[1]Изобретение относится к области микробиологии, медицинской биотехнологии, производству и контролю вирусных вакцин и может быть использовано при получении вакцины клещевого энцефалита (КЭ).
[2]Клещевой энцефалит является трансмиссивным природно-очаговым антропозоонозом. Заражение человека возбудителем - вирусом клещевого энцефалита (семейство Flaviviridae) происходит при присасывании переносчика (клещей рода Ixodes). Очаги КЭ связаны с ареалом обитания иксодовых клещей и эндемичные регионы охватывают широкий пояс хвойных и смешанных лесов умеренной климатической зоны Евразии. Заболевания КЭ регистрируются от Австрии, Швейцарии, Германии, Швеции до Дальнего Востока. В связи с тем, что вирус КЭ поражает нервную ткань, в клинике КЭ в первую очередь выделяют неврологические проявления, которые могут быть очень тяжелыми - вплоть до параличей и поражений ядер ствола мозга. Летальность заболевания может доходить до 30,0% в зависимости от региона.
[3]Для России КЭ является наиболее значимым природно-очаговым заболеванием. Именно на территории РФ циркулируют наиболее вирулентные генотипы вируса. Ежегодно сотни тысяч людей обращаются в медучреждения по поводу присасывания клеща, тысячи заболевают, а для сотен из них заболевание имеет тяжелые исходы - инвалидизация или смерть.
[4]Наиболее эффективным способом специфической профилактики КЭ является вакцинация, которая в десятки раз снижает вероятность заболевания, предотвращает развитие тяжелых форм и осложнений и решает государственную задачу охраны здоровья населения от опасного инфекционного заболевания.
[5]Согласно рекомендациям ВОЗ и требованиям ГФ XIII при производстве вакцин с использованием перевиваемых клеточных культур содержание ДНК клеток-продуцентов не должно превышать 10 нг на 1 дозу вакцины для исключения потенциальной возможности ее онкогенного и трансформирующего действия. Концентрация гетерогенных белков также не должна превышать установленных значений, в частности концентрация белков плазмы крови КРС, используемых при производстве вакцины, не должна превышать 50 нг/доза.
[6]Задача, решаемая изобретением, состоит в получении высокоиммуногенной очищенной вакцины клещевого энцефалита, снижении количества и состава гетерогенных белков, снижении риска контаминации, связанного с использованием куриных эмбрионов, повышении технологичности процесса, повышении стандартности качества препарата, что в конечном итоге позволяет повысить безопасность, эффективность и стабильность препарата, сохранить здоровье населения.
[7]Заявляемый способ получения вакцины клещевого энцефалита включает использование аттестованной культуры клеток Vero, культурального вируса КЭ в качестве посевного, концентрирования ультрафильтрацией в тангенциальном потоке и очистки эксклюзионной хроматографией на полужестких полимерных сорбентах.
[8]Предложенный способ осуществляется следующим образом.
[9]При подготовке посевного вируса проводят двукратное пассирование производственного штамма на культуре клеток Vero с целью удаления компонентов мозга мышей, в котором культивируют производственный штамм. Вирусный сбор (вирусную суспензию) получают путем репродукции вируса в монослойной или псевдосуспензионной культуре клеток Vero. Для увеличения репродукции добавляют глутамин, эмбриональную телячью сыворотку, другие ростовые факторы. Культивирование проводят в роллерных бутылях объемом 2-10 л или многослойных Cell-factory или иных устройствах для монослойного или псевдосуспензионного культивирования в течение 9-10 суток при температуре (37±1)°С при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью 1,0-8 об/мин (для роллерных бутылей), в зависимости от объема. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)°С. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации, а инактивированную вирусную суспензию контролируют на отсутствие вирусной активности. Перед объединением культуральную среду, содержащую вирусную взвесь, обрабатывают протаминсульфатом, затем вирусный сбор центрифугируют, объединяя в общую емкость, и фильтруют для освобождения от клеточного субстрата.
[10]Операцию проводят следующим образом.
[11]В инактивированную вирусную суспензию добавляют 4%-ный раствор протаминсульфата до конечной концентрации 50-100 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6±2)°С на 0,5-20 часов. Далее преципитат удаляют последовательным центрифугированием полуфабриката из отдельных емкостей на центрифуге при ускорении ~13000 g с последующей фильтрацией объединенного полуфабриката через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 3-30 раз ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранных или половолоконных модулях с порогом отсечения 100-300 кДа. Использование ультрафильтрационных модулей обеспечивает удаление значительной части низкомолекулярных примесей. Концентрат дополнительно очищают эксклюзионной хроматографией (гель-фильтрацией) на колонне с полужестким полимерным сорбентом, в качестве которого могут использоваться сорбенты марок Sepharose 4 Fast Flow, Sepharose 6 Fast Flow, WorkBeads 40 SEC, Toyopearl HW 65C, Toyopearl HW 55 F. Использование этого типа сорбентов позволяет повысить скорость процесса, эффективность очистки и стабильность результатов. В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита, количество общего белка, ДНК и белков КРС. Затем полученный очищенный концентрат фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм, разводят в соответствии с его антигенной активностью и используют для приготовления сорбированной вакцины. Сорбированную вакцину разливают в ампулы или флаконы и при необходимости подвергают сублимации.
[13]Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса в монослойной культуре клеток Vero.
[14]Производственный штамм вируса КЭ (штамм 205), хранящийся в виде мозговой суспензии, вносят в культуру клеток Vero, культивируют в течение 2-4 суток. Культуральную жидкость переносят в новую культуру клеток Vero и также культивируют 2-4 суток. Посевной вирус, прошедший два пассажа через культуру клеток, используют для заражения производственной культуры.
[15]Для увеличения репродукции добавляют глутамин, эмбриональную телячью сыворотку в конечной концентрации 2%. Культивирование вируса проводят в роллерных бутылях объемом 2,0 л в течение 9 суток при температуре (37±1)°С при непрерывном перемешивании на роллерной установке со скоростью вращения 2 об/мин. Затем вирусную суспензию инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 200±20 мкг/мл в течение 3-х суток при температуре (32±1)°С. Концентрацию инфекционного вируса в вирусной суспензии контролируют до инактивации. Далее освобождают от клеточного субстрата и объединяют полуфабрикат.
[16]Операцию проводят следующим образом.
[17]В бутыли с инактивированной культуральной средой, содержащей клеточный дебрис, вирусную взвесь, добавляют протаминсульфат до конечной концентрации 50 мкг/мл. Оставляют для взаимодействия при температуре (6+2)°С на 19 ч. Затем клеточный детрит и образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием. Сбор поступающего с центрифуги полуфабриката производят в общую емкость, затем его фильтруют через пакет фильтров с конечным размером пор 0,45 мкм. Полученный таким образом объединенный полуфабрикат концентрируют в 10 раз ультрафильтрацией на половолоконных модулях Xampler UFP-100C- 4×2МА с порогом отсечения 100 кДа. Далее концентрат очищают эксклюзионной хроматографией на колонне с сорбентом Sepharose 6 Fast Flow (Фиг. 1).
[18]В собираемой хроматографической фракции контролируют антигенную активность вируса клещевого энцефалита, остаточные ДНК и белки КРС. Кроме того, контролируется чистота цельновирионной фракции (Фиг. 2).
[19]Затем полученный очищенный концентрат разводят равным количеством буферного раствора, фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной вакцины.
[21]Вирусную суспензию получают путем репродукции вируса КЭ (штамм 205) в монослойной культуре клеток Vero. Для увеличения репродукции добавляют глутамин, эмбриональную телячью сыворотку в конечной концентрации 2%. Культивирование вируса проводят в 10-слойных Cell-factory (объем среды культивирования 2 л.) в течение 10 суток при температуре (37±1)°С при концентрации углекислоты 5%. Далее инактивацию, очистку и контроль проводят аналогично Примеру 1.
[22]Фиг. 2 Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии исходного концентрата вакцины (А) и очищенного на Sepharose (Б) (колонна Protein Рас 300SW).
