[1]Изобретение относится к противовирусным средствам, в частности к средствам для снижения репродукции вируса гепатита С.
[2]Известно средство для снижения репродукции вируса гепатита С рибавирин (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) (Стандарт медицинской помощи больным хроническим вирусным гепатитом (гепатит В, дельта и С). Утвержден приказом Минздравсоцразвития РФ от 21 июля 2006 г. №571. Ф.И. Ершов Антивирусные препараты. Медицина, М., 1998, 188 с. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. Справочник 2-е издание // М, ГЕОТАР-Медиа, 2006).
[3]Одним из побочных эффектов является гемолитическая анемия, в запущенной форме вызывающая смерть пациента (в связи с чем требуется тотальный контроль показателей крови в процессе лечения). Рибавирин также является тератогеном.
[4]Известно средство для подавления репродукции вируса гепатита С альфа-интерферон (ИФН-α) (Стандарт медицинской помощи больным хроническим вирусным гепатитом (гепатит В, дельта и С). Утвержден приказом Минздравсоцразвития РФ от 21 июля 2006 г. №571. Ф.И. Ершов Антивирусные препараты. Медицина, М., 1998, 188 с. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. Справочник. 2-е издание // М, ГЕОТАР-Медиа, 2006).
[5]Известное средство эффективно в достаточно больших дозах, при которых проявляется его высокая токсичность. Кроме того, существуют штаммы вируса гепатита С, устойчивые к ИФН-α. К прочим же штаммам вируса гепатита С при длительном применении формируется устойчивость.
[6]Технический результат от использования предлагаемого средства заключается в снижении токсичности, распространении действия на большинство штаммов вируса гепатита С и сохранении противовирусного действия при длительном применении.
[7]Указанный технический результат достигается тем, что средство для снижения репродукции вируса гепатита С содержит хотя бы один полипренилфосфат или полипренилпирофосфат с количеством изопреновых звеньев от 9 до 20, преимущественно - от 13 до 18, либо смесь различных полипренилфосфатов или различных полипренилпирофосфатов, либо смесь различных полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов с указанным количеством изопреновых звеньев в массовом соотношении от 5:1 до 20:1.
[8]Указанный технический результат достигается тем, что средство для снижения репродукции вируса гепатита С содержит полипренилфосфаты и/или полипренилпирофосфаты с количеством изопреновых звеньев от 9 до 13.
[9]Указанный технический результат достигается тем, что средство для снижения репродукции вируса гепатита С содержит полипренилфосфаты и/или полипренилпирофосфаты с количеством изопреновых звеньев от 12 до 20.
[10]Указанный технический результат достигается также тем, что массовое соотношение в смеси полипренилфосфатов и полипренилпирофосфатов составляет 9:1.
[11]Под различными полипренилфосфатами и различными полипренилпирофосфатами понимаются полипренилфосфаты и полипренилпирофосфаты с различным количеством изопреновых звеньев.
[12]В основу изобретения были положены данные, полученные на полипренолах и полипренилфосфатах, выделенных из древесной зелени пихты, березы, шелковицы и гинкго билоба, которые как по литературным, так и по нашим данным в совокупности содержат смесь олигомергомологов с длиной цепи от 7 до 30 (Обзор. Swiezewska E et al. Acta Biochim Pol. 1994; 41(3): 221-60).
[13]Полученные с помощью HPLC хроматограммы некоторых из них приведены на фиг.1 (HPLC хроматограмма ППФ из хвои пихты) и фиг.2 (HPLC хроматограмма ППФ из листьев шелковицы).
[14]Пики на первой из них соответствуют длине цепи от 12 до 20 изопреновых звеньев, пики на второй - олигомергомологам с длиной цепи от 9 до 13 изопреновых звеньев.
[15]При фосфорилировании полипренолов около 10% образующихся продуктов имеют форму пирофосфата.
[16]Известно (http://chemister.ru/Database/Tables/ld.php?pageNum=30), что летальная доза, при которой гибнут 50% подопытных животных - ЛД50, для рибавирина составляет: при исследовании на мышах - 1300 мг/кг, при исследовании на крысах - 5300 мг/кг.
[17]Снижение токсичности ППФ рассматривается как признак, связанный с молекулой ППФ. Проведенные исследования острой и хронической токсичности препаратов на основе ППФ с количеством изопреновых звеньев 9-13 (в случае полипренилфосфатов из листьев шелковицы, сокр. морапренилфосфатов) и 12-20 (в случае полипренилфосфатов из хвои пихты, сокр. пинопренилфосфатов) показали их чрезвычайно низкую токсичность. Изучение острой токсичности полипренилфосфатов (ППФ) проводили на мышах и крысах. Установлено, что LD50 для мышей, равная 12,5 г/кг веса животного, на порядки превышает среднюю терапевтическую дозу 0,25-0,35 мг/кг веса животного. ЛД50 при исследовании на крысах определить не удалось вследствие невозможности достижения концентрации препарата, вызывающей гибель животных. Исследовано цитотоксическое действие препарата в отношении ряда клеточных линий. Патологогистологические исследования органов и тканей животных, получавших ППФ в дозах, значительно превышающих эквитерапевтическую, не выявили серьезных изменений со стороны органов и тканей экспериментальных животных (Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств. // М., 1992). При изучении хронической токсичности ППФ на крысах патоморфологические, гистологические, биохимические, гематологические показатели экспериментальных животных были близки к таковым в контрольной группе. В восстановительном периоде не отмечено каких-либо эффектов, связанных с отменой препарата (Об экспериментальном исследовании, характеризующем безвредность Фортепрена // Отчет ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, М., 2005, 127 с.).
[18]Средство для снижения репродукции вируса гепатита С используют следующим образом.
[19]В однодневный монослой культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) сразу после их заражения или за 24 часа до заражения цитопатогенным вариантом вируса гепатита С (ВГС) вносят полипренилфосфат натрия (ППФ).
[20]ППФ использовали в различных концентрациях от 60 до 7,5 мкг в 50 мкл.
[21]В качестве контроля использовали плацебо, который разводили так же, как ППФ.
[22]Для заражения монослоя культуры СПЭВ использовали цитопатогенный вариант ВГС, выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования, изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. ВГС использовали в инфекционной дозе 10,0 ТЦД50 (ТЦД50 - индуцированная вирусом тканевая цитопатогенная доза, вызывающая деструкцию 50% клеток в монослое).
[23]В качестве тест-культуры клеток были выбраны высокочувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы «Нарвак», Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков: пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл).
[24]Для титрования остаточной инфекционной активности вируса использовали ту же линию клеток (СПЭВ).
[25]ППФ вносили в культуры клеток СПЭВ сразу после заражения, за 24 часа до заражения или спустя 24 часа после заражения клеток ВГС.
[26]Была произведена прямая оценка противовирусного действия ППФ в культурах клеток СПЭВ, инфицированных вирусом гепатита С.
[27]Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах среды, отобранных на 3-й день из инфицированных ВГС культур клеток, учитывали по результатам титрования на 6-й день после инфицирования, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.
[28]В таблице 1 представлены данные титрования проб культуральной среды, собранных из ВГС инфицированных культур клеток СПЭВ, обработанных ППФ в различных дозах сразу после заражения клеток, за 24 часа до заражения и спустя 24 часа после заражения.
[29]| Таблица 1 |
| Противовирусная активность ППФ в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток СПЭВ |
| Время обработки культур клеток препаратом | Титры ВГС (lg ТЦД50) в пробах среды, отобранных из культур клеток СПЭВ на 3-й день после инфекции и обработки препаратом в различных дозах (мкг) (регистрация на 6-й день после заражения) клеток) |
| 60.0 | 30,0 | 15,0 | 7,5 | Контроль вируса |
| В момент инфекции | 2,6 | 3,7 | 4,8 | 5,5 | 5,6 |
| За 24 часа до инфекции | 2,5 | 4,6 | 3,7 | 2,8 | 6,0 |
| Через 24 часа после инфекции | 4,2 | 4,3 | 5,0 | 3,7 | 4,3 |
[30]Показано, что ППФ обладает противовирусными свойствами в случае его добавления в культуры клеток сразу же после заражения ВГС. В частности, установлено, что под действием препарата титры ВГС снижались на 3,0 lg (доза препарата - 60 мкг) и на 1,9 lg (доза препарата 30 мкг).
[31]Положительный эффект был получен также в случае профилактического применения ППФ. Так при внесении препарата в дозе 60 мкг за 24 часа до заражения клеток СПЭВ титры ВГС снижались на 3,5 lg. При профилактическом применении малых доз препарата - 7,5 и 15,0 мкг также наблюдали явный противовирусный эффект, т.е. снижение инфекционной активности ВГС на 3,2 и 2,3 lg, соответственно.
[32]Таким образом, установлено, что:
[33]- ППФ в испытанных дозах обладает способностью снижать концентрацию инфекционного вируса гепатита С (ВГС) в культурах клеток СПЭВ;
[34]- антивирусная активность ППФ в отношении ВГС инфекции отмечалась в условиях, когда препарат добавляли сразу же после заражения клеток или за 24 часа до заражения культур клеток СПЭВ. В этих условиях максимальное снижение титров ВГС под действием препарата в дозе 60 мкг в 50 мкл составляло 3,0-3,5 lg соответственно.
[35]Показано усиление антивирусной активности малых доз препарата (до 7,5 мкг) при профилактическом применении: за 24 часа до заражения клеток.
