[1]Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может использоваться для автоматического подсчета количества ретикулоцитов на анализаторах мазков крови.
[2]Количество и качественный состав ретикулоцитов являются одними из важных показателей, характеризующих эффективность кроветворения, а их подсчет широко используется при проведении массовых профилактических осмотров и регламентируется рядом приказов. Использование автоматических анализаторов мазков крови позволяет автоматизировать оценку клеточного состава мазка крови, окрашенного по Романовскому-Гимза. Однако подсчет ретикулоцитов в таких мазках невозможен, из-за того, что при окраске по Романовскому-Гимза ретикуло-филаментарная субстанция не выявляется.
[3]Известен метод подсчета количества ретикулоцитов после суправитального окрашивания в специально подготовленном мазке крови [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делкторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.; Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, - 368 с.: ил., стр. 118-119]. Для этого кровь, забранную с антикоагулянтом (этилендиамидтетраацетатом, гепарином или цитратом натрия), смешивают с раствором красителя бриллиантового крезилового синего (бриллиант-крезил блау), смесь инкубируют в течение 30 минут и готовят тонкий мазок. Однако при использовании автоматических анализаторов мазков крови данный способ окраски ретикулоцитов дает неточные результаты подсчета ретикулоцитов. Это связано с тем, что при этом способе окраски эритроциты окрашиваются бледно, в различные оттенки желто-синего цветов, что затрудняет автоматическое распознавание клеток и идентификацию ретикулофиламентарной субстанции, которая также окрашивается в сине-зеленый цвет (фиг. 1).
[4]Технический результат: повышение точности и ускорение подсчета ретикулоцитов.
[5]Указанный результат достигается путем изменения в протоколе окраски и использования автоматических анализаторов мазков крови.
[6]Способ пояснен на фотографиях, где на первой фотографии (фиг. 1) показан результат традиционной окраски ретикулоцитов (прототип); эритроциты окрашены в различные оттенки зеленовато-синего цветов, в двух заметна синяя ретикуло-филиментарная субстанция ретикулоцитов. На другой фотографии продемонстрирован результат использования заявляемого способа подготовки мазка крови: эритроциты окрашены в ярко-красный цвет на фоне которого, ретикуло-филаментарная субстанция ретикулоцитов окрашена в ярко синий цвет (фиг. 2).
[7]Способ осуществляется следующим образом.
[8]У обследуемого забирают кровь с антикоагулянтом, например калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты. Выполняют суправитальную окраску ретикулоцитов с помощью бриллиантового крезилового синего (бриллиант-крезил блау). К 0,1 мл цельной крови добавляют 0,4 мл раствора красителя и инкубируют 30 минут. Затем из полученной смеси готовят тонкий мазок. После высыхания мазка, его дополнительно фиксируют и докрашивают краской-фиксатором Май-Грюнвальда. Для этого высушенный мазок помещают на 1 минуту в контейнер с краской-фиксатором, затем извлекают из контейнера и промывают проточной водой. После высушивания препарат исследуют на анализаторах мазков крови, например, Vision Hema® (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия). Эритроциты окрашиваются в красный цвет, на фоне которого в ретикулоцитах четко видна синяя ретикуло-филаментарная субстанция (фиг. 2). Собирают и анализируют эритроциты, не менее 1000 штук. Подсчитывают количество эритроцитов, содержащих ретикуло-филаментарную субстанцию по отношению ко всем собранным эритроцитам. Результат выражают в процентах.
[9]Для окраски мазков крови используют следующие растворы:
[10]1) раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте. Для приготовления абсолютного спирта необходимо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного сульфата меди (до прекращения окрашивания порошка безводного сульфата меди в синий цвет). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски (Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией проф. А.И. Карпищенко. - Санкт-Петербург; Интермедика, 2002. - 408 с. С.284).
[11]2) краска-фиксатор Май-Грюнвальда - 1 г сухой краски нужно растворить в 1 л метилового спирта. (Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией проф. А.И. Карпищенко. - Санкт-Петербург; Интермедика, 2002. - 408 с. С. 277).
[12]Примеры конкретного выполнения:
[13]Пример 1. Пациент И., 48 лет. Проходил периодический осмотр, как работник нефтеперерабатывающего предприятия. У пациента была забрана кровь с антикоагулянтом (калиевой солью этилендиаминуксусной кислоты) и подготовлены 2 мазка. Ретикулоциты в одном мазке окрашивали традиционным методом, только с использованием бриллиантового крезилового синего. Ретикулоциты во втором мазке окрашивали по предложенному способу. Для этого 0,1 мл крови смешивали с раствором бриллиантового крезилового синего и инкубировали 30 минут. Затем делали тонкий мазок крови. После высыхания мазок крови дополнительно фиксировали и окрашивали, погружая его в краску-фиксатор Май-Грюнвальда. В мазках определяли количество ретикулоцитов на анализаторе мазков крови Vision Hema® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия) и ручным методом под световым микроскопом (Meiji, Япония).
[14]Количество ретикулоцитов, подсчитанных на анализаторе мазков крови при традиционной окраске составило 1,5%, что превысило референсный диапазон нормы, а в мазке, окрашенном предложенным способом, составило - 0,9%, что соответствует нормальным значениям для взрослого человека. При ручном подсчете ретикулоцитов их количество в этих же мазках составило 0,8% и 0,9%, соответственно. Это указывает на повышение точности подсчета на анализаторах мазков крови при использовании предложенного способа подготовки мазков. При этом скорость исследования ретикулоцитов на анализаторе мазков крови составила 48 и 54 секунды, в то время как на ручной подсчет ретикулоцитов затрачивалось 270 и 238 секунд.
[15]Таким образом, данный пример демонстрирует, что предложенная окраска ретикулоцитов при использовании анализаторов мазков крови ведет к увеличению точности результатов и ускорению подсчета ретикулоцитов.
[16]Пример 2. Пациентка З. Госпитализирована в гематологическое отделение КМСЧ 1 г. Перми с диагнозом апластическая анемия. В рамках протокола обследования выполнен подсчет ретикулоцитов. У пациентки был выполнен забор крови с антикоагулянтом (калиевой солью этилендиаминуксусной кислоты) и подготовлены 2 мазка. Ретикулоциты в одном мазке окрашивали традиционным методом, только с использованием бриллиантового крезилового синего. Ретикулоциты во втором мазке окрашивали по предложенному способу. Для этого 0,1 мл крови смешивали с раствором бриллиантового крезилового синего и инкубировали 30 минут. Затем делали тонкий мазок крови. После высыхания мазок крови дополнительно фиксировали и окрашивали, погружая его в краску-фиксатор Май-Грюнвальда. В мазках определяли количество ретикулоцитов на анализаторе мазков крови Vision Hema® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия) и ручным методом под световым микроскопом (Meiji, Япония).
[17]Количество ретикулоцитов, подсчитанное на анализаторе мазков крови в мазке, окрашенном традиционно, составило 0,3%, в мазке, окрашенном модифицированным способом - 0,2%. При ручном подсчете результат 0,2% и 0,2%. При этом скорость подсчета ретикулоцитов на анализаторе мазков крови составила 58 и 52 секунды, в то время как на ручной подсчет ретикулоцитов затрачивалось 302 и 338 секунд.
[18]В данном случае из-за низкого содержания ретикулоцитов существенных различий в результатах не обнаружено, однако, обращает внимание несколько завышенный результат, полученный на анализаторе мазков крови при исследовании мазка окрашенного обычным способом. Так же, как в предшествующем примере, продемонстрировано значительное (почти в 5 раза ускорение подсчета ретикулоцитов).
[19]Пример 3. Пациент К. Госпитализирована в отделение патологии новорожденных ДГКБ №13 г. Перми с диагнозом гемолитическая болезнь новорожденных. В рамках протокола обследования выполнен подсчет OAK с подсчетом ретикулоцитов. У пациента была выполнен забор крови с антикоагулянтом (калиевой солью этилендиаминуксусной кислоты) и подготовлены 2 мазка. Ретикулоциты в одном мазке окрашивали традиционным методом, только с использованием бриллиантового крезилового синего. Ретикулоциты во втором мазке окрашивали предложенным способом. Для этого 0,1 мл крови, смешивали с раствором бриллиантовым крезиловым синим и инкубировали 30 минут. Затем делали тонкий мазок крови. После высыхания мазок крови дополнительно фиксировали и окрашивали, погружая его в краску-фиксатор Май-Грюнвальда. В мазках определяли количество ретикулоцитов на анализаторе мазков крови Vision Hema® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия) и ручным методом под световым микроскопом (Meiji, Япония).
[20]Количество ретикулоцитов, подсчитанное на анализаторе мазков крови в мазке, окрашенном традиционно, составило 30,3%, в мазке, окрашенном модифицированным способом, - 21,2%. При ручном подсчете результат 20,6% и 22,4%. При этом скорость подсчета ретикулоцитов на анализаторе мазков крови составила 52 и 51 секунды, в то время как на ручной подсчет ретикулоцитов затрачивалось 298 и 304 секунд.
[21]На данном примере продемонстрировано снижение точности подсчета ретикулоцитов на анализаторах мазков крови в стеклопрепаратах, окрашенных традиционным методом, особенно при высоком содержании ретикулоцитов. Использование нового способа окраски мазков привело к практически полному совпадению результатов подсчета ретикулоцитов на автоматическом анализаторе и ручным способом, при этом скорость подсчета ретикулоцитов увеличилась более чем в 5 раз.
