патент
№ RU 2681883
МПК C12N11/082

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ГЕМОСОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ

Авторы:
Валуев Лев Иванович Валуев Иван Львович Ванчугова Людмила Витальевна
Все (12)
Номер заявки
2018107291
Дата подачи заявки
28.02.2018
Опубликовано
13.03.2019
Страна
RU
Дата приоритета
24.05.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает получение гемосорбента путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0,01-0,08% мас. модифицирующей добавки - гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты с получением гидрогеля. Полученный гидрогель измельчают и промывают его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений. Изобретение позволяет повысить тромборезистентность гемосорбента. 1 табл., 10 пр.

Формула изобретения

Способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0,01-0,08% мас. модифицирующей добавки, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, отличающийся тем, что в качестве модифицирующей добавки используют гирудин, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты.

Описание

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ. Гемосорбент используют для удаления протеолитических ферментов из водных растворов, включая кровь, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.

Известен способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0.1-0.9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7.0-12.0% мас. акриламида и 0.5-1.1% мас. N,N'-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985]. Емкость гемосорбента составляет 0.8-1.0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.

Используемый овомукоид является ингибитором протеолитических ферментов и относится к классу гликопротеинов. Он имеет молекулярную массу 31000 и содержит 12.5% глюкозамина и 7.8% других сахаров. Его выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В., Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе, Биохимия, 1981. Т. 46. №3. С. 473-480]. Одна молекула овомукоида способна одновременно связать одну молекулу химотрипсина и две молекулы трипсина.

Этот гемосорбент под названием «Овосорб» находит практическое применение для удаления протеолитических ферментов из крови, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая общий гнойный перитонит, острый деструктивный панкреатит, обширные гнойно-некротические процессы мягких тканей, ожоговая болезнь, синдром сдавливания, синдром отторжения после трансплантации органов и тканей, лучевая болезнь, острая печеночная недостаточность, острая и хроническая почечная недостаточность, бронхиальная астма и т.д. Овомукоид эффективно связывает трипсин, химотрипсин, катепсин, панкреатическую и нейтрофильную эластазы, а также бактериальные протеиназы, не изменяя концентрации предшественников и ингибиторов этих ферментов. Клинические данные свидетельствуют о высокой эффективности антипротеиназного биоспецифического гемосорбента «Овосорб» в коррекции нарушений белкового метаболизма и связанных с ними системных нарушений. Селективно удаляя из гемоциркуляции активные формы протеиназ, «Овосорб» в отличии от угольных гемосорбентов не обладает свойством неспецифической сорбции ингибиторов протеиназ и других индивидуальных белков плазмы. Одновременно уменьшается выраженность функциональных нарушений основных органов и систем жизнеобеспечения, происходит нормализация метаболических процессов поддержания гомеостаза в целом.

Недостатком известного способа является невысокая тромборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови при контакте с гемосорбентом составляет 5-7 минут.В связи с этим, для предотвращения свертывания крови в процессе проведения операции гемосорбции пациентам вводят антикоагулянт крови - гепарин, в количестве порядка 1.0 мг на 1 кг массы с последующей его нейтрализацией.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре водного раствора, содержащего 7.0-10.0% масс. акриламида, 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 0.5-1.0% масс. N,N'-метиленбисакриламида и 0.01-0.08% масс. модифицирующей добавки с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Патент Российской Федерации №2484475. G01N 33/53. Бюл. №16. 2013].

В качестве модифицирующей добавки используют меркаптоуксусную кислоту, которая при полимеризации встраивается в полимерные цепи, обеспечивая повышение емкости гемосорбента до 1.75 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.

Недостатком известного способа является невысокая тромборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови при контакте с гемосорбентом составляет 5-7 минут.

Задачей изобретения является повышение тромборезистентности гемосорбента.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение тромборезистентности гемосорбента.

Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического гемосорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9% мас. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-10,0% мас. акриламида и 0,5-1,1% мас. N,N'-метиленбисакриламида в присутствии 0.01-0.08% масс. модифицирующей добавки, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, в качестве модифицирующей добавки используют гирудин, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты.

Гирудин - полипептид, выделяемый из слюнных желез медицинских пиявок или получаемый рекомбинантным способом, состоит из 65 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 12000. Основная биологическая функция гирудина заключается в предотвращение свертывания крови за счет нейтрализации свертывающей активности тромбина при образовании комплекса тромбин-гирудин [Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V. 19. P. 924-932]. Гирудин является антикоагулянтом прямого действия. В отличие от известного антикоагулянта крови - гепарина, он не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов. В связи с этим, в последние годы этот препарат получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, при которых гепаринотерапия оказывается недостаточно эффективной, например в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д.

Ацилирование гирудина проводят путем растворения 0.1 г гирудина в 50 мл бикарбонатного буфера при рН 8,0 и добавлением к раствору 0,1 мл хлорангидрида акриловой кислоты при перемешивании (4°С, 30 минут). Ацилированный гирудин выделяют путем лиофильного высушивания.

Ацилирование овомукоида проводят аналогичным способом.

Пример 1. В 89 мл дистиллированной воды при комнатной температуре и перемешивании растворяют 0.1 г овомукоида, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 8.0 г акриламида, 1.0 г N,N'-метиленбисакриламида и 0.01 г гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты. После полного растворения всех веществ в раствор добавляют катализатор: 0,08 г персульфата аммония и 0,08 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. Раствор вакуумируют при 10-12 мм рт.ст. и выдерживают при комнатной температуре (18-21°С) в течение 5 часов. Полученный гель извлекают из сосуда, измельчают продавливанием через сито с диаметром пор 1 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН=8,0 до полного удаления непрореагировавших веществ. Полноту удаления контролируют спектрофотометрически.

Количество иммобилизованного в гемосорбенте овомукоида определяют по разнице между исходной концентрацией овомукоида и его концентрацией в промывных водах.

Для изучения емкости гемосорбента его помещают в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускают водный раствор с рН 7,4 или плазму крови человека, содержащие 2,0 мг трипсина и 1,1 мг α-химотрипсина в 3.0 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированных ферментов определяют путем смывания их с колонки водным раствором с рН 1,5.

Для определения времени свертывания крови в стеклянной пробирке 2.0 г гемосорбента инкубируют с 5.0 мл крови и определяют время образования сгустка крови.

Состав исходного раствора и свойства сорбента приведены в таблице.

Примеры 2-7. Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества исходных соединений.

Состав исходных растворов и свойства сорбентов приведены в таблице.

Примеры 8-10 (контрольные). Процесс проводят по способу-прототипу без добавления гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты.

*- сорбция из водного раствора, рН=7,4

** - сорбция из плазмы крови человека

Из таблицы видно, что использование гирудина, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, который в процессе полимеризации встраивается в полимерные цепи гемосорбента, приводит к существенному повышению тромборезистентности гемосорбента. Время образования тромбинового сгустка при контакте гемосорбента с кровью увеличивается по сравнению с гемосорбентом, полученным по способу-прототипу, с 5-7 до 24-25 минут при сохранении эффективности связывания протеиназ иммобилизованным овомукоидом порядка 1.6-2.1 мг протеиназы на 1 мг овомукоида.

Предельные значения ацилированного гирудина в исходной смеси определяются тем, что при его концентрации ниже 0,01% мас. время свертывания крови увеличивается незначительно, а при повышении концентрации выше 0.08% время свертывания крови не изменяется.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать биоспецифический гемосорбент, обладающий повышенной тромборезистентностью по сравнению с гемосорбентом, полученным по способу-прототипу.

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты