[2]Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения биологического средства - пищевых волокон, улучшающих работу пищевого тракта.
[3]Начало XXI века ознаменовалось усиленным интересом к лекарственным веществам, получаемым из мицелиальных грибов и направленных на лечение ряда тяжелых и трудно излечимых заболеваний, в частности, онкологических, сердечно-сосудистых, ран различной этиологии и др. Успехи в этом направлении привели к созданию новой отрасли медицины, в которой стали использовать лекарственные препараты с активными началами, полученными из грибов.
[4]До 80-х годов прошлого столетия в пищу людей вводились рафинированные и очищенные от сложных биологических компонентов продукты. Считалось, что такие вещества как пектин, коллаген и целлюлоза не усваиваются организмом, и эти балластные вещества, как их стали называть, являются ненужными и даже вредными. Позднее эти балластные биополимеры стали называть пищевыми волокнами (dietary fiber, ПВ). К началу XXI века было установлено, что отсутствие ПВ ухудшает работу пищеварительного тракта и приводит к таким заболеваниям, как диабет, ожирение, гипертония, желчекаменная болезнь. Способность к гелеобразованию и изменению объема в зависимости от условий позволяет ПВ влиять на моторику кишечника и процессы эвакуации химуса. Большое влияние на работу желудочно-кишечного тракта оказывает наличие в ПВ растительного происхождения карбоксильных групп, которые участвуют в качестве буфера в процессах изменения рН. Эти же группы обеспечивают адсорбцию ионов, в том числе многозарядных катионов, образующих с карбоксильными группами устойчивые хелатные комплексы. Эти данные привели к созданию новой теории питания, в которой значительная роль отводилась ПВ, и за последние 10 лет ни одному из компонентов пищи не было посвящено столько исследований, сколько пищевым волокнам. Была даже создана так называемая «пищевая пирамида», очень популярная в настоящее время. Основой пирамиды являются такие продукты, которые содержат ПВ - хлеб, зерновые, картофель и другие растительные продукты. Считается, что для поддержания здоровья взрослому человеку требуется в сутки 25-30 граммов ПВ.
[5]В настоящее время за рубежом ПВ уже давно широко используются как добавки к пище. Только в 1992 году в США появилось более 300 новых видов лечебно-диагностических пищевых добавок с ПВ. ПВ широко используют также как добавки к мясо-овощным изделиям, при выпечке хлеба, изготовлении мороженого, шоколада, конфет, рыбных блюд. В самые последние годы в центре внимания медиков и диетологов оказались высокомолекулярные биополимеры полисахаридной природы, которые не перевариваются и не всасываются в желудочно-кишечном тракте и выводятся из организма. ПВ из мицелиальных грибов, относящихся к базидиомицетам и аскомицетам, представлены β-глюканами, хитином и гетерополисахаридами (полиуронидами, гемицеллюлозой и пектиновыми веществами). Эти биополимеры также содержатся в клеточных стенках грибов, и их предполагают использовать для очистки желудка от канцерогенных веществ и ионов тяжелых и радиоактивных металлов. Кроме того, эти биополимеры способны усиливать перистальтику желудочно-кишечного тракта ( Wasser S.P., Weis A.L. Medical properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review) // Int. J. Med. Mushrooms. 1999. V.1. P.31-62).
[6]С этой целью в настоящее время используют пока только хитозановые нити, получаемые из панцирей крабов и криля, которые производит ЗАО «Восток-БОР». Для медицинских целей предполагается использовать также хитин-глюкановый комплекс (ХГК) из высших грибов. Преимущество этого комплекса, получаемого из грибов, по сравнению с аналогами из ракообразных, состоит в том, что ХГК грибов:
[7]1) обладает более высокой сорбционной емкостью и активнее сорбирует ионы тяжелых и радиоактивных металлов. При этом сорбционные свойства хитина и хитозана значительно увеличиваются в комплексе с глюканами, в частности, с присутствующими только у грибов сильно разветвленными β-(1-3)-глюканами с (1-6)-боковыми цепями;
[8]2) имеет выраженную способность сорбировать канцерогенные соединения и, кроме того, может подавлять развитие раковых метастазов. В частности, глюканы грибов влияют на супрессивную активность хелперных Т-клеток, восстанавливая гуморальную иммунную систему;
[9]3) способствует усилению «слабительного» эффекта, чему в настоящее время медики придают особое значение, рассматривая «вялый» желудок, как фактор онкологического риска;
[10]4) стоит значительно дешевле, не связан с сезонностью, технологии получения являются экологически чистыми и обеспечивают неограниченное производство. Для их получения можно использовать отходы других грибных производств, например, получения лимонной кислоты и каротиноидов.
[11]Известны несколько способов извлечения и определения содержания пищевых волокон, в частности из растений (Talmadge K.W., Keegstra К., Bauer W.D., Albersheim P. The structure of the plant cell wall // Plant. Physiol. 1973. V.51. №1. P.158-173). С этой целью материал гомогенизируют, далее проводят серию экстракций, удаляя из клеток внутриклеточное содержимое отмывкой фосфатным буфером (рН 6,0), этиловым спиртом, дистиллированной водой с ацетоном. Выделенные клеточные стенки, состоящие в основном из целлюлозы, промывают 3 раза 80% этанолом, исходным буфером, центрифугируют и удаляют крахмал обработкой α-амилазой.
[12]Известны также способы получения ПВ животного происхождения, которые используют как необходимые компоненты для создания новых и эффективных пищевых продуктов (Неклюдов А.Д. Пищевые волокна животного происхождения. Коллаген и его фракции как необходимые компоненты для новых и эффективных пищевых продуктов // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т.19. №3. С.261-272). Для получения коллагеновых фибрилл, называемых тропоколлагеном, кожные покровы молодых животных экстрагируют холодными солевыми растворами или разведенными кислотами. Известен также способ получения ПВ из жома - отхода переработки сахарной свеклы. С этой целью жом проходит термическую обработку, водную экстракцию, прессование, сушку и помол. В результате получают продукт, содержащий пектин, который назвали «волокна свекловичные»( Ковалева Т. Лечебные пищевые волокна // Информкондитер. 2005. С.1-3).
[13]Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ПВ из мицелия базидиальных грибов рода Pleurotus (вешенки) (Chung P. Dietary fiber content and composition of cultivated edible mushroom fruiting bodies and mycelia // J. Agric. Food. Chem. 1996, V. 44. P. 468-471). Согласно этому способу базидиальные грибы, в частности, Pleurotus sajor-caju выращивают на среде следующего состава (г/л): картофельно-декстрозный бульон - 24, КН2РO4 - 0,4, К2НРO4 - 1, MgSO4 - 0,5 и аспарагин - 2. Мицелий грибов, выращенный на этой среде, отделяют от культуральной жидкости фильтрацией через стеклянный волокнистый фильтр, промывают дистиллированной водой и лиофильно высушивают. Сухой образец мицелия размельчают на мельнице, пропускают через сито 0,5 мм и экстрагируют петролейным эфиром с перемешиванием. Далее сухой образец обрабатывают двумя амилазами: устойчивой к нагреванию α-амилазой в течение 15 минут в кипящей водяной бане, и амилоглюкозидазой - 1 час при 60°С для удаления гликогена, затем протеазой для солюбилизации белков. После осаждения 78% спиртом нерастворимый в этаноле осадок отделяют путем осаждения, взвешивают его и вес корректируют с весом золы и остаточного содержания белка. Выход хитина составляет 10,9%.
[14]Недостатком данного способа является использование дорогостоящих реактивов, в частности, трех ферментных препаратов, возможная нестабильность их действия в условиях масштабированного производства, что может сказаться на качестве ПВ с отклонением от стандарта. Подтверждение этому можно найти также в работе (Черкасова Е.И., Алексеева М.Ф., Пастухов М.О., Кириленко Ю.К., Смирнова Л.А. Ферментативное выделение хитиновых комплексов и хитина из плодовых тел вешенки // Материалы 7 Международной конференции. С.-Пб., Репино. 2003. С.417-419), в которой показано, что использование ферментов для получения ХГК из вешенки приводит к снижению содержания хитина.
[15]Задача изобретения заключается в разработке более эффективного, дешевого и менее трудоемкого способа получения ПВ, обеспечивающего стандартизацию конечного продукта при его получении биотехнологическим способом в заводских условиях. При этом получают ПВ с высоким содержанием хитина, который является основным по медицинскому назначению компонентом гриба.
[16]Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что выращенный и отделенный путем фильтрации предварительно замороженный мицелий базидиальных грибов рода Pleurotus ostreatus (вешенки) подвергают дезинтеграции, далее осуществляют экстракцию холодной и горячей водой, затем щелочным и кислым растворами с использованием смеси водного раствора соды или гидроокиси натрия с этанолом и водного раствора лимонной кислоты с последующим отделением осадка путем центрифугирования. При этом выращивание грибов ведут на питательной среде, содержащей соевую муку, молочную сыворотку, однозамещенный фосфат калия и сульфат магния. Выход ПВ составляет 17-18% от сухой массы мицелия. Получаемые по данному способу ПВ содержат 19% хитина и 50% β-(1-3)-глюкана.
[17]В предлагаемом способе для очистки ПВ от остаточных белков и жиров, содержащихся в мицелии вешенки, используют химическую обработку биомассы, однако, учитывая пищевое назначение конечного продукта, применяют слабые кислоты и основания, рекомендованные для пищевых производств.
[18]Изобретение поясняется следующими примерами.
[20]Базидиальные грибы Pleurotus ostreatus штамм ИНМИ РАН №3 выращивали на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 21, КН2РO4 - 3,5, MgSO4 - 0,4, молочная сыворотка - 200 мл, вода - до 1 л. Среду стерилизовали при 1 атм. Ферментацию проводили в колбах емкостью 2 л с 300 мл среды при температуре 26-28°С в течение 4 суток. Выход биомассы - 25 г/л. Указанный штамм выделен из базидиоспор вешенки, растущей на осине. Шляпка базидиомы темная с фиолетовым оттенком. Форма шляпок базидиом языковидная. Размер шляпок базидиом в диаметре от 4 до 9 см. Полученную отделением от культуральной жидкости биомассу промывали водой и подвергали глубокому замораживанию в течение 8 часов и после оттаивания разрушали двукратно на дезинтеграторе Panasonic MK-G58PR. Далее биомассу подвергали следующим обработкам:
[21]1 этап - экстракция водой при комнатной температуре в течение 5 минут с перемешиванием,
[22]2 этап - двукратная водная экстракция при 98°С с перемешиванием;
[23]3 этап - двукратная обработка смесью 1 М раствора Na2СО3 с этанолом в соотношении 1:2 в течение 15 минут с перемешиванием при комнатной температуре;
[24]4 этап - обработка 0,5 М раствором лимонной кислоты в течение 5 минут с перемешиванием при комнатной температуре.
[25]Выход ПВ составляет 16-18% от сухой биомассы. В ПВ содержание хитина составляет 16-19%, глюкана - 40-50%. Определение содержания полисахаридов проводили описанным способом (Терешина В.М., Меморская А. С., Феофилова Е.П. и др. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования. Микробиология. 1997. Т.66. №1. С.84-89). Содержание глюкозамина - 14% от массы ПВ.
[27]Способ осуществляли согласно примеру 1, но в качестве базидиальных грибов использовали Pleurotus ostreatus штамм ИНМИ РАН №2, вместо Na2CO3 использовали 1М раствор NaOH.
[28]Указанный штамм выделен из базидиоспор вешенки, растущей на березе. Шляпка базидиомы пепельно-серая, к зрелости приобретает желтоватый оттенок. Форма шляпок базидиом широковоронковидная. Размер шляпок базидиом в диаметре от 3 до 10 см.
[29]Выход ПВ - 15,8% от сухой биомассы, содержание в ПВ хитина - 15,9%, глюкана - 40,3%.
[31]Способ осуществляли согласно примеру 1, но экстракцию холодной водой вели в течение 10 минут, экстракцию горячей водой - в течение 20 минут. Обработку бикарбонатом натрия и лимонной кислотой вели при нагревании - 80-90°С. Выход ПВ составляет 16,4%, содержание в них хитина - 16,4, глюкана - 43,8%.
[33]Способ осуществляли согласно примеру 1, но экстракцию холодной водой производили в течение 10 минут, горячей водой - в течение 20 минут без перемешивания. Щелочную обработку вели 1 М NaOH в течение 1 часа при 80°С, а лимонной кислотой - 20 минут при 98°С. Выход ПВ составляет - 12,1%, содержание в ПВ хитина - 17%, глюкана - 52%.
