патент
№ RU 2606839
МПК A61K9/19

Лекарственный препарат противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата и способ получения лекарственного препарата

Авторы:
Гукасова Надежда Вадимовна Кузнецов Сергей Леонидович Заварзина Василиса Витальевна
Все (21)
Номер заявки
2015145849
Дата подачи заявки
26.10.2015
Опубликовано
10.01.2017
Страна
RU
Дата приоритета
25.06.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Реферат

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой лекарственный препарат противотуберкулезного действия в виде лиофилизата для перорального применения массой 2.0±0.20 г, содержащий D-циклосерин 12.5±1.25 мас.%, полимер PLGA 50/50 50±5.0 мас.%, поливиниловый спирт 12.5±1.25 мас.% и D-маннитол 25±2.5 мас.%, с содержанием D-циклосерина от 0.225 до 0.275 г, который при разбавлении водой в количестве 100±10 мл образует суспензию частиц с размером не более 800 нм, составляющих не менее 90%. Изобретение обеспечивает высокую стабильность в условиях долгосрочного хранения при температуре 5±3°С в течение 18 месяцев и ускоренного хранения при температуре 25±2°С в течение 184 дней, высокую биодоступность, в том числе высокую тканевую биодоступность в органах-мишенях инфекционного процесса, и низкую токсичность, нейротоксичность. 2 н. и 4 з.п. ф-лы. 3 пр., 5 табл.

Формула изобретения

1. Лекарственный препарат противотуберкулезного действия в виде лиофилизата для перорального применения массой 2.0±0.20 г, содержащий D-циклосерин 12.5±1.25 мас.%, полимер PLGA 50/50 50±5.0, мас.%, поливиниловый спирт 12.5±1.25 мас.% и D-маннитол 25±2.5 мас.%, с содержанием D-циклосерина от 0.225 до 0.275 г, который при разбавлении водой в количестве 100±10 мл образует суспензию частиц с размером не более 800 нм, составляющих не менее 90%.
2. Лекарственный препарат по п. 1, отличающийся тем, что используют полимер PLGA 50/50 со средним значением характеристической вязкости 0,41 см3/г.
3. Способ получения лекарственного препарата по п. 1, заключающийся в смешивании водного раствора D-циклосерина с раствором PLGA 50/50 в органическом растворителе дихлорметане с последующим эмульгированием смеси с получением первичной эмульсии, добавлении полученной первичной эмульсии к водному раствору поливинилового спирта с последующим эмульгированием с получением вторичной эмульсии, удалении органического растворителя с получением суспензии, фильтровании суспензии, смешивании суспензии с водным раствором D-маннитола с последующим ее замораживанием и лиофилизацией, при этом при эмульгировании с получением вторичной эмульсии проводят ультразвуковую обработку, перед замораживанием суспензию дозируют в контейнеры равными порциями по 63-67 г для получения конечного лиофилизата массой 2.0±0.20 г, замораживание суспензии проводят при температуре минус 40÷45°С в течение от 10-18 часов, лиофилизацию дозированной замороженной суспензии проводят при остаточном давлении 0.03÷0.1 мбар и комнатной температуре в течение 45-48 ч, с последующим герметичным укупориванием контейнеров.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве водного растворителя используют деионизированную воду.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что используют полимер PLGA 50/50 со средним значением характеристической вязкости 0,41 см3/г.
6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что дозирование суспензии проводят в пластиковые контейнеры объемом 125 мл.

Описание

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к новому поколению противотуберкулезных препаратов на основе D-циклосерина и способа его получения в виде готовой к применению лекарственной формы.

Одной из проблем современной медицины является резкое увеличение числа больных лекарственно-устойчивыми формами туберкулеза (ЛУ-ТБ). Широкое распространение устойчивых форм микобактерий приводит к необходимости создавать новые лекарственные субстанции, либо использовать для лечения пациентов различные комбинации 4-5 препаратов, что резко повышает уровень побочных эффектов и значительно ухудшает качество жизни больного. При лечении больных ЛУ-ТБ, согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, применяют комбинированную схему лечения. Одним из обязательных компонентов таких схем лечения в РФ является D-Циклосерин, представляющий собой аналог и конкурентный антагонист D-аланина. Механизм действия данного препарата основан на способности ингибировать активность ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки бактерий, что позволяет проявлять бактериостатический и бактерицидный эффект в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Помимо широкого спектра антибактериальной активности особенностью D-циклосерина является то, что лекарственная устойчивость М. tuberculosis к нему развивается редко и медленно - в процессе продолжительного (6 месяцев и более) лечения выделяется до 20-30% устойчивых штаммов [1, 2, 3]. Перекрестной резистентности с другими противотуберкулезными средствами для циклосерина не выявлено. Показана эффективность D-циклосерина при атипичных микобактериозах, вызываемых комплексом M. avium-intracellulare, M. xenopi и др [4]. Также возможно применение D-циклосерина при для лечения острых инфекций мочевыводящих путей, вызванных чувствительными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий, в особенности видами Klebsiella/Enterobacter и Escherichia coli [5].

Принимают циклосерин перорально в виде таблеток или капсул. Разовая доза циклосерина для взрослых составляет - 250 мг. Циклосерин принимают 2-4 раза в день: начало лечения 250 мг каждые 12 ч и при необходимости, с учетом переносимости, дозу постепенно повышают до 250 мг каждые 6-8 ч. Средняя суточная доза - 500-750 мг/сут в 2-3 приема, максимальная суточная доза - 1 г в 4 приема [6]. Суточная доза для детей - 10 мг/кг массы тела (не выше 750 мг/сут). Курс лечения циклосерином при туберкулезе составляет 6 месяцев и более.

Длительное применение D-циклосерина затруднено вследствие выраженного отрицательного действия на состояние центральной нервной системы (ЦНС). Высокие дозы препарата вызывают галлюцинаторный психоз с дезориентацией, эйфорией или агрессивностью, кошмарными сновидениями, расстройством памяти. Нестабильность D-циклосерина в нейтральных и кислых водных средах также является одной из основных причин ограничивающих применение в медицинской практике этого феноменального по свойствам биологически активного соединения. Не случайно, что когда все противотуберкулезные препараты оказываются бессильными, прибегают именно к его использованию. Правомерно предположить, что использование лекарственных форм D-циклосерина, позволяющих увеличить стабильность и биодоступность, достигать положительного фармакодинамического действия при меньших вводимых дозах, снизить риск возникновения побочных эффектов, главным образом, нейротоксических, увеличить терапевтический индекс, может привести к значительному прогрессу при лечении туберкулеза.

Уменьшение токсического действия циклосерина достигается назначением в период лечения либо глутаминовой кислоты (по 0,5 г 3-4 раза в день), либо внутримышечным введением натриевой соли аденозинтрифосфорной кислоты (по 1 мл 1% раствора ежедневно), либо внутримышечной инъекцией пиридоксина (1-2 мл 5% раствора в сутки) [7]. По этому, с целью уменьшения осложнений со стороны ЦНС, был создан оригинальный препарат в желатиновых капсулах, содержащий одновременно с циклосерином 2-5 мас.% глутаминой кислоты. Лекарственное средство, описанное в патенте РФ №2248205 «Лекарственное средство в виде желатиновой капсулы» [7] состоит из циклосерина и вспомогательных добавок, включая кальция фосфат дигидрат, аэросил, кальция стеарат при определенном соотношении ингредиентов.

В патенте РФ №103473 «Фармацевтическая капсула противотуберкулезного действия» [8] описана фармацевтическая капсула противотуберкулезного действия, которая содержит два действующих вещества - циклосерин и пиридоксин гидрохлорид, а также вспомогательные вещества (оксид магния, сополимер метакриловой кислоты и метакрилата, стеариновую кислоту, целлюлозу микрокристаллическую, лактозу, кремния диоксид коллоидный, карбоксиметилкрахмал натрия, стеарат магния). Включение пиридоксина в состав способствует нормализации обмена аминокислот и уменьшает интенсивность побочных реакций циклосерина со стороны центральной нервной системы.

Перспективным направлением в создании лекарственных средств нового поколения является создание полимерсодержащих лекарственных средств на основе биодеградируемых полимеров, разрешенных для применения в медицинской практике [9-12], в виде полимерных частиц с включенным (адсорбированным) действующим веществом.

В патентах РФ №2318513 «Лекарственное средство на основе d-циклосерина, препарат пролонгированного действия, содержащий наночастицы, способ его получения» [1] и №2327459 «Лекарственное средство противомикробного действия, способ получения лекарственного препарата направленного действия, содержащего наночастицы» [13] раскрывается способ получения лекарственных средств в виде концентратов в диметилсульфоксиде (ДМСО), содержащих D-циклосерин (патент №2318513) или комбинацию из рифабутина, D-циклосерина, изониазида и пиразинамида (патент №2327459), а также D-маннитол, полисорбат 80, которые в определенном соотношении нагревают при 50-60°С с растворителем (ДМСО) до образования однородной прозрачной жидкости, которую далее охлаждают до комнатной температуры и после разбавления водой образующуюся суспензию, содержащую частицы (размер до 200 нм - патент №2318513; 200-400 нм - патент №2327459), используют по назначению. Экспериментальные данные, приведенные в патентах, свидетельствуют о замедленном выделении в организме активно действующих веществ и достаточно высоком быстродействии в отношении микроорганизмов разных типов (Escherichia coli, Staphylococcus aureus 906, Salmonella spp.), однако противотуберкулезная активность описанных лекарственных средств не изучена. Отличительной особенностью методики приготовления лекарственных средств, описанных в патентах РФ №2318513 и №2327459, является то, что в качестве растворителя компонентов на первой стадии применяется диметилсульфоксид. Недостатком данных композиций является неполная изученность биосовместимости и безопасности использования диметилсульфоксида.

В патенте РФ №2403041 «Лекарственное средство пролонгированного действия с дозированным высвобождением в органы-мишени на основе d-циклосерина для лечения резистентных форм туберкулеза», описывается лекарственное средство противомикробного действия в виде стабильных наночастиц следующего состава и при следующем соотношении компонентов, мас.%: D-циклосерин от 1 до 15; ПЛГА 50/50 от 20 до 40; D-маннитол от 5 до 40; поливиниловый спирт от 5 до 15 [14]. Фармацевтическую композицию получали методом двойного эмульгирования с использованием погружного гомогенизатора типа ротор-статор. Лекарственное средство представляло собой лиофильно высушенный порошок. Средний размер частиц, полученных описанным способом, составлял от 250 до 500 нм. Согласно патенту №2403041 при получении данной фармацевтической композиции в качестве органического растворителя используется хлороформ, что является крайне нежелательным в плане использования такой композиции в клинической практике из-за возможного присутствия посторонних (специфических) примесей в виде данного органического растворителя. Таким образом, в патенте описано лекарственное средство в виде фармацевтической композиции в виде наночастиц, однако отсутствует описание готового лекарственного препарата (лекарственной формы) и способа его получения; такие основные характеристики лекарственных препаратов как стабильность при длительном хранении, биодоступность, токсичность этого лекарственного средства не исследовались.

Сущность настоящего изобретения заключается в разработке нового лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата и законченного технологического цикла его получения, характеристики препарата должны превосходить характеристики существующих препаратов того же назначения.

Следует отметить, что прием лекарственных препаратов в виде суспензий для перорального применения широко используется в клинической практике, в том числе для приема антибактериальных препаратов. Лекарственная форма в виде суспензии обладает рядом преимуществ, к числу которых относятся высокая биодоступность, удобство приема.

Фармацевтической промышленностью выпускаются как собственно суспензии (дисперсная фаза - твердое тело + дисперсионная среда - жидкость), примером которых являются суспензии парацетамола, противогельминтных средств, ряда нитрофуранов и т.д., так и порошки и гранулы, которые образуют суспензии при добавлении к ним воды. К числу последних могут быть отнесены: «Амоксиклав» (амоксициллин + клавулановая кислота), лекарственная форма - порошок для приготовления суспензии для применения внутрь во флаконах, производства фирмы LEK D.D.; «Цефалексин» - порошок/гранулы для приготовления суспензии для приема внутрь, производства фирмы Hemofarm (Сербия); «Сумамед» - порошок для приготовления суспензии для приема внутрь; «Лексин» - порошок для приготовления суспензии для приема внутрь, производства фирмы Hikma (Иордания).

Также на российском фармацевтическом рынке зарегистрированы препараты: «Споридекс», порошок для приготовления суспензии для приема внутрь (Ranbaxi, Индия); «Дурацеф», порошок для приготовления суспензии для приема внутрь (UPSA, Франция); Микстура от кашля для детей сухая Mixture conta tussis for children siccum, представляющий порошок для приготовления раствора для приема внутрь (ЗАО ВИФИТЕХ, РФ); «Бифидумбактерин», лиофилизат для приготовления раствора для приема внутрь (Микроген, РФ); «Пробифор», бифидобактерии, сорбированные на активированном угле; «Оспексин», гранулы для приготовления суспензии для приема внутрь (Biochemie, Австрия), и другие.

Перечисленные выше лекарственные препараты выпускаются в виде порошков/гранул, расфасованы во флаконы, иногда, как микстура от кашля сухая или различные виды пробиотиков - в пакеты из фольги, и предназначены для растворения в воде кипяченой перед приемом внутрь.

Таким образом, при создании лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина наиболее предпочтительным представлялось разработка технологии получения препарата в виде лиофилизата для приготовления суспензии для перорального применения.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка законченного технологического цикла получения противотуберкулезного лекарственного препарата на основе D-циклосерина в виде лиофилизата для перорального применения, обладающего высокой стабильностью (в условиях долгосрочного хранения - при температуре 5±3 С в течение 18 месяцев, и ускоренного хранения - при температуре 25±2 С в течении 184 дней, что соответствует 2 годам хранения при температуре 5±3 С), высокой биодоступностью, в том числе высокой тканевой биодоступностью в органах-мишенях инфекционного процесса (легкие, почки, селезенка), и низкой побочной токсичностью (нейротоксичностью).

Для этого предложен лекарственный препарат противотуберкулезного действия в виде лиофилизата для перорального применения массой 2.0±0.20 г, содержащий D-циклосерин 12.5±1.25 мас.%, полимер PLGA 50/50 50±5.0, мас.%, поливиниловый спирт 12.5±1.25 мас.% и D-маннитол 25±2.5 мас.%, с содержанием D-циклосерина от 0.225 до 0.275 г, который при разбавлении водой в количестве 100±10 мл образует суспензию частиц с размером не более 800 нм, составляющими не менее 90%.

Кроме того,используют полимер PLGA 50/50 со средним значением характеристической вязкости 0,41 см3/г.

Также предложен способ получения лекарственного препарата приведенного выше, заключающийся в смешивании водного раствора D-циклосерина с раствором PLGA 50/50 в органическом растворителе дихлорметане с последующим эмульгированием смеси с получением первичной эмульсии, добавлении полученной первичной эмульсии к водному раствору поливинилового спирта с последующим эмульгированием с получением вторичной эмульсии, удалении органического растворителя с получением суспензии, фильтровании суспензии, смешивании суспензии с водным раствором D-маннитола с последующим ее замораживанием и лиофилизацией, при этом при эмульгировании с получением вторичной эмульсии проводят ультразвуковую обработку, перед замораживанием суспензию дозируют в контейнеры равными порциями по 63-67 г для получения конечного лиофилизата массой 2.0±0.20 г, замораживание суспензии проводят при температуре минус 40÷450 С в течение от 10-18 часов, лиофилизацию дозированной замороженной суспензии проводят при остаточном давлении 0.03÷0.1 мбар и комнатной температуре в течение 45-48 ч, с последующим герметичным укупориванием контейнеров.

Кроме того:

- в качестве водного растворителя используют деионизированную воду.

- используют полимер PLGA 50/50 со средним значением характеристической вязкости 0,41 см3/г.

- дозирование суспензии проводят в пластиковые контейнеры объемом 125 мл.

В ходе экспериментальных исследований применен способ получения лекарственного препарата с использованием в качестве органического растворителя хлористого метилена (метиленхлорид), как наиболее технологичного (легкокипящий и менее токсичный) по сравнению с хлороформом. Для приготовления водных растворов компонентов стала использоваться более чистая деионизированная вода, получаемая из воды очищенной. Для получения частиц использовали сополимер молочной и гликолевой кислот с характеристической вязкостью 0,41 см3/г и молярным соотношением остатков молочной и гликолевой кислот 50 на 50%. При этом увеличенное содержание полимера позволяет повысить стабильность препарата. При отработке процесса получения вторичной эмульсии была введена дополнительная стадия - дополнительное диспергирование вторичной эмульсии с помощью ультразвука. Суспензию, полученную после удаления растворителя, фильтрации и последующего добавления D-маннитола, дозировали - равномерно разливали по 63-67 г в пластиковые контейнеры и после замораживания и лиофилизации получали по 2,0±0,20 г лиофилизата в контейнере (1 доза), содержащем от 0.225 до 0.275 г циклосерина,

Замораживание суспензии, дозированной по пластиковым контейнерам объемом 125 мл выполненными, например, из полиэтилентерефталата (ПЭТФ 37/20/125-Л, 2189) проводили при температуре минус 40÷45°С, в течение 10-18 часов, что обеспечивает получение качественного продукта и возможность перехода к промышленным сублимационным сушкам для лиофолизации препарата.

Лиофилизацию дозированной замороженной суспензии в контейнере проводили при остаточном давлении 0.03÷0.1 мбар и комнатной температуре в течение 45-48 ч, с последующим герметичным укупориванием контейнеров крышками, выполненными, например, из полиэтилена (ПЭ 37-Л, 9160).

Для перорального применения лиофилизат в контейнере разбавляют водой в количестве 100±10 мл с образованием суспензии.

Конечное соотношение компонентов в лиофилизате представлено в таблице 1 «Состав лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата, количество компонентов в контейнере».

При изучении стабильности лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата испытания проводили в двух режимах: а) долгосрочное хранение - при температуре (5±3)°С; б) ускоренное хранение - при температуре (25±2)°С (метод «ускоренного старения»). Метод «ускоренного старения» (хранение при повышенной температуре) основан на зависимости скорости химической реакции от температуры в соответствии с правилом Вант-Гоффа: при повышении температуры на 10°С скорость химической реакции возрастает в 2-4 раза. Срок годности лекарственного средства (С) при температуре хранения (Тхр) рассчитывается по формуле (1):

где

С - срок годности, дней;

Сэ - экспериментальный срок годности, дней;

К - коэффициент соответствия, который рассчитывается по формуле (2):

где

А - температурный коэффициент скорости химической реакции (принимается равным 2);

Тэ - температура экспериментального хранения, °С;

Тхр - температура хранения, °С.

При пересчете срока годности методом ускоренного хранения при температуре (25±2)°С по формуле (1) срок хранения составляет 184 дня, что соответствует 2 годам хранения при температуре (5±3)°С. В процессе хранения образцы лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата контролировались по показателям качества, в числе которых: описание, растворимость, подлинность, показатель pH, размер частиц, суспендируемость, содержание воды, остаточные органические растворители, количественное определение, примеси (родственные соединения). Образцы лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата показали высокую стабильность в условия долгосрочного хранения при температуре (5±3)°С в течение 18 месяцев. Образцы лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата показали высокую стабильность в условия ускоренного хранения при температуре (25±2)°С в течение 184 дней, что соответствует 2 годам хранения при температуре (5±3)°С.

Для определения относительной биодоступности было проведено биофармацевтическое исследование лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата. Проведенное биофармацевтическое исследование выявило оптимизацию фармакокинетических параметров действия D-циклосерина при использовании лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата по сравнению с известным препаратом «Циклосерин», лекарственной формой которого являются капсулы для приема внутрь, что проявилось в увеличении периода полувыведения (Т1/2), среднего времени удерживания лекарственного вещества в организме (MRT), увеличении максимальной концентрации лекарственного вещества в крови (Cmax); снижении скорости элиминации (Kel) и клиренса (Cl.); возрастании площади под фармакокинетической кривой «концентрация - время» (AUC(0→36)) (примерно в 2 раза по сравнению с препаратом сравнения «Циклосерин»). Относительная биодоступность D-циклосерина из лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата по отношению к препарату сравнения «Циклосерин» составляет примерно 200%. Полученные данные свидетельствуют о более высокой биодоступности разработанного лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата и о более длительном нахождении D-циклосерина в кровяном русле в концентрациях достаточных для эффективного лечебного воздействия.

Заявленное изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Получение лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата.

В стеклянном флаконе вместимостью 20 мл растворяли 0.790 г D-циклосерина в 8 мл воды деионизированной (вода для инъекций) при перемешивании на магнитной мешалке при 500 об/мин и комнатной температуре в течение 30÷35 мин. В стеклянном реакторе с крышкой, вместимостью 100 мл растворяли 3.152 г полимера PLGA 50/50 (PURASORB PDLG 5004) в 45 мл (59.7 г) метилена хлористого (дихлорметана) при перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15÷20 мин. К полученному раствору полимера PLGA 50/50 постепенно добавляли раствор D-циклосерина (примерно 1 мл за 15÷20 с) при перемешивании (500 об/мин) на магнитной мешалке. Перемешивание смеси продолжали в течение 13÷15 мин. После этого магнит извлекали и проводили эмульгирование смеси при помощи погружного гомогенизатора IKA® Ultra-Turrax® Т-25 basic (ФРГ), оснащенного диспергирующим элементом (насадкой) S25N - 25F при 24 тыс. об/мин в режиме 3 раза по 0,5 мин с 2 перерывами по 0,5 мин. Температуру смеси поддерживали в пределах 18÷25°С, помещая реакционный сосуд в баню с охлаждающей водой. Полученную первичную эмульсию постепенно добавляли порциями по 4 мл к 0,5% раствору поливинилового спирта (ПВС) в количестве 154.00 г в пластиковом цилиндрическом сосуде вместимостью 1 л при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке (700 об/мин) в течение 2÷3 мин. Смесь продолжали перемешивать в течение 13÷15 мин. Затем магнит извлекали и при помощи погружного гомогенизатора IKA® Ultra-Turrax® Т-25 basic, оснащенного диспергирующим элементом S25N - 25F, эмульгировали смесь при 24 тыс. об/мин в режиме 3 раза по 0.5 мин с 2 перерывами по 0,5 мин. Дополнительно проводили обработку полученной вторичной эмульсии ультразвуком с помощью гомогенизатора LABSONIC® U (В. Braun, США) мощностью 400 Вт при уровне энергии 305÷320 ед. (от максимума 370 ед.). Режим УЗ-обработки: 2 раза по 1 мин и 1,5 мин с перерывом 1 мин. Озвучивание проводили помощью зонда (∅ 19×70 мм) при охлаждении сосуда со смесью в бане с ледяной водой. Полученную эмульсию перегружали в круглодонную колбу вместимостью 2 л, остатки реакционной смеси из реакционного сосуда смывали туда же деионизированной водой (3 раза по 4 мл). Удаление органического растворителя дихлорметана проводили упариванием в вакууме с помощью роторного испарителя. Полученную суспензию фильтровали через стеклянный фильтр (пористость 40÷110 мкм) в круглодонную колбу вместимостью 0.25 л с приготовленным заранее раствором 1.54 г D-маннитола в 10 мл деионизированной воды. Для увеличения скорости фильтрования систему подключали к вакууму. Остатки суспензии из колбы для упаривания и с пористого фильтра смывали деионизированной водой (3 раза по 4 мл). Смесь фильтрата с D-маннитолом перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 8+10 мин. Полученную суспензию разливали поровну (по 63-67 г) стерильным дозатором (шприцем) в три предварительно подготовленные контейнеры вместимостью 125 мл из полиэтилентерефталата (ПЭТФ 37/20/125-Л, 2189). В качестве укупорочного средства для них использовали крышки, выполненные из полиэтилена (ПЭ 37-Л, 9160). Чистоту подготовленной тары контролировали микробиологически. Контроль равномерности наполнения контейнеров осуществляли с помощью весов (с точностью 0,01 г).

Наполненные контейнеры накрывали крышками и помещали для замораживания в камеру морозильника при температуре минус 40÷45°С на период от 10 до 18 ч. Контейнеры с замороженной суспензией помещали под колпак лиофильной сушилки на полку и проводили процесс лиофилизации при остаточном давлении 0.03÷0.1 мбар в течение 45÷48 ч. После окончания процесса высушивания контейнеры с лиофилизатом герметично укупоривали крышками. Проводили анализ продукта. Среднюю массу лиофилизата в контейнере контролировали весовым способом (она должна быть в пределах (2,00±0,20) г).

При этом содержание D-циклосерина в контейнере должно быть в пределах от 0,225 до 0,275 г. Для употребления препарат разбавляют водой в количестве 100±10 мл с образованием суспензии с наночастицами с размером не более 800 нм, составляющими не менее 90%. Средний размер частиц определялся методом динамического светорассеяния.

Пример 2. Изучение стабильности лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата.

Изучение стабильности лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата проводили в двух режимах: а) долгосрочное хранение - при температуре (5±3)°С; б) ускоренное хранение - при температуре (25±2)°С (метод «ускоренного старения»). Контроль показателей качества лекарственного препарата проводили на трех сериях (по 4 образца в каждой серии): при рекомендованных условиях хранения при температуре (5±3)°С - через каждые 6 месяцев, а при ускоренном хранении - через каждые 46 суток, что соответствовало 6 месяцам хранения при рекомендуемой температуре (5±3)°С. Для обеспечения условий долгосрочного хранения образцов использовали холодильник Maxicoldlab 2021 (LKB Branma, Швеция) с температурой внутри камеры (5±3)°С. Для обеспечения условий ускоренного хранения с поддержанием температуры (25±2)°С применяли термостат ТСН 100 (Чехословакия). Температуру в холодильнике и термостате контролировали еженедельно в течение всего срока хранения, поместив внутрь камер стеклянные ртутные термометры. В качестве тары для хранения образцов использовались пластиковые банки из полиэтилентерефталата, укупоренные крышками из полиэтилена (вместимость 125 мл). В процессе хранения образцы контролировались по показателям качества, в числе которых были описание, растворимость, подлинность, показатель рН, размер частиц, суспендируемость, содержание воды, остаточные органические растворители, количественное определение, примеси (родственные соединения). По достижении контрольного срока хранения контейнер с образцом для остановки процесса «старения» помещался в морозильник с температурой -70°С (Ultra-Low Temperature Freezer MDF-382AT Sanyo, Япония) до начала проведения аналитических работ (август-октябрь 2014 г.). Перед проведением анализа контейнер с образцом нагревался на воздухе до комнатной температуры. Результаты анализа образцов после истечения контрольных сроков в условиях долгосрочного и ускоренного хранения приведены в таблице 2 «Результаты исследования показателей качества образцов лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата. в условиях ускоренного хранения при температуре (25±2)°С» и Таблице 3 «Результаты исследования показателей качества образца лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата в условиях долгосрочного хранения при температуре (5±3)°С».

Пример 3. Исследование биодоступности лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата.

Для определения относительной биодоступности было проведено биофармацевтическое исследование лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата на 2-х видах животных: на крысах популяции Wistar и кроликах породы Серый великан. Биофармацевтические исследования проведены в сравнении с известным препаратом «Циклосерин», лекарственной формой которого являются капсулы для приема внутрь. Исследование проводилось при однократном внутрижелудочном введении (в/ж) препаратов, путем измерения концентрации D-циклосерина в сыворотке крови крыс через 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 36 часов после введения методом ВЭЖХ, расчета фармакокинетических параметров по полученным фармакокинетическим кривым и оценки относительной биодоступности полимерной лекарственного препарата. Минимальная из выбранных доз (1 ТД) близка к терапевтической дозе, рекомендуемой для клинического изучения - 0.25 мг/сут. Вторая из выбранных доз (3 ТД) соответствует нижнему уровню из диапазона максимальных суточных доз, при которой возможны эффекты передозировок - 0.75÷1 г/сут. Третья выбранная доза - промежуточная, 2 ТД. При пересчете этих доз, в соответствии с правилами межвидового переноса дозировок с человека на крысу и кролика, получили величину 1 ТД=22 мг/кг (по действующему веществу циклосерину) для крысы и величины 1 ТД=10 мг/кг, 2 ТД=20 мг/кг и 3 ТД=30 мг/кг (по действующему веществу циклосерину) для кролика. Для количественного определения концентрации D-циклосерина в биологических образцах был выбран метод ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (MS/MS). Предварительно проводили хроматографический анализ модельных растворов стандартного образца D-циклосерина в сыворотке крови крыс. Полученные экспериментальные данные хроматографического анализа модельных растворов стандартного образца D-циклосерина в сыворотке крови крыс были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Origin 8.5». По полученным значениям строили калибровочный график и определяли линейность калибровочной кривой в диапазоне анализируемых концентраций по среднему коэффициенту корреляции. Калибровочная кривая описывается уравнением: S = 627.093 Сх + 323.863 (где S - площадь пика; Сх - концентрация циклосерина, мкг/мл). Линейность калибровочной кривой в диапазоне концентраций 0.5÷30.0 мкг/мл циклосерина сыворотки демонстрируется средними коэффициентами корреляции г = 0,9971. После однократного внутрижелудочного введения исследуемого препарата и препарата сравненя в дозе 1 ТД (22 мг/кг по действующему веществу циклосерину) проводили измерение концентрации D-циклосерина в сыворотке крови крыс (в контрольной пробе до введения препаратов и через 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 36 часов после введения) строили фармакокинетические кривые и рассчитывали фармакокинетические параметры по полученным фармакокинетическим кривым. В таблицах 4 и 5 приведены рассчитанные по полученным кривым фармакокинетические параметры Tmax; Cmax; AUC(0→36); Cl.; T1/2; kel; MRT; Vd и отношение Cmax/AUC(0→36), отражающие степень, скорость всасывания распределения и элиминацию D-циклосерина при применении изучаемых препаратов и позволяющие оценить относительную биодоступность исследуемого препарата.

В Таблице 4 даны значения фармакокинетических параметров лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата после однократного перорального введения крысам в дозе 1 ТД, 22 мг/кг. В Таблице 5 приведены значения фармакокинетических параметров лекарственного препарата противотуберкулезного действия на основе D-циклосерина в виде лиофилизата после однократного перорального введения кроликам в дозах 1 ТД, 10 мг/кг, 2 ТД, 20 мг/кг и 3 ТД, 30 мг/кг.

В исследованиях противотуберкулезной активности разработанного препарата препарата было установлено, что препарат обладает бактериостатической активностью в отношении М. tuberculosis штамма H37Rv на острой модели генерализованного туберкулеза in vivo на мышах линии BALB/c и аутбредных морских свинках-альбиносах. Следует отметить расширение диапазона терапевтических доз разработанного лекарственного препарата - все использованные дозы от 1 ТД до 6 ТД оказались эффективными, тогда как в случае препарата сравнения «Циклосерина» эффективной была доза 6 ТД, эффект от применения которой был сравним с эффектом лечения разработанным лекарственным препаратом в дозе 1 ТД (эффективность выросла в 6 раз).

В исследовании нейротоксического воздействия разработанного препарата в тесте по оценке ориентировочно-исследовательской активности (тест «открытое поле») и тесте по определению суммационно-порогового потенциала на крысах было установлено, что введение разрабатываемого препарата не сопровождалось изменениями поведения в тесте «открытое поле» и изменением суммационно-порогового показателя в отличие от препарата сравнения «Циклосерина», введение которого сопровождалось нейротоксическими проявлениями в данных тестах.

Таким образом, по совокупности всех полученных результатов испытаний лекарственный препарат, содержащий D-циклосерин, полимер PLGA 50/50, поливиниловый спирт, D-маннитол, выполненный в виде дозированного по 2.0±0.20 г лиофилизата, который при разбавлении водой образует суспензию частиц с размером не более 800 нм, характеризуется высокой стабильностью при длительном хранении (не менее 18 месяцев), повышенной биодоступностью при пероральном применении, а также обладает высокой противотуберкулезной активностью, расширенным диапазоном терапевтических доз, сниженной побочной токсичностью, что свидетельствует об увеличении терапевтического индекса для разработанного лекарственного препарата.

Источники информации

1. Патент РФ №2318513 на изобретение «Лекарственное средство на основе d-циклосерина, препарат пролонгированного действия, содержащий наночастицы, способ его получения », опубл. 10.03.2008.

2. Da Silva, Р.Е.А.; Palomino, J.C. Molecular basis and mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: classical and new drugs // J. Antimicrob. Chemother. - 2011. - Vol. 66. - P. 1417-1430.

3. «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза» Приложение №11 к приказу Минздрава России от 21.03.2003 №109.

4. Inderlied, С.В.; Kemper, С.А. and Bermudez, L.E.M. The Mycobacterium avium complex // Clin. Microbiol. Rev. - 1993. - Vol. 6. - P. 266-310.

5. Lambert, M.P. and Neuhaus, F.C. Mechanism of D-cycloserine action: alanine racemase from Escherichia coli // W.J. Bacteriol. - 1972. - Vol. 110 - P. 978-987.

6. Машковский, М.Д. Лекарственные средства [Текст] / Машковский М.Д. // В двух частях. - 12-е изд., перераб. - М.: - Медицина, 1993. - С. 381-382.

7. Патент РФ №2248205 на изобретение «Лекарственное средство в виде желатиновой капсулы», опубл. 20.03.2005.

8. Патент РФ №103473 на изобретение «Фармацевтическая капсула противотуберкулезного действия» опубл. 20.04.2011.

9. Du Toit, L.C.; Pillay, V. and Danckwerts, M.P. Tuberculosis chemotherapy: current drug delivery approaches // Respiratory Research. - 2006. - Vol. 7. - P. 118.

10. Sosnik, A.; Carcaboso, A.; Glisoni, R.; Moretton, M.; Chiappetta, D. New old challenges in tuberculosis: Potentially effective nanotechnologies in drug delivery // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2010. - Vol. 62. - P. 547-559.

11. Ranjita, S.; Loaye, S.; Khalil, M. Present status of nanoparticle research for treatment of tuberculosis // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. - 2011. - Vol. 14(1). - P. 100-116.

12. Mathuria, J. Nanoparticles in tuberculosis diagnosis, treatment and prevention // Journal of Nanomaterials and Biostructures. - 2009. - Vol. 4(2). - P. 309-321.

13. Патент РФ №2 327459 на изобретение «Лекарственное средство противомикробного действия, способ получения лекарственного препарата направленного действия, содержащего наночастицы», опубл. 27.06.2008.

14. Патент РФ №2403041 на изобретение «Лекарственное средство пролонгированного действия с дозированным высвобождением в органы-мишени на основе d-циклосерина для лечения резистентных форм туберкулеза», опубл. 10.11.2010.

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты