Способ неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода

Способ неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода путем массового параллельного секвенирования при помощи полупроводниковой технологии, отличающийся тем, что получают плазму из образца крови беременной женщины при сроке беременности не менее 9-и недель, производят выделение внеклеточной ДНК из плазмы беременной женщины, создают полногеномные библиотеки с использованием внеклеточной ДНК, производят секвенирование библиотек при помощи ионного полупроводникового массового параллельного секвенирования, а также первичную подготовку и фильтрацию полученных чтений, затем производят картирование чтений на референсный геном, при этом используют алгоритм Super-maximal Exact Matching, затем производят вторичную фильтрацию чтений по качеству картирования, при этом используют для оценки качества картирования пороговое значение в 15 единиц, затем производят удаление копий чтений, возникших из-за ПЦР-амплификации; затем производят определение пола плода в образце по формуле,

где RC_chrYmasked - количество чтений, которое выровнялось на хромосому Y после фильтрации неспецифичных участков, RC_i - количество чтений, которое выровнялось на аутосомную хромосому, k - эмпирически подобранный коэффициент, и если s<1, значит исследуемый образец считается женским полом, если то мужским; затем производят подсчет фетальной фракции для образцов методом DEFRAG и подсчет фетальной фракции для образцов пакетом SeqFF и определяют фетальную фракцию для образцов по формуле:

где med_chrAuto - медиана нормализованного количества чтений на аутосомных хромосомах, med_chrYmasked - медиана нормализованного количества чтений на Y хромосоме, где предварительно были удалены все чтения, которые выровнялись на неспецифичные регионы хромосомы; затем производят подсчет фетальной фракции для образцов по формуле:

где med_chrAuto - медиана нормализованного количества чтений на аутосомных хромосомах, med_chrX - медиана нормализованного количества чтений на X хромосоме образца; затем методом локальной регрессии LOESS производят нормализацияю по GC-составу; затем производят коррекцию пиков и выбросов с помощью еще одного этапа нормализации количества чтений для каждого бина: количество чтений в бине умножают на коэффициент нормализации, который является средним количеством всех чтений во всех бинах на всех аутосомах контрольной группы образцов, поделенные на среднее количество чтений для всех чтений во всех бинах на всех аутосомах исследуемого образца по формуле,

где NRC_ik - нормализованное количество чтений конкретного бина, n_i - количество бинов, n_j - количество образцов в контрольной группе, RC_ij - количество чтений конкретного бина до нормализации; затем вычисляют - сумму разности квадратов между нормализованным количеством чтений для бина для всех образцов из контрольной группы и нормализованным количеством чтений исследуемого образца по формуле

где avg_ij - среднее количество чтений для всех бинов после нормализации; затем из вычитают степень свободы df - количество образцов в контрольной группе минус один, и делят на квадратный корень из удвоенной степени свободы, таким образом получая Z-метрику для всех бинов в образце, и, если значение метрики в бине превышает порог в 3.5, вклад такого бина в подсчет интегральной хромосомной z-метрики снижают путем деления на коэффициент затем производят определение репрезентативности контрольной выборки путем сравнения паттерна покрытия бинов и хромосомных фракций образца с обобщенным паттерном группы контроля; затем производят методом линейной регрессии подсчет Z-метрики образца, для чего используют нормализованные показатели количества чтений для прямой и обратной нити ДНК каждой хромосомы, при этом выбирают четыре наиболее удачных набора предикторов на основе скорректированного значения квадрата R и определяют предсказанные значения Z-метрики на основании моделей с наиболее удачными предикторами; затем для каждой из тестируемых хромосом рассчитывают финальную Z-метрику на основе отношения наблюдаемой хромосомной фракции к предсказанной по формуле

где fr_observed - наблюдаемая хромосомная фракция, fr_predicted - предсказанная хромосомная фракция исследуемого образца, SD_control - среднеквадратичное отклонение относительной хромосомной фракции (наблюдаемой к предсказанной) в группе образцов контроля; затем на основе финальной Z-метрики классифицируют образец либо как не отличающийся от нормы, если значение Z-метрики для хромосомы находится в пределах значения плюс и минус 3х стандартных отклонений от среднего; при этом, если значение Z-метрики для хромосомы меньше нижней границы указанного интервала, то образец считается аномальным, и является носителем моносомии, а если большей верхней границы указанного интервала, то образец является носителем трисомии по данной хромосоме, а также образец считается не прошедшим контроль качества, если определяемый уровень фетальной фракции образца ниже порогового значения в 3,5%, или если после всех стадий биоинформатической подготовки образца количество чтений стало меньше 1 млн.