[2]Настоящее изобретение относится к иммунологии и белковой инженерии и, в частности, к созданию иммуногенных препаратов и вакцин, которые могут быть использованы для профилактики птичьего гриппа.
[4]Грипп является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний человека и животных. Гриппозная инфекция часто протекает тяжело и иногда приводит к смертельному исходу. Некоторые штаммы вируса, например «испанка» в 1918-1920 годах, способны вызывать пандемии в мировом масштабе, сопровождающиеся высокой смертностью. Высокая изменчивость поверхностных белков вируса, гемаглютинина и нейраминидазы приводит к возникновению нового эпидемического штамма каждые 1-2 года, с такой же частотой требуется изготовление «стандартных» штамм-специфических вакцин.
[5]Одним из потенциальных источников антигенной изменчивости вируса гриппа человека является его рекомбинация с вирусами гриппа животных, которая может привести к возникновению нового высокопатогенного рекомбинантного вируса, «неизвестного» иммунной системе человека и потому способного вызвать пандемию. Одним из наиболее потенциально опасных вариантов будет рекомбинация с вирусами гриппа птиц, смертельно опасными как для домашней птицы, так и для млекопитающих, но в настоящее время пока не передающегося от человека к человеку. В то же время создание традиционной вакцины от нового штамма требует длительного времени (от 6 до 9 месяцев), в течение которого появление нового пандемического штамма гриппа может привести к гибели миллионов людей.
[6]Одним из перспективных путей решения проблемы получения «пандемической» вакцины является создание «универсальных» вакцин, основанных на использовании консервативных иммунодоминантных пептидов, например внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа, последовательность которого практически инвариантна у всех человеческих штаммов. Однако у вирусов птичьего гриппа эта последовательность заметно отличается от человеческой.
[7]Таким образом, задача создания «универсальных» вакцин против вирусов гриппа птиц, продолжает оставаться актуальной. Такая вакцина, с одной стороны, может быть использована для вакцинации домашней птицы, для предотвращения распространения птичьего гриппа в птицеводческих хозяйствах и уменьшения, тем самым, вероятности появления вирусов гриппа птиц, адаптированных к человеку. С другой стороны, такая вакцина может обеспечить защиту человека от нового «гибридного» вируса, если рекомбинация между птичьим и человеческим вирусами с образованием нового пандемического штамма все-таки произойдет. Эпидемическая обстановка в странах Юго-Восточной Азии свидетельствует о том, что вероятность этих событий и появления пандемического вируса возрастает с каждым днем циркуляции вируса H5N1.
[9]1) Современные противогриппозные вакцины
[10]| Таблица 1 |
| Вакцины для профилактики гриппа отечественного и зарубежного производства, применяемые в России. |
| Вакцины | Производители | Возраст прививаемых, схема введения препарата |
| Живая гриппозная вакцина | ФГУП «Микроген», г.Иркутск | Дети с 3 лет и взрослые по 0,5 мл однократно интраназально |
| Вакцина гриппозная инактивированная цельновирионная | Предприятие НИИВС, г.Санкт-Петербург | Дети с 7 лет, подростки и взрослые по 0,5 мл двукратно интраназально с интервалом 3-4 недели; взрослые с 18 лет по 0,5 мл однократно парентерально |
| ИГВ расщепленные | ФЛЮАРИКС, SmithKline Beecham (Германия)
ВАКСИГРИП, Pasteur-Merieux (Франция)
БЕГРИВАК, Chiron Behring (Германия) | Дети с 6 месяцев до 6 лет по 0,25 мл двукратно парентерально с интервалом 4-6 недель, дети старше 6 лет и взрослые по 0,5 мл однократно парентерально |
| ИГВ субъединичные | ГРИППОЛ, ФГУП «Микроген», г.Уфа ИНФЛЮВАК, Solvay Duphar (Нидерланды)
АГРИППАЛ S1, Chiron Behring (Германия) | Дети с 6 месяцев до 3 лет по 0,25 мл двукратно парентерально с интервалом 1 месяц, дети с 3 лет и взрослые по 0,5 мл однократно парентерально |
[11]В таблице 1 представлены перечень и характеристики противогриппозных вакцин, зарегистрированных и использующихся в России.
[12]Все вакцины могут быть разделены на следующие типы:
[16]- расщепленные (тоже цельновирионные)
[18]Из этого перечня видно, что для таких актуальных вакцин, как противогриппозные, вообще не разрабатывались рекомбинантные эпиотопные вакцины. Однако преимущество генно-инженерных технологий в решении проблем эффективности и безопасности гриппозных вакцин очевидны и их можно перечислить в следующем порядке по степени важности:
[19]1. Гарантированно полное отсутствие яичного белка (овальбумина) - основного аллергена в современных вакцинах.
[20]2. Индивидуальность избранных эпиотопов - гарантии отсутствия аутоиммунных реакций и осложнений. Эта опасность особенно велика для живых и цельновирионных вакцин и не исключается для субъединичных.
[21]3. Относительная простота производства, отсутствие зависимости от природного сырья, например куриных эмбрионов, и полное соответствие требованиям безопасности (отсутствие вирусных компонентов). Хорошие экономические показатели производства.
[22]4. Возможность быстрого развертывания масштабного производства на случай роста потребностей в вакцине в предпандемический и пандемический периоды.
[23]2) Биологически активные наноструктуры на основе капсидов вирусов животных
[24]Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве «строительных» блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации, современными методами генной инженерии являются вирусные частицы.
[25]Высокая стабильность рекомбинантных вирусно-подобных частиц (VLP), их симметричная пространственная организация, легкость получения и очистки VLP, их безопасность, возможности направленной модификации структурных белков вирусов методами генной инженерии делают эти частицы идеальными векторами-носителями для представления чужеродных функционально значимых пептидов и целых белков. Представление антигенных детерминант-эпитопов на поверхности VLP обеспечивает их высокую иммуногенность за счет использования вириона в качестве адьюванта в сочетании с высоким выходом, легкостью очистки и стабильностью при хранении. Эффективность такого подхода иллюстрируется многочисленными примерами создания VLP для борьбы с такими инфекционными заболеваниями, как малярия, бешенство, вирусные гепатиты В, С и Е папилломавирусная инфекция (рак шейки матки), СПИД и т.д.
[26]Один из наиболее эффективных носителей антигенных детерминант является нуклеокапсидный белок вируса гепатита Б человека, а также близкородственных вирусов животных, в дальнейшем коллективно именуемых ВГБ. Мономеры этого белка, состоящие из 183-185 аминокислот, в инфицированных клетках собираются в стабильные агрегаты (вирусоподобные частицы), называемые НВс-частицы. Образуются два типа частиц: частицы диаметром около 30 нм, состоящие из 180 мономеров, и в большем количестве частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц.
[27]Известно, что НВс-частицы могут быть использованы в качестве высокоиммуногенного носителя чужеродных пептидов, стимулирующего Т-клеточный иммунный ответ. Два района НВс могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс-частиц: N-конец белка и так называемая иммунодоминантная петля, расположенная между 75 и 85 аминокислотными остатками белка. Было показано, что С-концевая аргинин-богатая область белка (150-183 аминокислотные остатки) может быть удалена без нарушения самосборки частиц, более того, в отличие от образованных полноразмерным белком, такие частицы при сборке не включают нуклеиновые кислоты клетки-хозяина.
[28]Химерные НВс частицы часто имеют менее упорядоченную структуру, чем частицы, не содержащие эпитопов [Schodel et al., (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]. Во многих случаях вставка эпитопа вызывает настолько сильную дестабилизацию, что гибридные частицы либо вообще не могут быть получены, либо оказываются настолько нестабильными, что не могут быть использованы в качестве компонента вакцин [Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62:1669-1676]. Поэтому показанная ниже упорядоченная структура и стабильность созданных в настоящем изобретении рекомбинантных НВс-частиц, содержащих эпитопы вирусов гриппа птиц, не являются заранее ожидаемыми.
[29]Использование рекомбинантных НВс-частиц для получения противогриппозных вакцин описано в работе [Neirynck et al., (October 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163] и последующих работах этой группы. Их авторами получена серия рекомбинантных НВс-частиц, содержащих внеклеточный домен М2 (М2Е) белка вируса гриппа человека, и показаны их высокая иммуногенность и защита от инфекции человеческими вирусами в опытах на лабораторных животных. В этих работах была использована М2Е последовательность S L L T E V E T P I R N E W G C R C N D S S D, присутствующая в практически неизменном виде во всех человеческих штаммах вируса начиная с изолированного в 1933 г. штамма A/WSN/33 (H1N1).
[30]Белок М2 вирусов гриппа типа А принципиально важен для конструирования универсальных вакцин в связи с рядом недооцененных его свойств:
[31]1. Локализация и экспонирование на поверхности вириона.
[32]2. Критическая важность в процессах фьюжина и почкования (ранняя и поздняя стадии инфекции).
[33]3. Высокий консерватизм среди всех подтипов вируса вируса гриппа А.
[34]Выбор высококонсервативного антигена предусматривал индукцию антител, способных к подавлению репродукции к большинству подтипов А вирусов гриппа. Такая вакцина получила название «универсальной» - предполагающей защиту фактически от всех вирусов гриппа типа А.
[35]Поэтому созданная этими авторами вакцина оказалась «универсальной» в отношении человеческого гриппа. Однако у вирусов гриппа животных последовательность М2Е отличается от приведенной выше. Например, последовательности S L L T E V E T P T R N G W E C K C S D S S D и S L L T E V E T P T R N E W E C R C S D S S D встречаются в различных штаммах птичьего гриппа (Фиг.1). Опубликованные данные об эффективности вакцин, созданных на основе человеческого М2Е, в отношении птичьего гриппа отсутствуют. Более того, полученные в ходе реализации настоящего изобретения результаты свидетельствуют о том, что М2Е-НВс частицы, содержащие «птичий» М2Е, эффективны против птичьего гриппа, но не человеческого штамма A/PR/8/34 (H1N1). Таким образом, существующие в настоящее время методы создания противогриппозных вакцин, имеющие в своей основе конструирование рекомбинантных М2Е-НВс частиц, содержащих «человеческий» М2Е, не решают задачу создания вакцины против вируса птичьего гриппа. В связи с этим целью изобретения являлась разработка подходов к созданию «универсальных» вакцин и, в частности, вакцины, обеспечивающей эффективную защиту против эволюционирующих вирусов гриппа птиц, представляющих особую опасность для людей в предпандемический период.
[36]Раскрытие изобретения
[37]В настоящем изобретении ставилась задача создания «универсальной» кандидатной вакцины против вирусов птичьего гриппа. В основу решения поставленной задачи было положено конструирование рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе ядерного антигена вируса гепатита В (НВС), представляющих на своей поверхности полипептиды внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа птиц.
[38]Фактически задача была решена путем:
[39]а) дизайна конструкции для экспрессии функционально важного и доступного эпитопа наиболее консервативного белка вирусов гриппа типа А
[40]б) синтеза генов, кодирующих гибридные белки, включающие М2Е и лишенный С-концевой области НВс антиген ВГБ,
[41]в) создания штаммов Е. coli - продуцентов гибридных белков М2Е-НВс,
[42]г) разработки протоколов выделения и очистки рекомбинантных М2Е-НВс частиц,
[43]д) проведения испытаний полученных препаратов на лабораторных животных, результаты которых свидетельствуют о высокой иммуногенности М2Е-НВс частиц, антивирусной (вирус-нейтрализующей) активности сывороток иммунизированных животных и 100% защите животных от летальной гриппозной инфекции.
[44]Первый аспект настоящего изобретения связан с получением синтетических генов, кодирующих гибридные белки, аминокислотная последовательность которых, начиная с N-конца, состоит из остатка метионина, последовательности внеклеточного домена М2 (М2Е) белка вируса гриппа птиц от 2-й до 24-й аминокислоты, изображенной на Фиг.1, и последовательности ядерного антигена вируса гепатита Б (НВС) от 4-й до 149-й аминокислоты, относительно первого метионина в нативном НВС, за которой, при необходимости, может следовать один цистеин. В одном из конкретных воплощений изобретения в состав гибридного белка после первого метионина включена последовательность S L L T E V E T P T R N G W E C K C S D S S D из штамма A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2), в другом - последовательность S L L T E V E T P T R N E W E C R C S D S S D из штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).
[45]Вторым аспектом изобретения является получение экспрессионных векторов и штаммов Е. coli - продуцентов гибридных белков. С этой целью синтетические фрагменты ДНК, содержащие гены гибридных белков, были клонированы в экспрессионном векторе pQE60 под контролем РТ5-lac промотора, репрессируемого LacI и индуцируемого IPTG.
[46]Соответственно, третий аспект изобретения относится к оптимизации условий продукции рекомбинантных белков в клетках Е. coli и разработке методов выделения и очистки М2Е-НВс частиц.
[47]Четвертый аспект изобретения связан с проведением испытаний полученных препаратов на лабораторных животных. При этом было показано, что (1) препараты М2Е-НВс частиц не токсичны для лабораторных животных (мышей), (2) иммунизация мышей приводит к образованию в их крови антител, специфически распознающих М2Е пептид в составе М2Е-НВс частиц, (3) сыворотки иммунизованных мышей подавляют репродукцию вирусов птичьего гриппа in vitro, (4) пассивная иммунизация мышей приводит к снижению уровня накопления вируса в легких после инфекции гомологичным по аминокислотной последовательности М2е штаммом A/Duck/Potsdam/4024/26 (H5N2) в 100-126 раз, гетерологичным (95,7% гомологии) штаммом A/Hon Kong/1073/99 (H9N2) в 16-20 раз, (5) двух- или трехкратная иммунизация мышей препаратом М2Е-НВс частиц обеспечивает их 100% защиту от летальной гриппозной инфекции.
[48]Для проведения иммунизации вирусоподобные частицы растворяли в физиологически приемлемом носителе, в качестве которого может быть использован буфер, содержащий 50 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 0,5 М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20% сахарозы. При необходимости для повышения эффективности иммунного ответа могут быть использованы адъюванты, например, иммунизация может проводиться в форме подкожной инъекции эмульсий «вода в масле», полученной после смешивания 1:1 указанного выше раствора препарата М2Е-НВс частиц с адъювантом TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma). Альтернативным вариантом является внутрибрюшинная иммунизация с использованием в качестве адъюванта смеси 25 мкг monophosphoryl lipid A (Sigma) + 25 мкг muramyl dipeptide (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine hydrate, Sigma).
[49]Краткое описание чертежей
[50]Фиг.1 - Структура М2 белка вируса гриппа (внеклеточный домен выделен рамкой) и сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов М2 белков различных штаммов вируса гриппа человека и животных. Несовпадающие аминокислоты выделены серым.
[51]Фиг.2 - Аминокислотные последовательности гибридных белков М2Е-НВс.Последовательность аминокислот из М2 белка подчеркнута, аминокислоты, различающиеся в двух штаммах вируса гриппа, выделены серым.
[52]Фиг.3 - Структура экспрессионного вектора pQE-M2HBc.
[53]Фиг.4 - Анализ уровня продукции гибридного белка М2Е-НВс с помощью SDS-PAGE:
[54]1 - маркер молекулярной массы (в килодальтонах)
[56]3 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 без индукции синтеза продукта
[57]4 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 через 16 часов после индукции синтеза продукта.
[58]Фиг.5 - Анализ структуры М2Е-НВс частиц с помощью электронной микроскопии:
[59]А - препарат рекомбинантных частиц М2НВс-1
[60]Б - препарат нерекомбинантных частиц НВс.
[61]Фиг.6 - Результаты дот-блот анализа сывороток мышей, иммунизованных М2Е-НВс. На дот-блоты нанесены белковые препараты, выделенные из штаммов Е. coli - продуцентов:
[62]1 - DLT1270/pQE-HBc (без индукции синтеза продукта)
[63]2 - DLT1270/pQE-HBc (после индукции синтеза продукта)
[64]3 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 (без индукции синтеза продукта)
[65]4 - DLT1270/pQE-M2HBc-1 (после индукции синтеза продукта).
[66]Фиг.7 - Репродукция вируса гриппа птиц в легких мышей, зараженных после пассивной иммунизации:
[67]1 и 2 - опытные группы мышей, предварительно иммунизированные трехкратно с интервалом в три недели разными дозами химерного белка М2еНВс
[68]3 и 4 - контрольные группы мышей.
[69]Полосы погрешностей указывают доверительный интервал.
[70]* р<0,05 - относительно контрольных групп мышей.
[71]Фиг.8 - Динамика гибели мышей, иммунизированных М2НВс-1 частицами после заражения вирусом гриппа птиц A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2).
[72]Осуществление изобретения
[73]Пример 1. Гибридные белки М2Е-НВс
[74]Два типа гибридных белков, включающих внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа птиц (М2Е домен), и фрагмент НВс антигена ВГБ, были использованы для получения иммуногенных вирусоподобных частиц. Первый белок, М2-НВс1, включал последовательно следующие элементы: N-концевой метионин, последовательность аминокислот SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD, соответствующую М2Е домену из штамма A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2) вируса гриппа птиц, аминокислотную последовательность НВс (Bichko, V., Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P. and Gren, E. 1985 Subtype ayw variant of hepatitis В virus. DNA primary structure analysis. FEBS Lett. 185 (1), 208-212), начиная с аспарагина в положении +4 до валина в положении +149 (относительно первого метионина в нативном НВс), и цистеин на С- конце (Фиг.2). Введение С-концевого цистеина имело целью повысить стабильность рекомбинантных М2Е-НВс частиц, но не обязательно для получения высокоактивных вирусоподобных частиц. Второй белок, М2-НВс2, отличался от первого тем, что содержал последовательность SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD соответствующую М2Е домену из другого штамма птичьего гриппа, A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).
[75]Для получения описанных выше гибридных белков были синтезированы кодирующие их гены. На первом этапе часть последовательности НВс антигена была получена в результате проведения ПЦР с использованием праймеров M2F1 (С GGC TGG GAA TGC ААА TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC ССТ ТАТ ААА GAA TTT GGA GCT) и HBC-R (AAG АТС ТСА GCA AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG) и ДНК копии генома вируса гепатита Б в качестве матрицы. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 94°С - 30 сек, (2) 50°С - 60 сек, (3) 70°С - 90 сек, шаги 1-3 повторяли 40 раз. На следующем этапе полученный фрагмент ДНК был использован в качестве матрицы для проведения ПЦР-амплификации с праймерами M2F2 (CTC ATG AGC CTG CTG АСС GAA GTG GAA АСС CCG АСС CGT AAC GGC TGG GAA TGC ААА TGC) и HBC-R. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 94°С - 30 сек, (2) 50°С - 60 сек, (3) 70°С - 90 сек, шаги 1-3 повторяли 40 раз.
[76]После электрофоретического анализа выделяли ПЦР-фрагмент размером 0,52 т.п.н., который лигировали с ДНК вектора pUC19, предварительно обработанной рестриктазой SmaI. Полученную плазмиду, которая была отобрана по результатам рестрикционного анализа, обозначали pUC-M2HBC-1 и использовали для получения фрагмента, содержащего ген, кодирующий гибридный белок М2НВС-1. Для этого ее обрабатывали рестриктазами PagI и BglII, выделяли фрагмент размером 0,52 т.п.н. и клонировали его в экспрессионном векторе pQE60 по сайтам NcoI и BglII. Полученный экспрессионный вектор был обозначен как pQE-M2HBc-1 (Фиг.3) и использован в дальнейшей работе.
[77]Синтез гена, кодирующего второй гибридный белок, М2-НВс-2, содержащий последовательность SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD из штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), осуществляли аналогичным образом, за исключением того, что вместо праймера M2F1 был использован праймер M2F3 (С GAA TGG GAA TGC CGT TGC AGC GAT AGC AGC GAT GAC ССТ), вместо M2F2 - праймер M2F4 (CTC ATG AGC CTG CTG АСС GAA GTG GAA АСС CCG АСС CGT AAC GAA TGG GAA TGC CGT TGC), а вместо HBC-R - праймер HBC-R2 (А GGA TCC ТСА GCA AAC AAC AGT AGT CTC CGG AAG). Полученный экспрессионный вектор был обозначен как pQE-M2HBc-2.
[78]Отсутствие обусловленных ПЦР мутаций в синтезированных генах было подтверждено с помощью ДНК-секвенирования.
[79]Пример 2. Создание штаммов Е. coli - продуцентов гибридных белков М2Е-НВс
[80]Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков плазмиды рОЕ-М2НВс-1 и pQE-M2HBc-2 вводили в клетки Е. coli штамма DLT1270 с помощью трансформации. Штамм DLT1270, являющийся производным штамма DH10B [Grant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. v.87(12), p.4645-4649], содержит ген репрессора лактозного оперона laCI, интегрированный в хромосому. Культуры трансформированных клеток DLT1270/pQE-M2HBc-1 и DLT1270/pQE-M2HBc-2 выращивали в стандартных условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, например в LB-бульоне, до середины логарифмической фазы роста (OD600=0,5) при 37°С, добавляли IPTG до концентрации 1 mM (достаточной для полной индукции промотора) и выращивали клетки еще в течение 16 часов при 37°С. Пробы для определения белка отбирали в начальный момент времени, а также через 16 часов после индукции. Определение уровня экспрессии гибридных белков проводили путем анализа суммарных белковых препаратов, выделенных из бактериальных культур с помощью SDS-PAGE. Максимальный уровень продукции гибридного белка составлял около 30-40% общего клеточного белка (Фиг.4).
[81]Пример 3. Выделение и очистка М2Е-НВс частиц
[82]Клетки E. coli штамма-продуцента рекомбинантного белка М2Е-НВс после индукции (см. выше) осаждали центрифугированием 3000 об/мин 30 минут и ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl буфере рН 8,0, содержащим 0,5 М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20% сахарозы из расчета 1 мл буфера на 50 мл культуральной жидкости. Клеточную суспензию обрабатывали лизоцимом (1 мг/мл) в течение 15 минут при +4°С, затем клетки разрушали ультразвуком. К полученному лизату добавляли 1/20 объема раствора полиэтиленгликоля (50% вес/объем) и инкубировали 30 минут при +4°С. Затем проводили центрифугирование в течение 10 минут при 13000 об/мин. К супернатанту добавляли 1/5 объема насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивали и оставляли на 30 минут при +4°С. Образовавшийся после центрифугирования осадок белков растворяли в 1 мл того же буфера и повторно осаждали сульфатом аммония в тех же условиях. Полученный осадок растворяли в 1 мл 50 мМ Tris-HCl буфера с рН 8,0, содержащего 0,5М NaCl, 15 мМ ЭДТА и 20% сахарозы. Полученный препарат М2Е-НВс частиц содержал по данным SDS-PAGE около 90% белка М2Е-НВс в концентрации примерно 0,5 мг/мл.
[83]Указанные условия выделения и очистки подбирались экспериментальным путем и могут варьироваться в известных среднему специалисту в этой области значениях.
[84]Структура выделенных частиц была проанализирована с помощью электронной микроскопии, в качестве контроля был использован препарат НВс-частиц, не содержащих М2Е полипептида, а в остальном эквивалентный частицам, описанным в Примерах 1 и 2. Электронно-микроскопический анализ (Фиг.5) подтвердил факт самосборки гибридных белков М2НВс в наноразмерные частицы, сходные с частицами, образуемыми эквивалентным НВс антигеном, не содержащим М2Е полипептида. Следует, однако, отметить, наряду с основной фракцией частиц нормального размера в случае М2НВс белков наблюдалась и незначительная примесь частиц меньшего диаметра, характерная для частиц с нарушениями сборки и/или пониженной структурной стабильностью.
[85]Пример 4. Иммуногенность М2Е-НВс частиц
[86]Испытание препарата М2НВс-1 частиц на токсичность
[87]Для проверки препарата рекомбинантных частиц М2НВс-1 на токсичность были использованы белые беспородные мыши, обоего пола, массой 18-20 г, полученные в питомнике «Рапполово» РАМН. Все мыши были распределены на 3 группы (две опытных и одна контрольная) по 5 особей в каждой. Препарат вводили внутрибрюшинно 5-ти мышам опытных групп в дозе 10 мкг и 100 мкг/мышь в объеме 0,2 мл. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор хлористого натрия. Препарат вводили стерильным шприцем, вместимостью 1 мл. Наблюдение за животными осуществляли ежедневно в течение 7 суток.
[88]Результаты испытания, представленные в таблице 2, показали, что в течение всего периода наблюдений все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. Отмечался прирост массы всех животных в день окончания наблюдения по сравнению с исходными параметрами. Таким образом, обе дозы испытуемого препарата (10 и 100 мкг/мышь) не оказывает токсического действия на мышей.
[89]Иммунизация мышей препаратом М2НВс-1 частиц
[90]Препарат вводили внутрибрюшинно 5-ти мышам опытных групп в дозе 10 мкг и 100 мкг/мышь в объеме 0,2 мл. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор хлористого натрия. Иммунизацию повторяли дважды с интервалом 3 недели. По окончании эксперимента опытные и контрольные мыши были использованы для получения сывороток.
[91]| Таблица 2 |
| Динамика массы тела животных после введения различных доз препарата М2Е-НВс |
| Препарат | Доза, мкг/мышь | Масса тела испытуемых животных, г |
| Дни наблюдения | Разница массы тела, г |
| М2еНВс | 10 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 19,7 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 21,0 | +1,3 |
| 18,5 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 19,2 | +0,7 |
| 19,4 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 21,8 | +2,4 |
| 18,0 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 18,6 | +0,6 |
| 18,2 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 19,7 | +1,5 |
| 100 | 19,3 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 19,5 | +0,2 |
| 18,0 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 19,2 | +1,2 |
| 19,1 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 19,2 | +0,1 |
| 18,6 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 20,7 | +2,1 |
| 19,1 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 19,8 | +0,7 |
| Контроль | Физраствор | 20,0 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 20,8 | +0,8 |
| 19,2 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 21,0 | +1.8 |
| 19,3 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 21.1 | +1,8 |
| 18,4 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 18,6 | +0,2 |
| 20,0 | ж | ж | ж | ж | ж | ж | 22,6 | +2,6 |
| Примечание: ж - живые; у - умершие животные |
[92]Дот-блот анализ сывороток мышей, иммунизованных препаратами М2НВс-1 частиц
[93]Сыворотки мышей, иммунизированных препаратами частиц М2НВс-1, были проанализированы на наличие в них специфических антител к М2 белку. Для этого сыворотки опытных и контрольных мышей были использованы для дот-блот анализа суммарных белковых препаратов, выделенных из клеток DLT1270/pQE-M2HBc-1 или DLT1270/pQE-HBc до и после начала продукции М2НВс-1 белка. Дот-блот анализ проводился в условиях, исключающих денатурацию белков и разрушения М2НВс частиц. В результате было установлено (Фиг.6), что (1) сыворотки иммунизированных препаратом М2НВс-1 частиц мышей, в отличие от сывороток контрольных мышей, специфически связываются с М2НВс-1 и (2) иммунный ответ против нерекомбинантного НВс антигена практически отсутствует. Таким образом, иммунизация мышей препаратом М2НВс-1 частиц вызывает образование специфических антител, распознающих М2Е полипептид.
[94]Пример 5. Подавление репродукции вируса гриппа птиц сыворотками иммунизированных мышей in vitro
[95]Инфекционную активность вирусов гриппа оценивали в культуре клеток МДСК, выращенной в 96-луночной панели в присутствии ростовой среды альфа 2 MEM с 2% прогретой эмбриональной сывороткой телят. Клетки предварительно инфицировали десятикратными разведениями вирусов. Через 1 ч после заражения клеточный монослой дважды отмывали от неадсорбировавшегося вируса средой альфа 2 MEM. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл мышиной поликлональной сыворотки, полученной путем трехкратной внутрибрюшинной иммунизации животных химерным белком М2еНВс, в дозе, нетоксичной для клеток МДСК. Для этого сыворотку разводили 1:20 поддерживающей средой альфа 2 MEM с добавлением гистидина, глютамина, антибиотиков, без трипсина. Клетки инкубировали в течение 72 ч при 37°С в CO2-инкубаторе.
[96]Инфекционную активность вируса определяли путем забора из каждой лунки 50 мкл культуральной жидкости, переноса материала в аналогичную чистую планшетку и добавления 50 мкл 1% эритроцитов кур. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Результаты представлены в таблице 3.
[97]| Таблица 3 |
| Влияние мышиных поликлональных антител к М2е домену на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток MDCK |
| Показатели репродуктивной активности вируса | Иммунизирующая доза М2еНВс, мкг/мышь | Штамм вируса гриппа |
| A/Duck/Potsdam (H5N2) | A/Hong Kong(H7N2) | A/PR/8/34 (H1N1) |
| Инфекционная активность, lg ТИД/50 | 10 | 2,5 | 3,0 | 5,5 |
| 100 | 1,0 | 2,0 | 5,0 |
| Физраствор (контроль) | 7,0 | 7,0 | 8,5 |
| Контроль вируса | | 7,0 | 7,0 | 8,5 |
[98]В данных условиях эксперимента отмечается достоверное подавление в культуре клеток МДСК репродукции вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam (H5N2) поликлональной иммунной мышиной сывороткой, содержащей М2е-антитела к химерному белку М2еНВс, в котором аминокислотная последовательность М2е-фрагмента на 100% гомологична аминокислотной последовательности М2е домена этого штамма вируса гриппа.
[99]Достоверное снижение титра гемагглютинирующей активности вируса A/Hong Kong (H7N2) в группе, в которой использована сыворотка мышей, иммунизированных дозой 100 мкг/мышь, также свидетельствует о снижении репродукции этого штамма вируса гриппа птиц, последовательность М2е домена которого отличается несколькими аминокислотными заменами. В отношении «человеческого» вируса A/PR/8/34 (H1N1) данная поликлональная иммунная мышиная сыворотка не проявляет достоверную противовирусную активность.
[100]Пример 6. Репродукция вируса гриппа птиц в легких мышей, зараженных после пассивной иммунизации
[101]Сыворотки, полученные из мышей, 3-кратно иммунизированных препаратом М2НВс-1 частиц (дозы 10 и 100 мкг), а также сыворотки контрольных мышей или эквивалентный объем физиологического раствора хлористого натрия, были введены здоровым мышам, которые затем были заражены 5 LD вируса птичьего гриппа. В этом эксперименте были использованы два штамма: гомологичный по аминокислотной последовательности М2е фрагмента штамм A/Duck/Potsdam/4024/26 (H5N2) и гетерологичный (замена Р на L в положении +10 белка М2НВс-1) штамм A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).
[102]Предварительное введение здоровым мышам сыворотки, полученной после внутрибрюшинной трехкратной иммунизации опытных мышей дозой 100 мкг/мышь химерного белка М2еНВс (пассивная иммунизация), привело к статистически достоверному (p<0,05) снижению титра вируса гриппа птиц в легких к штамму A/Duck/Potsdam/4024/26 (H5N2) в 100-126 раз, а к штамму A/HongKong/1073/99 (H9N2) в 16-20 раз (Фиг.7). Полученные данные свидетельствуют о сильном заметном эффекте и нейтрализующей активности антител, продуцирующихся в ответ на иммунизацию М2еНВс.Следовательно, полученный препарат может рассматриваться в качестве кандидата на универсальную вакцину против гриппа типа А.
[103]Пример 7. Изучение in silico последовательности пептидов (эпитопов) внеклеточного домена М2е белка вирусов гриппа типа А и их способности связываться с молекулами МНС
[104]Проведенные исследования позволяют сделать выбор панели эпитопов, перспективных для создания универсальной вакцины против вирусов гриппа типа А. Существенно, что при проведении скрининга эпитопов использовался комплексный подход, сочетая вышеперечисленные методы с предсказанием протеосомного расщепления исследуемого белка и связывания пептидов с ТАР-белками.
[105]Обобщенные результаты исследования, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что наряду с использованной в испытанной конструкции эпитопа дополнительный интерес может представлять последовательность а.к. 3-12, которая является наиболее вероятным участком локализации антигенной детерминанты как для человека, так и для мыши. Сочетание этих двух последовательностей может повысить показатели предлагаемой универсальной вакцины.
[106]
[107]Пример 8. Протективное действие М2Е-НВс частиц на модели летальной гриппозной инфекции
[108]Были использованы самки мышей линии Balb/c, 7-8 недельного возраста, полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Ленинградская обл.). Животных содержали в виварии ГУ НИИ гриппа РАМН в соответствии с действующими правилами.
[109]Все мыши были разделены на 5 групп. Препарат М2НВс-1 частиц вводили в дозе 10 мкг/мышь по следующей схеме:
[110]- первая иммунизация - подкожная инъекция по 25 мкл в четыре места (общий объем 100 мкл) в виде эмульсии «вода в масле», полученной после смешивания 1:1 раствора образца кандидатной вакцины с адъювантом TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma);
[111]- вторую и третью иммунизацию проводили с помощью внутрибрюшинного введения образцов по 100 мкл/мышь. В качестве адъюванта использовали смесь 25 мкг monophosphoryl lipid A (Sigma) + 25 мкг muramyl dipeptide (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine hydrate, Sigma). Все инъекции проводили с интервалом в три недели.
[112]Одну группу животных иммунизировали интраназально по 50 мкл под легким эфирным наркозом 1/100 LD/50 дозой живого вируса A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2). Контрольной группе животных вводили аналогичные адъюванты по вышеупомянутой схеме.
[113]Таким образом, все мыши были разделены на пять групп:
[114]1. Трехкратная иммунизация М2еНВс;
[115]2. Двукратная иммунизация М2еНВс;
[116]3. Однократная иммунизация М2еНВс;
[117]4. Однократная иммунизация живой вакциной, содержащей вирус гриппа птиц A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 (H5N2);
[118]5. Контрольная группа (трехкратная иммунизация с соответствующими адъювантами).
[119]Для изучения протективного действия М2НВс-1 частиц через две недели после последней иммунизации проводили заражение мышей интраназально под легким эфирным наркозом 5 LD/50 вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2). Аминокислотная последовательность экстрацеллюлярного домена М2 белка этого штамма вируса гриппа птиц гомологична аминокислотной последовательности М2е фрагмента в составе гибридного белка М2НВс-1.
[120]На Фиг.8 показаны результаты основного показателя, по которому оценивается эффективность протективного действия М2НВс-1 частиц - динамика гибели мышей после заражения 5 LD/50 вируса гриппа птиц A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2). Полученные данные однозначно свидетельствуют о высоком (100%) протективном действии М2НВс-1 после двукратной или трехкратной иммунизации. За весь период наблюдения все животные в этих группах, а также в группе мышей, вакцинированных живым вирусом A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (H5N2), остались живыми. В контрольной группе мышей при этих условиях заражения осталось в живых лишь 20% животных, что существенно ниже (Р<0,0001), чем в вышеуказанных опытных группах. Однократная иммунизация мышей препаратом М2НВс-1 оказалась недостаточной, так как в этой группе на восьмые сутки осталось в живых лишь 30% животных, что сравнимо с аналогичным показателем в контрольной группе.
[121]Таким образом, показано 100% протективное действие кандидатной вакцины на основе М2НВс частиц на модели летальной гриппозной инфекции после заражения гомологичным по М2е пептиду штаммом вируса гриппа птиц.
[122]Полученные данные об эффективности вакцины на млекопитающих позволяют экстраполировать достигнутый эффект и на птиц, поскольку механизмы функционирования иммунной системы у птиц и млекопитающих в основном сходны (например, Alberts et al., Molecular biology of the cell, Garland Publishing Inc, 1989), a лабораторные животные являются стандартной моделью для создания вакцин для птиц (например, University of Pittsburgh Medical Center. "Vaccine Provides 100 Percent Protection Against Avian Flu Virus In Animal Study." ScienceDaily 26 January 2006; Fauci AS. Pandemic influenza threat and preparedness. Emerg Infect Dis 2006 Jan; 12(1): 73-6).
[123]Таким образом, создание принципиально новой уникальной и высокоэффективной вакцины против инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц, позволит пополнить ряд вакцинных препаратов против гриппа, что чрезвычайно необходимо в создавшейся неблагоприятной эпидемической ситуации по гриппу в мире.
