[1]Изобретение относится к области материалов для медицины, в частности к электроформованным волокнистым материалам, используемым для изготовления раневых покрытий.
[2]К настоящему времени опубликовано значительное количество работ, посвященных получению нановолокон хитозана и их применению в медицине. К примеру, известно многослойное раневое покрытие, которое состоит из подложки и нескольких индивидуальных электроформованных нановолокнистых слоев, по меньшей мере один из которых - слой из хитозана (US 2011/0111012 А1, 12.05.2011). Также уже существуют раневые повязки, состоящие полностью из нановолокон хитозана (RU 2522216 С1, 10.07.2014) (прототип) и раневая повязка ХитоПран [РУ на медицинское изделие № ФСР 2012/14071 от 26 августа 2014 года], однако применение этих покрытий в раневой терапии ограничено чистыми ранами на стадии грануляции и не рекомендовано для лечения гнойных, инфицированных ран. Известно, что хитозан обладает биологической активностью по отношению к микроорганизмам, однако часто его позиционируют как бактериостатик, поскольку бактерицидная активность хитозана проявляется в том случае, когда аминогруппы протонированы, что наблюдается в растворе при рН<6. При этом антимикробная активность хитозана увеличивается по отношению к бактериям, имеющим клеточную оболочку с высоким отрицательным зарядом [Ying-chien Chung, Ya-ping Su, Chiing-chang Chen etc. Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall. // Acta Pharmacol. Sin., 2004. - V. 25. - N7. - P. 932-936]. Бактериостатический эффект хитозанового нановолокнистого материала был установлен авторами [Фесенко О.А., Матюшин А.Н., Юданова Т.Н., Габриелян Г.А. Получение модифицированного хитозанового нановолокнистого материала с биологической активностью / Пятая всерос. Каргинская конф. «Полимеры - 2010», М., 2010 г. ], а бактерицидный эффект достигался путем обработки нановолокнистого материала раствором левомицетина.
[3]Таким образом, хитозановые нановолокна не вызывают гибель бактерий, более того, являясь биодеградируемыми, они могут являться субстратом для определенных видов бактерий. Очевидно, что для гарантированного предотвращения и подавления развития патогенной микрофлоры необходимо введение в состав волокон антибиотика. На основании проведенного анализа литературных источников установлено, что основными и наиболее устойчивыми возбудителями раневых инфекций являются кишечные палочки, золотистый стафилококк и синегнойная палочка [Фиалкина С.В., 2004, Абрамова Н.В. и др. (2010); Аветисян Л.Р. и др. (2010); Агапова Е.Д. (2010); Исхакова Х.И. (2010) и Материалы 1-го Международного конгресса «Раны и раневые инфекции» (2012)]. Для борьбы с этими возбудителями в гнойной хирургии применяют антибиотики, в том числе ципрофлоксацин [Clin Infect Dis. (2005) 41 (10): 1373-1406.doi: 10.1086/497143].
[4]Многослойный материал, чувствительный к штамму Enterococcus faecalis 49, по настоящему изобретению содержит волокнистый слой из хитозана грибов, или смеси хитозана грибов и хитозана животного происхождения с поверхностной плотностью слоя до 50 г/м2 и диаметром волокон в диапазоне до 1000 нм и/или до 10 мкм и содержит в качестве антибиотика ципрофлоксацин. Материал имеет наружные слои: один - подложка, другой - защитный, который удаляется при наложении на рану. Между ними может находиться по меньшей мере еще один слой из нано- и ультратонких волокон. Количество и состав слоев определяются назначением изделия.
[5]Задачей настоящего изобретения является создание нового антибактериального раневого покрытия, чувствительного к штамму Enterococcus faecalis 49, с хитозановым слоем из нано- и ультратонких волокон, содержащих один или несколько антибиотиков, предназначенного для лечения гнойных и инфицированных ран. Указанная задача решается за счет того, что в формовочный раствор для создания волокнистого материала на основе хитозана (см. RU 2522216) добавляется 0,3% раствор ципрофлоксацина - Ципрофлоксацин АКОС PN001587/02-2003. МНН. Формовочные растворы готовятся растворением хитозана и полиэтиленоксида (ПЭО) в растворе ципрофлоксацина с последующим добавлением уксусной кислоты и этилового спирта. Соотношение ципрофлоксацина к хитозану в полученных образцах варьировалось от 1:30 до 1:3000, массовая доля ципрофлоксацина 0,03 до 3%.
[6]После получения образцы:
[7]- термостатировали при 60°С в течение 3 часов для удаления остаточной уксусной кислоты;
[8]- стерилизовали радиационным методом дозой 20±5 кГр.
[9]Таким образом, тест-объектами служили стерильные, предварительно термообработанные при 60°С в течение 3 часов образцы с разными концентрациями антибиотика ципрофлоксацина размером 1 см × 1 см и плотностью 15 г/м2. Для сравнения использовали 2 объекта:
[10]- образцы нано-/ультратонких волокон хитозана плотностью 15 г/м2 без антибиотика, а именно раневую повязку ХитоПран по РУ ФСР ФСР 2012/14071 от 26 августа 2014 года;
[11]- полиэфирный нетканый волокнистый материал, пропитанный раствором ципрофлоксацина. Пропитку и последующую сушку образцов осуществляли таким образом, чтобы обеспечить соотношение ципрофлоксацина к материалу в полученных образцах от 1:30 до 1:3000.
[12]Изучение антимикробной активности полученных образцов проводили по методике [Методические указания по лабораторной оценке антимикробной активности текстильных материалов, содержащих антимикробные препараты, МЗ РФ. - М.: МЗ РФ, 1984] с использованием в качестве тест-микроорганизмов штаммов музейных бактериальных культур, полученных из коллекции ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича и госпитальных штаммов из ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи: Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 49 (VRE) - представителей грамположительной микрофлоры, Escherichia coli 1257 и Pseudomonas aeruginosa 10145 АТСС - представителей грамотрицательной микрофлоры.
[13]При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара АГВ и MX наносили бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещали испытуемые образцы. Диффузия антибиотика из образца в агар приводила к формированию вокруг них зоны подавления роста микроорганизмов. После инкубации чашек в термостате при температуре 35°-37°С в течение 24 часов учитывали результат путем измерения диаметра зоны лизиса в миллиметрах (так как образцы имеют форму квадрата, измеряли диаметр описанной вокруг квадрата окружности).
[14]При проведении исследований контрольные образцы нановолокон хитозана без антибиотика (ХитоПране) через 14 часов инкубирования чашек с посевами и нанесенными на поверхность посевов образцами ХитоПрана демонстрировали незначительное подавление бактериального роста, однако через 18 ч и 24 ч зон лизиса не выявлено.
[15]Вокруг образцов, содержащих ципрофлоксацин в различной концентрации, наблюдалась ярко выраженная зона лизиса (Рис. 1.), что свидетельствует о бактерицидном эффекте на всех используемых культурах. Более того, отмечено, что образцы, содержащие ципрофлоксацин в нано- и ультратонких волокнах, обладают повышенной антимикробной активностью по сравнению с образцами сравнения при прочих равных условиях, в частности зона лизиса вокруг хитозановых образцов была в среднем на 7 мм шире при тех же условиях проведения опыта (Табл. 1). Особо следует отметить, что была установлена антимикробная активность хитозановых нано- и ультратонких волокон с ципрофлоксацином в отношении клинического штамма Enterococcus faecalis 49 (VRE), который считается устойчивым к ципрофлоксацину [Salgado С, Sherertz R, Karchmer Т, et al. Public health initiative to control MRSA and VRE in Virginia and North Carolina. In: Program and abstracts of the 11th Annual Scientific Meeting of the Society for Healthcare Epidemiology of America; April 1-3, 2001; Toronto. Abstract 164. // Ostrowsky B, Trick W, Sohn AH, et al. Control of vancomycin-resistant Enterococcus in a region. N EnglJ Med. 2001; 344:1427-1433].
[16]
[17]Таким образом, нами зафиксирован технический результат, заключающийся в проявлении синергетического эффекта за счет:
[18]- наноструктурирования волокнистого носителя, в который включен ципрофлоксацин, и благодаря этому повышается биодоступность антибиотика;
[19]- биологической активности хитозановых нановолокон, благодаря чему полученный материал проявляет бактерицидную активность в отношении штамма Enterococcus faecalis 49 (VRE), который считается устойчивым к ципрофлоксацину.
[20]Примечательно также, что снижение содержания ципрофлоксацина в хитозановых нановолокнах в 100 раз с 3% до 0,03% приводит к очень незначительному уменьшению зоны лизиса. Это объясняется полимодальной зависимостью доза - эффект, характерной для биологически активных веществ [Подколзин А.А., Гуревич К.Г. Действие биологически активных веществ в малых дозах. - М.: КМК, 2002. - 170 с.], а также использованием в эксперименте ципрофлоксацина в малой дозе, равномерно распределенного в волокнистой наноструктурированной матрице и вследствие этого имеющего высокую скорость десорбции во внешнюю среду.
