универсально и применимо для увеличения
продукции хитиназы различными штаммами S.marcescens как природного происхождения, так и мутантными.
[29]В таблице представлены сравнительные данные по ХА в культуральной жидкости мутантного
штамма S.marcescens В-10 М-1 при культивировании в течение 3-х суток на средах, содержащих 20 г/л хитина и биомассу различных вариантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae в концентрациях, эквивалентных
90 г/л (по сухому весу). Дополнительным исследуемым фактором было наличие или отсутствие в среде для культивирования дрожжевого экстракта.
[30]Из таблицы видно, что стимулирующими продукцию
хитиназы свойствами обладают различные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Индуцирующим эффектом обладают как высушенные клетки, так и влажная прессованная биомасса. Из таблицы также видно, что при
использовании цельных клеток дрожжей необходимость в добавлении дрожжевого экстракта отпадает. Дрожжевой экстракт является широко распространенным компонентом питательных сред при культивировании
различных микроорганизмов, содержащим водорастворимые аминокислоты, пептиды, витамины и углеводы дрожжевых клеток. Однако нерастворимые элементы клеточных стенок дрожжей в нем отсутствуют. Вероятно,
используемые в заявляемом способе цельные дрожжевые клетки содержат в себе все необходимые для роста культуры S.marcescens питательные факторы, а непосредственным индуктором продукции хитиназы
являются молекулы хитина, входящие в состав клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae [7]. Подтверждением такому предположению являются представленные в таблице данные о том, что сопоставимые
уровни продукции хитиназы вызывают как цельные клетки дрожжей, так и их изолированные клеточные стенки. Однако в отличие от цельных клеток, клеточные стенки, так же как и порошкообразный хитин,
проявляют индуцирующий эффект только в присутствии дрожжевого экстракта.
[31]Таким образом преимуществом заявляемого способа является сокращение продолжительности культивирования
S.marcescens при увеличении выхода хитиназы. Дополнительным преимуществом является то, что пекарские дрожжи являются легко доступным и недорогим компонентом для питательной среды. Стоимость
прессованной биомассы дрожжей для пищевого применения составляет около 0,02 рублей за грамм, что соответствует 5-10 рублей на 1 литр питательной среды. Для сравнения порошкообразный хитин, пригодный
для применения в качестве компонента питательной среды, производится в ограниченных количествах и его стоимость у разных производителей колеблется от 5 до 50 долларов США за грамм, что соответствует
затратам 3000-50000 рублям на 1 литр среды. Еще одним преимуществом заявляемого способа является то, что его применение позволяет исключить из среды для культивирования дрожжевой экстракт и сульфаты
аммония и магния, что дополнительно упрощает и удешевляет способ культивирования S.marcescens.
[32]Поскольку предлагаемый способ культивирования S.marcescens предложен впервые и никогда
ранее не использовался для выделения хитиназы, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".
[33]Изобретение
иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
[35]Культивирование штамма Serratia marcescens В-10 М-1 проводят на питательной среде, содержащей
(г/л):
[36]Дрожжи пекарские прессованные 120
[38]рН питательной среды доводят до значения 8,2, добавляя буферную смесь одно- и двузамещенных фосфатов
калия (1,5 г/л). Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при температуре 29° С с аэрацией в течение 5 суток. Выход хитиназы составляет 1,02 Е/мл.
[40]Культивирование штамма Serratia marcescens В-10 М-1 проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что содержание дрожжей в среде составляет 50 г/л, а продолжительность культивирования
- 3 суток при температуре 28° С и рН 8,0. Выход хитиназы составляет 0,60 Е/мл.
[42]Культивирование штамма Serratia marcescens В-10 М-1 проводят аналогично
примеру 1, за исключением того, что содержание дрожжей в среде составляет 150 г/л, а продолжительность культивирования составляет 4 суток при температуре 30° С и рН 8,4. Выход хитиназы
составляет 0,92 Е/мл.
[43]Таким образом, разработан способ культивирования бактерий Serratia marcescens, продуцентов хитиназы, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным
способом:
[44]- сокращенная продолжительность культивирования (в 2 раза).
[45]- более высокий выход по хитиназе (более чем в 2 раза);
[46]- сниженная стоимость среды
для культивирования (более чем в 10 раз).
[47]Применение нового способа культивирования бактерий Serratia marcescens позволит повысить выход хитиназы, упростить ее выделение и уменьшить
себестоимость.
[49]1. Patil R.S., Ghormade V., Deshpande M.V. Chitinolytic enzymes: an exploration // Enzyme and microbial technology. 2000. V.26.
P473-483.
[50]2. Monreal J., Reese E.T. The chitinase of Serratia marcescens II Canadian Journal of Microbiology. 1969. V.15. P.689-696.
[51]3. Watanabe Т., Kimura K., Sumiya Т.,
Nikaidou N., Suzuki K., Suzuki M., Taiyoji M., Ferrer S., Regue M. Genetic analysis of the chitinase system of Serratia marcescens 2170 //Journal of Bacteriology. 1997. V. 179. Р.7111-7117.
[52]4. Reid J.D., Ogrydziak D.M. Chitinase-overproducing mutant of Serratia marcescens II Applied and Environmental Microbiology. 1981. V.41. P.664-669.
[53]5. Панфилова З.И., Дужак
А.Б., Салганик Р.И. Штамм бактерий Serratia marcescens - продуцент хитиназы: Патент 2026348 РФ //Б.И. №1, 1995, С.174.
[54]6. Miller G.L. Use of dinitrosalicilic acid reagent for
determination of reducing sugar// Anal. Chem. 1959. V.31. P.426-428.
[55]7. Lipke P., Ovalle R. Yeast cell walls: new structures, new challenges //J.Bacteriol. 1998. V.180. P.3735-3740.
[56]
