[1]Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам извлечения липидной фракции из биомассы одноклеточной микроводоросли рода Chlorella. Способ применяется для извлечения липидной фракции из биомассы микроводорослей, предварительно выращенной в фотобиореакторах различных типов (как открытых, так и закрытых, включая плоские и трубчатые). Выделенные липиды служат сырьем для получения биодизеля.
[2]Устойчивая к химическим воздействиям клеточная стенка микроводорослей является основным препятствием для извлечения из клетки биологически активных веществ.
[3]Известен способ получения комплекса биологически активных веществ, содержащих ферменты и антибиотические вещества, из биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris [Патент RU 2256700 C12R 1/89, C12N 1/12, С12Н 1/00, C12N 1/12, А23K1, A23J 3/20]. Данный способ предусматривает культивирование биомассы водоросли, разрушение клеток биомассы и экстракцию биологически активных веществ. Для разрушения клеточных стенок авторы используют двукратное замораживание биомассы: первичное замораживание биомассы в зависимости от вида конечного продукта осуществляют при температуре от -13 до -15°С в течении 40-60 мин. После дефростации осуществляют повторное замораживание биомассы при температуре -4°С в течение 5 часов. Для экстракции используют католит, полученный в диафрагменном электролизере. Данный способ имеет ряд недостатков, основным из которых является неэффективность разрушения клеток биомассы методом замораживания и длительность процесса. Кроме этого, на суммарной экономической эффективности процесса получения биологически активных веществ данным способом отрицательно сказывается и использование дорогостоящего католита.
[4]Известен способ извлечения липидной фракции из биомассы микроводоросли Chlorella [Патент RU 2388812 C12N 1/12, С12Р 7/64], при котором на первой стадии разрушение клеточных оболочек микроводоросли Chlorella проводят в аппарате, создающем вихревое электромагнитное поле с хаотически движущимися ферромагнитными частицами, воздействующими на сырье. Далее полученную суспензию разрушенных таким образом клеток микроводоросли подвергают экстракции органическим растворителем нефрас-С с наложением импульсно-кавитационного воздействия в роторном импульсно-кавитационном аппарате. В данном техническом решении можно отметить следующие недостатки. Создание вихревого электромагнитного поля для разрушения клеток путем взаимодействия с хаотически движущимися ферромагнитными частицами требует больших энергозатрат.
[5]Известен способ извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella [Патент RU 2460771 C12N 1/12, А23К 1/00, F61K 8/00], согласно которому высушенную до влажности 10% биомассу механически активируют в активаторах планетарного, вибрационного или виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел 60-400 м/с2 при времени пребывания в зоне обработки 0.5-10 мин. Измельченную биомассу микроводоросли суспендируют в органическом растворителе (бензин или этиловый спирт) из расчета 5-7 литров органического растворителя на 1 кг сухой биомассы, с последующей экстракцией при комнатной температуре в течение 3-5 часов. Полученный экстракт фильтрованием разделяют на растворимую и нерастворимую части и сушат с получением сухого липидно-пигментного комплекса. К недостаткам данного способа можно отнести низкий выход липидно-пигментного комплекса 12-13% (массовых).
[6]Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella [Патент RU 2044770 C1, C12N 1/12, С12Р 21/00, A23J 3/20, А23K 1/00,1992] - двухстадийный способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella, который позволяет получить продукты различной природы. На первой стадии для получения липидно-пигментного комплекса с максимальным выходом сухую биомассу микроводоросли заливают 6 л экстрагента (этанол, бензин или смесь этанол-бензин (1:2)) и перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре. Экстракт отделяют фильтрованием, а оставшуюся биомассу заливают свежей порцией растворителя в объеме 4 л, перемешивают в течение 3 ч и фильтруют. Экстракты объединяют и концентрируют в вакуумном испарителе при температуре не выше 45°С. Конечными продуктами являются липидпигментный комплекс с выходом 11-15% (массовых) и обезжиренная биомасса. На второй стадии процесса обезжиренную биомассу подвергают гидролизу ферментами целлюлолитического и протеолитического действия, проводят термообработку для инактивации ферментов, разделяют белковый гидролизат и шрот. Недостатками данного способа являются неполное извлечение липидной фракции, длительность проведения экстракции, а также большие объемы используемых растворителей.
[7]Техническим результатом, на которое направлено изобретение, является повышение выхода липидов при сокращении времени процесса, уменьшении объемов используемых растворителей, что приводит к удешевлению способа и повышению его экологичности.
[8]Для достижения указанного результата предложен способ выделения липидов из биомассы микроводоросли рода Chlorella, заключающийся в том, что биомассу микроводоросли обрабатывают органическим растворителем, и полученные липиды отделяют, при этом указанные операции проводят дважды, с последующим объединением целевого продукта, при этом предварительно сухую биомассу микроводоросли с влагосодержанием не более 10% гомогенизируют измельчением, заливают органическим растворителем и полученную суспензию биомассы подвергают обработке ультразвуком.
[10]- обработку ультразвуком проводят с частотой 30-50 кГц в течение 5-20 минут,
[11]- в качестве органического растворителя используют смесь хлороформ-метанол в соотношении 1:2-2:1,
[12]- в качестве органического растворителя используют смесь хлороформ-этанол в соотношении 1:2-2:1.
[13]Недостатки известных способов будут устранены предлагаемым нами методом, основной задачей которого является разработка способа извлечения липидной фракции из биомассы микроводоросли рода Chlorella, обеспечивающего наиболее полное извлечение липидов.
[14]Для достижения максимального извлечения липидной фракции предлагаемое нами изобретение предполагает проведение комплексного разрушения клеточной стенки микроводоросли с последующей экстракцией целевого продукта органическим растворителем. Согласно предлагаемому способу культивируют штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1. Сухую биомассу с влагосодержанием не более 10% (это оптимальное значение, большее содержание влаги затрудняет процесс экстракции, приводя к необходимости увеличивать расход растворителя) гомогенизируют измельчением и суспензируют в органическом растворителе, например, смеси хлороформ-метанол, хлороформ-этанол. Дальнейшее разрушение клеток проводят ультразвуком. Полученную суспензию при комнатной температуре экстрагируют органическим растворителем. По окончанию экстрагирования проводят разделение, например, фильтрованием. Нерастворимую часть подвергают повторной экстракции и разделяют. Объединенный экстракт сушат и получают липидную фракцию, выход которой составляет до 25.5% (по массе). Нерастворимый остаток - обезжиренная биомасса (шрот) содержит белки и после дополнительной обработки может использоваться в качестве белковой кормовой добавки. Предлагаемый способ позволяет повысить степень извлечения липидов, сократив при этом время проведения процесса и уменьшить расход растворителей.
[15]В качестве сырья используют, например, биомассу микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1, основной липидной фракцией которой являются триацилглицерины (триглицериды). При исследовании состава жирных кислот липидов микроводоросли установлено, что преобладающими являются ненасыщенные жирные кислот (суммарное содержание которых составляет более 60% от суммы жирных кислот), основными из которых являются C18 жирные кислоты: линолевая кислота (C18:2, 31.54%), линоленовая (C18:3, 10.50%) и олеиновая (C18:1, 3.60%), а также C16 ненасыщенные кислоты, представленные C16:2 (7.75%) и C16:3 (13.44%). Насыщенные кислоты представлены в основном пальмитиновой кислотой (C16:0, 21.57%).
[16]Способ осуществляется следующим образом:
[17]1. навеску сухой биомассы микроводоросли (влагосодержание не более 10%) гомогенизируют, например, с использованием шаровой мельницы (размер стеклянных бус 0.1-0.5 мм, скорость вращения ротора 2800-3000 об/мин) в течение 3-5 минут;
[18]2. измельченную биомассу суспензируют в 0.5-1.5 л органического растворителя, например, смеси хлороформ-метанол (1:2, 2:1), хлороформ-этанол (1:2, 2:1). Указанные диапазоны позволяют достичь наибольшей степени извлечения целевого продукта при экстракции.
[19]3. суспензию биомассы подвергают обработке ультразвуком при 30-50 кГц в течение 5-20 минут. Использование других параметров на этой стадии не оказывает влияния на технический результат - выход липидов не изменяется;
[20]4. к суспензии добавляют 0.5-3.5 л органического растворителя, использованного на стадии 2;
[21]5. экстракцию липидов проводят при комнатной температуре в течение 0.5-2 часов;
[22]6. полученную суспензию разделяют фильтрованием;
[23]7. нерастворимый остаток биомассы заливают свежей порцией 2-4 литра органического растворителя;
[24]8. экстракцию липидов проводят при комнатной температуре в течение 0.5-2 часов;
[25]9. полученную суспензию разделяют фильтрованием;
[26]10. объединенный органический экстракт со стадии 6 и 9 упаривают в вакуумном испарителе;
[27]11. выделенную липидную фракцию сушат.
[28]Пример 1. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1 культивируют в течение 96 часов. Клетки осаждают центифугированием. Полученную биомассу высушивают. 1 кг сухой биомассы Chlorella vulgaris GKV-1 (влагосодержание не более 10%) измельчают, например, с использованием шаровой мельницы (размер стеклянных бус 0.5 мм, скорость вращения ротора 3000 об/мин) в течение 4 минут. Полученный продукт суспензируют в 1 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и подвергают обработке ультразвуком при 50 кГц в течение 10 минут. Далее к суспензии добавляют 3 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 1 часа. Экстракт отделяют фильтрованием. Оставшуюся биомассу (нерастворимый осадок) заливают 3 л смеси хлороформ-метанол (2:1) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 45 минут. Экстракт отделяют фильтрованием. Объединенный экстракт упаривают в вакуумном испарителе и далее сушат. Выход липидов составляет 22.05%.
[29]Пример 2. То же, что в примере 2, но вместо смеси хлороформ-метанол использовали смесь хлороформ-этанол. Выход липидов составляет 25.50%.
[30]Пример 3. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1 культивируют в течение 96 часов. Клетки осаждают центрифугированием. Полученную биомассу высушивают. 1 кг сухой биомассы Chlorella vulgaris GKV-1 (влагосодержание не более 10%) измельчают, например, с использованием шаровой мельницы (размер стеклянных бус 0.5 мм, скорость вращения ротора 3000 об/мин) в течение 4 минут. Полученный продукт суспензируют в 1 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и проводят экстракцию при обработке ультразвуком при 30 кГц, мощности 100 Вт в режиме непрерывного озвучивания в течение 5 минут. Далее к суспензии добавляют 3 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 1 часа. Экстракт отделяют фильтрованием. Оставшуюся биомассу (нерастворимый осадок) заливают 3 л смеси хлороформ-метанол (2:1) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 45 минут. Экстракт отделяют фильтрованием. Объединенный экстракт упаривают в вакуумном испарителе и далее сушат. Выход липидов составляет 14.77%.
[31]Пример 4. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 10 минут. Выход липидов составляет 13.82%.
[32]Пример 5. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 15 минут. Выход липидов составляет 13.38%.
[33]Пример 6. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили 20 минут. Выход липидов составляет 12.92%.
[34]Пример 7. То же, что и в примере 3, но и вместо смеси хлороформ-метанол использовали смесь хлороформ-этанол. Выход липидов составляет 19.49%.
[35]Пример 8. То же, что и в примере 7, но обработку ультразвуком проводили в течение 10 минут. Выход липидов составляет 18.09%.
[36]Пример 9. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 15 минут. Выход липидов составляет 17.94%.
[37]Пример 10. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 20 минут. Выход липидов составляет 17.98%.
[38]Выход липидов (% от асб) при различном времени обработки биомассы УЗ (рабочая частота 30 кГц, мощность 100 Вт, режим озвучивания непрерывный) с использованием различных смесей растворителей показан в таблице 1.
[39]
[40]Аналогичные эксперименты были проведены при обработке биомассы ультразвуком 50 кГц и добавлены их результаты.
[41]Выход липидов (% от асб) при различном времени обработки биомассы УЗ (рабочая частота 50 кГц, мощность 100 Вт, режим озвучивания непрерывный) с использованием различных смесей растворителей показан в таблице 2.
[42]
[43]
[44]Согласно аналогу, время экстракции составляет не менее 9 часов (время необходимое на непосредственно экстракцию без дополнительных стадий разделения и пр.), в нашем способе время, затраченное на экстракцию, включая и стадию разрушения клеточной стенки, составляет 2 часа. Согласно аналогу расход растворителей на 1 кг исходной биомассы составляет 10 литров, в нашем способе расход растворителя снижен на 30%.
[45]Таким образом, заявленная совокупность операций, последовательность и режимы их проведения, позволят достичь заявленного результата - повысить выход липидов при сокращении времени процесса, уменьшении объемов используемых растворителей, что приводит к удешевлению способа и повышению его экологичности - по сравнению с аналогом: время экстракции сокращено в 4,5 раза (с 9 часов аналога до 2 часов в нашем способе); расход растворителей на 1 кг исходной биомассы снижен на 30%.
