[5]Изобретение относится к иммунологии, аналитической биохимии и диагностике и представляет собой тест-полоску для высокочувствительного иммунохроматографического анализа.
[6]Иммунохимический анализ может быть реализован в различных форматах. Однако, поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ, для которого все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора (Рис.1). Проба, потенциально содержащая анализируемое соединение (аналит), под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иной маркер), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с аналитом. Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны со вторым компонентом для связывания аналита. Степень связывания маркера в тестовой зоне и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией аналита в пробе (Raphael С. Wong l Harley Y. Tse (Editors) Lateral Flow Immunoassay. Springer, New York, 2009.).
[7]Основное преимущество иммунохроматографии заключается в скорости (время анализа 10-15 мин) и методической простоте анализа (анализ инициируется контактом тест-полоски с пробой и не требует от оператора никаких дополнительных действий). Однако, в силу того, что реакции проходят в проточном режиме, равновесие между иммунореагентами зачастую не достигается и значительная часть аналита не успевает связаться с коллоидным носителем, как следствие, предел обнаружения понижается. Для решения данной проблемы используется прединкубация пробы с коллоидным конъюгатом, которая может быть реализована несколькими способами: либо коллоидный конъюгат смешивается с пробой в отдельной емкости, инкубируется и затем наносится на тест-полоску, либо используется особая конструкция кассеты, в которую упаковывается тест-полоска, предусматривающая возможность предварительного смешения реагентов и дополнительных манипуляций для приведения реагентов в контакт с рабочей мембраной теста. Второй способ используется, например, в тест-системе ImmunoCAP™ Rapid (Phadia АВ) для серодиагностики аллергии на пыльцу растений (http://www.phadia.com/Global/A%20Document%20Library/Allergy/Promotion%20Material/IC%20Rapid/ImmunoCAP_Rapid_Test_Procedure_US.pdf). Данная тест-система снабжена специальной кассетой с двумя емкостями, в одной из которых смешивается проба с коллоидным конъюгатом и инкубируется в течение 5 мин, а во вторую емкость по истечении 5 мин добавляется смывающий раствор, который протекает через зону со смешанными конъюгатом и пробой и вместе с ними протекает дальше через рабочую мембрану.
[8]В настоящей заявке предлагается альтернативный способ обеспечения прединкубации реагентов, для обеспечения которого не требуется ни использования специальных кассет, ни дополнительных манипуляционных стадий. Данный способ предполагает использование дополнительной стекловолоконной мембраны, которая находится в мультимембранном композите тест-полоски сразу после мембраны с нанесенным коллоидным конъюгатом и перед рабочей мембраной. На данную дополнительную мембрану наносится концентрированный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (>10% по массе) и затем высушивается. Когда жидкая проба последовательно диффундирует через мембраны тест-полоски, она сначала попадает на подложку с коллоидным конъюгатом, инициируя реакцию аналита с иммобилизованным на поверхности коллоидных частиц компонентом для связывания данного аналита, затем фронт жидкости попадает на мембрану с высушенным БСА и замедляется, так как БСА забивает поры мембраны. В то время пока фронт жидкости медленно растворяет высушенный БСА происходит инкубация пробы с конъюгатом, после растворения БСА и освобождения пор мембраны жидкость продолжает течение и инициирует последующие стадии иммунохроматографического анализа.
[9]Предложенный подход был реализован заявителями в системе для серодиагностики туберкулеза с использованием антигена 38 кДа (Ag78, antigen 5, PhoS, Rv0934) M tuberculosis. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.
[11]Для формирования тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), мембрану под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045, для нанесения БСА использовалась мембрана PT-R5.
[12]На мембраны были нанесены следующие реагенты:
[13]1. Белок А из Staphylococcus aureus, производства ООО «Имтек» (Россия).
[14]2. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis (Rv0934), фирмы «Arista Biologicals Inc.» (США), кат. № AGMTB-0220.
[15]3. Моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis, Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия).
[16]Для формирования аналитической зоны использовали белок А, контрольной зоны - Моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора белка А (10,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7,4) и 2 мкл раствора антител (0,5 мг/мл в том же буфере). Конъюгат коллоидного золота с антигеном наносили в разведении, соответствующем D520=3,0, в объеме 8 мкл на 1 см полосы. Раствор БСА наносили из концентрации 10% по массе в объеме 6 мкл на 1 см полосы на мембрану длиной 5 мм. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). После нанесения реагентов мембраны высушивали не менее 24 ч в помещении с контролируемыми температурой и влажностью. Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.
[17]Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально.
[18]Мембрана с нанесенным БСА задерживала фронт диффундирующей жидкости примерно на 1 мин, в то время как без дополнительной мембраны фронт жидкости после попадания на мембрану с коллоидным конъюгатом достигал аналитической зоны за 10 с и вследствие меньшего времени взаимодействия реагентов интенсивность окраски аналитической зоны была существенно ниже (Рис.2): приблизительно в 6 раз, что позволяет детектировать (пропорционально - в 6 раз) меньшие концентрации антител.
[19]КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[20]Рис.1. Принцип иммунохроматографического анализа для серодиагностики. 1 - мембрана, адсорбирующая образец; 2 - частицы коллоидного золота; 3 - реагент для связывания антител: антивидовые антитела, белок A, белок G или др.; 4 - пластиковая основа; 5 - рабочая мембрана; 6 - конечная адсорбирующая мембрана; 7 - антиген, иммобилизованный в аналитической зоне; 8 - антивидовые антитела, иммобилизованные в контрольной зоне.
[21]Рис.2. Тестирование сыворотки крови больного туберкулезом в стандартной комплектации тест-системы (А) и в комплектации с нанесенным раствором 10% БСА (Б) (Стрелкой указано положение аналитической зоны).
