РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PVGIB, КОДИРУЮЩАЯ ГАММА-ИНТЕРФЕРОН БЫКА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE - ПРОДУЦЕНТ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА БЫКА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии. Цель изобретения - создание штамма дрожжей - продуцента гаммаинтерферона быка. Получена плазмида, которая содержит ген LEU2 дрожжей и фрагмент дрожжевой двумикронной ДНК, обеспечивающие ее стабильное поддержание в дрожжах в высоком числе копий, кодирующий участок гена гаммаинтерферона быка, фланкированный промотором и терминатором транскрипции гена pHO 5 дрожжей, а также фрагменты бактериальной ДНК, обеспечивающие репликацию плазмиды в клетках E. coti и несущие ген устойчивости к ампициллину. Клетки дрожжей штаммаGRF18, трансформированные плазмидой pYGIB, продуцируют гамма-интерферон быка в количестве порядка 10 мг на 1 л дрожжевой культуры. 3 с.п. ф-лы.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pYGIB, кодирующая гамма-интерферон быка, размером 8,0 т.п.о. и мол.м. 5,2 МД, содержащая Hind III-BamHI фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pjDB 207 размером 6,6 т.п.о. BamHI-EcoRI-фрагмент ДНК плазмиды pMS 46 размером 0,52 т. п. о. XbaI Hind III/BamHI фрагмент ДНК рекомбинантного фага mp 18-gamma IFN, нуклеотидная последовательность которого кодирует гамма-интерферон быка, размером 0,428 т.п.о. BamHI/Sau 3A-PstI/Hind III фрагмент ДНК плазмиды pMS 46 размером 0,39 т.п.о. гены и регуляторные участки; ген bla, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; ген LEU 2, обеспечивающий возможностью роста на селективных средах без лейцина; бактериальный локус ori, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетках E.coli; фрагмент двумикронной ДНК дрожжей обеспечивающий автономную репликацию плазмиды в дрожжах; промотор гена PH05 дрожжей, обеспечивающий инициацию транскрипции; терминатор транскрипции гена PH05, обеспечивающий терминацию транскрипции; часть гена гамма-интерферона быка, кодирующая структуру этого белка; сайты рестрикации - по три сайта EcoRI и RstI, по два сайта SalI и BamHI, по одному сайту Hind III и XbaI.

2. Способ получения плазмиды pYGB, заключающийся в том, что ДНК рекомбинантного фага mp 18-gamma IFN расщепляют рестриктазами EcoRI и HindIII, лигируют с ДНК плазмиды pMS 46, гидролизованной рестриктазами EciRI и SmaI, полученную плазмиду гидролизуют смесью рестриктаз EcoRI и XbaI, обрабатывают ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой, из полученной плазмиды рестриктазами SalI и Hind III вырезают фрагмент ДНК, содержащий промотор дрожжевого гена PH05, кодирующую часть гена интерферона и терминатор транскрипции гена PH05, лигируют с плазмидой pjD 207, гидролизованной рестриктазами SalI и Hind III и отбирают клоны по данным рестрикционного анализа.

3. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisial ВКПМУ-1223-продуцент гамма-интерферона быка.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии.

Целью изобретения является создание дрожжей продуцента гамма-интерферона быка.

Плазмида pYGIB, обеспечивающая синтез гамма-интерферона быка в клетках дрожжей, состоит из следующих элементов:
Hind III-BamHI фрагмента плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора pjDV 207 размером 6,6 т.п.о, включающего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, фрагмент дрожжевой двумикронной плазмиды и дрожжевой ген LEU2;
BamHI-EcoRI фрагмента гена РН05 дрожжей, содержащего промотор этого гена, размером 0,52 т.п.о.

XbaI-Hind III фрагмента рекомбинантного фага mp 18 gamma-IFN длиной 0,42 т.п.о.

Sma I-BamHI фрагмента полилинкерного участка плазмиды pvC 19 длиной 8 п. о.

Sau3F-PstI фрагмента гена РН05 дрожжей, содержащего терминатор транскрипции этого гена, размером 0,37 т.п.о.

PstI-Hind III фрагмента полилинкера плазмиды pvC 19 размером 20 п.о.

Общий размер плазмиды 8 т.п.о. (мол.м. 5,2 МД).

Получен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученный трансформацией штамма плазмидой pYG 18.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки округлой, слегка овальной формы размером примерно 5-10 мкм, у части клеток наблюдаются прикрепленные к их поверхности дочерние клетки или почки.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на полных органических средах (ПЕП: 2% пептона, 2% глюкозы; ПЕПФО: 2% пептона, 2% глюкозы, 0,15% однозамещенного фосфата калия; YEPD: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы).

Помимо полных органических сред клетки хорошо растут на минеральной среде состава: 0,67% Yeast nitrogen base ("Difco"), 2% глюкозы (среда SC) с добавлением 50 мг/л гистидина, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих добавку 50 мг/л гистидина.

При росте на твердых средах образуют гладкие, круглые, мутные колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край ровный.

При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную муть. Культура имеет характерный запах дрожжей.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах 4-37^оС, при оптимуме 30^оС.

При росте в аэробных условиях клетки значительно закисляют культуральную среду. Оптимум рН для роста составляет 3,5-5,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые органические соединения, в частности, глюкозу, сахарозу, глицерин.

В качестве источника азота при условии добавки гистидина клетки могут использовать как минеральные соли в аммонийной форме, так и простые органические соединения мочевину, аминокислоты.

Клетки способны как к аэробному, так и к анаэробному росту.

Существенными признаками штамма являются потребность в гистидине и прототрофность по лейцину.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-1223.

П р и м е р 1. Клетки бактерий E. coli, содержащие плазмиду pMS 46, выращивают в течение ночи в 500 мл питательной среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия), в которую добавлен ампициллин (50 мг/л). Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин, 4^оС), ресуспендируют в 10 мл буфера для лизиса (25 мМ трисгидрохлоридный буфер, рН 8, 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы), добавляют 20 мг лизоцима и инкубируют 10 мин при 4^оС. Добавляют 10 мл 0,2 М гидроокиси натрия, содержащей 1% додецилсульфата натрия. После осторожного перемешивания в течение примерно 1 мин раствор нейтрализуют 10 мл 3М ацетата натрия, рН 5,3, выдерживают при 4^оС 1 ч и центрифугируют. К супернатанту добавляют 0,6 объема изопропилового спирта. Осадок отделяют центрифугированием, высушивают в вакууме, растворяют в 3,5 мл воды, прибавляют 3,5 г хлористого цезия и 100 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл) и центрифугируют при 50000 об/мин 12-16 ч. После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДНК, дважды экстрагируют равным объемом изоамилового спирта, разбавляют раствор хлористого цезия водой в 2 раза и осаждают ДНК двумя объемами этилового спирта. Осадок, отделенный центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в воде (500 мкл). Концентрацию ДНК определяют по оптической плотности раствора при 260 нм (оптическая плотность 1 соответствует концентрации 50 мкг/мл), чистоту препарата контролируют электрофорезом в 0,7%-ном агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1 М трисборат, 1 мМ ЭДТА и 1 мг/л бромистый этидий).

Гидролиз плазмиды pMS 46 рестриктазой SmaI проводят в 10 мМ трисгидрохлоридном буфере, содержащем 10 мМ хлористого магния, 20 мМ хлористого калия, 1 мМ дитиотреитола. К 20 мкг ДНК в объеме 50 мкл прибавляют 30 ед. рестриктазы и проводят реакцию при 30^оС 2 ч. Контроль за полнотой гидролиза ведут с помощью электрофореза. Далее раствор ДНК разбавляют до 200 мкл буфером из 50 мМ трисгидрохлорида, 10 мМ хлористого магния, 100 мМ хлористого натрия, 1 мМ дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (буфер ВС) и обрабатывают 50 ед. рестриктазы EcoRI в течение 2 ч при 37^оС. Реакционную смесь вносят в лунку агарозного геля, приготовленного, как описано, и проводят электрофорез при напряжении 5 В/см в течение 2-3 ч. Непосредственно перед полосой линейной формы плазмиды вырезают лунку (3х60 мм), помещают в эту лунку диализную мембрану соответствующего размера и заполняют ее буфером ТВЕ. Электрофорез продолжают еще 10-15 мин, после чего буфер из лунки отбирают, экстрагируют один раз фенолом и один-два раза бутанолом, добавляют 1/10 часть 3М натрий-ацетатного буфера, рН 5,3, и три объема этанола. ДНК отделяют центрифугированием, осадок промывают этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в 100 мкл воды.

Выделение двуцепочечной формы ДНК фага mp 18-gamma-IEN аналогично выделению плазмиды pMS 46 с тем отличием, что клетки бактерий штамма TGI выращивают на среде LB без антибиотиков до плотности 0,4, заражают фагом и доращивают до плотности культуры 0,8-1,0 при 600 нм, после чего клетки собирают центрифугированием и выделяют фаговую ДНК. Гидролиз 10 мкг двуцепочечной формы ДНК фага проводят с помощью 30 ед. рестриктазы Hind III. К раствору ДНК добавляют 80 мкл 100 мМ трисгидрохлоридного буфера, рН 7,4, содержащего 50 мМ хлористого магния, смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов до конечной концентрации каждого из них 250 мкМ и 10 ед. кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I. После инкубации в течение 4 ч при комнатной температуре смесь прогревают при 65^оС 10 мин и проводят гидролиз плазмидной ДНК 30 ед. рестриктазы EcoRI.

Очистку фрагмента размером 420 п.о. проводят для векторного фрагмента плазмиды pMS 46 с тем дополнением, что рядом с лункой для очищенного препарата ДНК вырезают лунку (5х3 мм) для нанесения стандартов мол.м. (ДНК фага лямба, гидролизованная PstI): нужную полосу перед элюцией идентифицируют, сравнивая ее подвижность с подвижностью стандартных фрагментов ДНК.

Для получения плазмиды, обозначенной как pMSGIB, фрагменты ДНК, содержащие промотор и терминатор гена РН05, лигируют с фрагментом ДНК, несущим ген гамма-интерферона быка. Для этого фрагменты ДНК из плазмиды pMS 46 и фаговой ДНК смешивают по 0,1 мкг в 10 мкл 70 мМ трисгидрохлоридного буфера, рН 7,6, содержащего 5 мМ дитиотреитола, 5 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ, добавляют 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют в течение ночи при 4^оС.

Лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli НВ 101. Для этого клетки Е. coli выращивают в 100 мл среды LB при 37^оС до достижения оптической плотности при 600 нм 0,4-0,5, охлаждают на льду, центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин при 0^оС, ресуспендируют в 50 мл 0,1 М хлористого кальция, инкубируют на ледяной бане 40 мин, повторно центрифугируют, суспендируют в 5 мл раствора хлористого кальция, добавляют глицерин до 20% Для трансформации к суспензии компетентных клеток добавляют смесь продуктов лигазной реакции и инкубируют в ледяной бане 40 мин. Клетки подвергают тепловому шоку в течение 2 мин при 42^оС, инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37^оС 1 ч. Суспензию клеток концентрируют центрифугированием и растирают по поверхности чашки с той же питательной средой, содержащей 2% агара и 50 мг/л ампициллина.

Из полученных отдельных клонов выделяют плазмидную ДНК. При этом вместо последней стадии очистки (центрифугирования в растворе хлористого цезия) используют обработку панкреатической РНК-азой. Для этого осадок нуклеиновых кислот, полученный при осаждении изопропанолом, растворяют в 100 мкл буфера для рестрикции и обрабатывают 10 мкл раствора РНК-азы (1 мг/мл) в течение 30 мин при 37^оС. Препарат используют для рестрикционного анализа строения плазмид в индивидуальных клонах.

В случае плазмиды pMSGIB анализ проводят следующим образом. К порциям по 3 мкл препарата плазмиды добавляют по 7 мкл воды и далее отдельные порции обрабатывают следующими комбинациями рестрикционных эндонуклеаз (по 10 ед.): SalI + Hind III (искомая плазмида дает фрагменты 520 и 1100 п.о.), EcoRI + Hind III (фрагмент 820 п.о.), BamHI + SalI (фрагменты 275, 520 и 430 п.о.). Из отобранного клона, содержащего плазмиду pMSGIB, выделяют ДНК.

Лишенный смысловой нагрузки фрагмент ДНК между рестрикционными сайтами EcoRI и XbaI удаляют следующим образом. Плазмиду pMSGIB гидролизуют смесью рестриктаз EcoRI и HbaI, очищают электрофорезом в агарозном геле, обрабатывают кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I и циклизуют посредством лигирования. После трансформации бактерий такой ДНК выделяют клоны, содержащие плазмиду pMSGIBI (такие клоны легко отличить от клонов с исходной плазмидой pMSGIB рестрикционным анализом эндонуклеазой BamHI.

Для получения челночной плазмиды pYGIB очищают ASalI-Hind III фрагмент плазмиды pMSGIBI размером 1,62 т.п.о и векторный фрагмент плазмиды pjDB 207, гидролизованной теми же рестриктазами.

Гидролиз рестриктазами проводят следующим образом. 20 мкг плазмидной ДНК в 200 мкл буфера переваривают 100 ед. рестриктазы Hind III в течение 3 ч при 37^оС, к реакционной смеси добавляют 10 ед. рестриктазы SalI и инкубируют при 37^оС 10 мин, помещают в ледяную баню и аликвоту гидролизата анализируют электрофорезом в агарозном геле, контролируя относительное количество фрагментов размером 250, 1100 и 1620 п.о. Такие циклы (инкубация при 37^оС 10-20 мин, перенос в ледяную баню и электрофоретический анализ) повторяют до тех пор, пока количество фрагментов размером 1100 и 1620 п.о. в реакционной смеси не станет примерно равным. Очистку фрагмента ДНК размером 1620 п.о. проводят электрофорезом в агарозном геле. Лигазной смесью трансформируют клетки Е.coli и проводят рестрикционный анализ трансформаторных клонов рестриктазами EcoRI, SalI + Hind III, BamHI + SalI, отбирают клон, содержащий плазмиду pYGIB. Из клеток этого клона препаративно выделяют плазмидную ДНК и используют ее для трансформации клеток дрожжей.

П р и м е р 2. Дрожжевой штамм реципиент выращивают на среде YEPD до достижения культурой оптической плотности при 600 нм 2-4. Клетки дважды промывают водой и один раз 0,1 М натрий-цитратным буфером, содержащим 1М сорбит, суспендируют в том же буфере и обрабатывают сначала 159 мкл меркаптоэтанола 15 мин при 30^оС, а затем 150 мкл глюкоронидазы в течение 30-60 мин при той же температуре. Полученные сферопласты трижды промывают 1М сорбитом, суспендируют в 0,01 М трис-НСl буфере, содержащем 0,01 М хлористого кальция и 1М сорбита, и после добавления 10 мкг ДНК-плазмиды pjDB (MSIL) инкубируют 30 мин при комнатной температуре. К суспензии клеток добавляют 44%-ный раствор полиэтиленгликоля 4000, выдерживают 30 мин при 30^оС, затем 2 мин при 42^оС и высевают глубинным посевом на среду, содержащую 1% агара и гистидин в концентрации 50 мг/л.

Для анализа продукции клетками трансформаторов гамма-интерферона быка их выращивают на среде ПЕП до достижения стационарной фазы роста. Клетки собирают центрифугированием, промывают водой и разрушают. Для этого клетки суспендируют в равном по отношению к объему клеток объеме буфера РВ (0,15 М хлористый натрий, 10 мМ фосфат натрия, рН 7,4), содержащего 5 мМ фенилметансульфонилфторид, добавляют третью часть от объема суспензии стеклянных бус и встряхивают в гомогенизаторе на максимальной мощности в течение 1 мин, центрифугируют при 10000 об/мин 10 мин при комнатной температуре. Осадок промывают 10-кратным объемом буфера РВ и суспендируют в четырехкратном по отношению к объему осадка количестве того же буфера. На каждый 1 мл суспензии добавляют 20 мг додецилсульфата натрия и 10 мг дитиотреитола, инкубируют суспензию 10 мин при 80^оС и разделяют центрифугированием. В супернатанте определяют присутствие гамма-интерферона быка.

Для анализа продукции гамма-интерферона быка иммуноферментным методом пробы разводят в соотношениях от 1:10 до 1:200 50 мМ водой и помещают в лунки пластиковых плат для иммуноферментного анализа. Пробы высушивают в течение ночи при комнатной температуре, инкубируют с 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина при 37^оС в течение 30 мин и промывают буфером РВ. В лунки добавляют раствор моноклональных мышиных антител к гамма-интерферону человека (по 2 мкг на лунку), а затем после еще одной промывки разведенный 1: 200 конъюгат видоспецифических антител, специфичных к мышиным гамма-глобулинам, и пеpоксидазы. После инкубации сформированных комплексов с субстратным раствором (0,0003%-ная перекись водорода, 4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,6) и остpовки реакции добавлением равного объема 2М серной кислоты измеряют оптическую плотность при 486 нм.

Клетки дрожжей полученного штамма синтезируют полипептид, дающий четкий иммунологический сигнал с антителами к гамма-интерферону человека.

Для контроля продукции интерферона клетками штамма используют также метод электрофореза белков в присутствии додецилсульфата натрия в 15%-ном акриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 0,2 М глицин, рН 8,3, гелевый буфер: 0,375 М трис-HCl, рН 8,9). Гели окрашивают кумасси R и отмывают. В качестве стандартов молекулярной массы используют бычий сывороточный альбумин, овальбумин, химотрипсиноген и цитохром С.

Для электрофоретического анализа клетки дрожжей вскрывают, как описано, после чего материал, нерастворимый в буфере РВ, обрабатывают 2%-ным раствором додецилсульфата натрия, содержащим 1% меркаптоэтанола, при 95^оС в течение 2 мин. Суспензию разделяют центрифугированием, 10000 об/мин, 10 мин) и супернатант наносят на полиакриламидный гель.

Электрофорез обнаруживает белковую полоску с мол.м. около 15 кД, что соответствует молекулярной массе гамма-интерферона быка. Сканирование электрофоретограмм позволяет измерить содержание интерферона в белковой смеси. Оно достигает нескольких процентов от всех белков, экстрагируемых из дрожжевых клеток описанным образом.

Полученный штамм дрожжей ВКПМ Y-1223 синтезирует гамма-интерферон быка около 10 мг на 1 л дрожжевой культуры.