[1]Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 16.
[2]Вирус папилломы человека (HPV - Human Papilloma Virus), поражая эпителиальные клетки, вызывает различные заболевания у человека. В зависимости от типа инфицирующего вируса, который на основании данных о гомологии последовательности ДНК классифицирован более чем в 70 типов, папилломавирусная инфекция проявляется в виде образования доброкачественных бородавок, незлокачественных кондилом или папиллом на слизистой половых органов или дыхательных путей. Вирус папилломы человека типа 16 и 18 вызывает эпителиальную дисплазию слизистой половых органов, именно эти типы вируса папилломы ассоциированы с большей частью преинвазивных и инвазивных карцином аногенитальной сферы (рак шейки матки, влагалища, вульвы и анального канала), из которых рак шейки матки - один из самых распространенных и опасных видов новообразований у женщин. По данным ВОЗ ежегодно раком шейки матки заболевают около 500 тысяч женщин во всем мире, причем более половины этих случаев заканчиваются летальным исходом. Клинические проявления рака шейки матки не обнаруживаются длительное время, в то же время ранняя диагностика папилломавирусной инфекции довольно сложна. Именно поэтому в борьбе с распространением такого тяжелого заболевания предпочтение отдается профилактике папилломавирусной инфекции, в частности иммунологически, путем индуцирования иммунного ответа у человека.
[3]Вирус папилломы относится к семейству паповирусов (Papoviridae), имеет диаметр 40-50 нм. Капсид вируса образован из 72 белковых капсомеров, состоящих из основного белка L1 и минорного белка L2. Геном вируса представлен в виде кольцевой двуцепочечной ДНК, которая содержит 8 ранних генов (Е1-Е7) и два поздних гена, кодирующих белки капсида L1 и L2. Главный белок L1 (55-60 кДа) способен сам собираться в вирусоподобные частицы (VLP - Virus-like particles), сходные по строению с вирионами, но не содержащие вирусную ДНК. Белок L1 обладает высокой иммуногенностью и индуцирует образование антител, нейтрализующих инфекционный вирус.
[4]В настоящее время рекомбинантные белки L1 HPV представляют собой перспективные иммуногенные компоненты для создания профилактических вакцин, направленных против опасных типов папилломавируса. Затруднения, препятствующие созданию эффективных папилломавирусных вакцин, прежде всего, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продукции рекомбинантных белков HPV, обладающих иммуногенными свойствами природных белков HPV L1.
[5]Известно получение белков L1 и L2 HPV типа 16 путем культивирования клеток CV - 1 млекопитающих, инфицированных рекомбинантным вектором вируса коровьей оспы [Zhou J. et al. Virology, v.185, p.251-257, 1991]. Известна экспрессия папилломавирусного белка L1, способного агрегировать в вирусоподобные частицы (VLP) и обладающего иммуногенностью, в эукариотической системе на основе культивируемых клеток насекомых, бакуловирусная система [Kirnbauer R. et al. Proc.Natl. Acad. Sci USA, v.89, р.12180-12184, 1992]. В научной и патентной литературе представлены примеры использования для получения рекомбинантных белков HPV системы экспрессии на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которым отдается предпочтение благодаря международно признанной безопасности дрожжей, способности к наработке больших количеств белка в нативной конформации. Так, Петров P.M. и др. [WO 2006/065166 A1, 2006] получали капсидные белки L1 вирусных серотипов 16, 18, 31 HPV, вызывающих наиболее агрессивные формы заболеваний у человека, из рекомбинантных штаммов дрожжей. Эти штаммы получали трансформацией дрожжевых клеток плазмидами с генами, кодирующими белки L1 указанных серотипов. Фрагменты ДНК, кодирующие эти белки, были выделены из клинического материала. Созданные дрожжевые продуценты при культивировании были способны экспрессировать белки L1 в виде вирусоподобных частиц. Белки L1 использовали для приготовления профилактических и терапевтических вакцин.
[6]Известно использование метилотрофных дрожжей Pichia pastoris для получения HPV16-L1 [Bazan S.B. et al. Arch. Virol. 2009, 154(10), 1609-17]. В геном Р.pastoris был введен ген, кодирующий белок L1 HPV типа 16 (HPV16-L1), под контролем регулируемого метанолом промотора. Этот ген имел оптимизированный кодоновый состав. Очистку белка L1 выполняли с использованием гепарин-сефарозной хроматографии с последующей стадией сборки вирусоподобных частиц (VLP). Образование биологически активных VLP подтверждали методами иммуноэлектронной микроскопии и гемагглютинации. Использование других видов метилотрофных дрожжей кроме Р.pastoris в качестве продуцента белка L1 HPV типа 16 в уровне техники не установлено.
[7]Ближайшим аналогом является патент RU 2206608, 2003, в котором описывается создание дрожжевого продуцента белка L1 HPV или L2 HPV разных типов, в том числе HPV 16 и 18, на примере Saccharomyces cerevisiae. Клонирование генов L1 и L2 HPV 16 осуществляли с использованием геномной ДНК, экстрагированной из клеток Caski (ATCC № CRL 1550). Конструировали экспрессионный плазмидный дрожжевой вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую соответствующий полипептид, под контролем промотора GAL10 и трансформировали им клетки S.cerevisiae. Способность рекомбинантных клеток S.cerevisiae экспрессировать белки L1 или L2 HPV анализировали иммуноблотингом.
[8]Получение капсидного белка L1 HPV, обладающего антигенными свойствами природного белка, с использованием рекомбинантного продуцента в соответствии с ближайшим аналогом при некоторых преимуществах по сравнению с ранее известными рекомбинантными продуцентами имеет и свои недостатки. К ним можно отнести нестабильность рекомбинантных клеток, связанную с относительно высокой частотой потерь автономной плазмиды при делении клеток. При культивировании штамма в неселективных для плазмиды условиях это приводит к накоплению клеток, не содержащих плазмиды и неспособных к синтезу целевого белка. Это существенно осложняет культивирование рекомбинантного штамма и увеличивает себестоимость целевого продукта. Для индукции экспрессии рекомбинантных белков используется достаточно дорогой реагент - галактоза, что увеличивает себестоимость целевого продукта.
[9]Задачей изобретения является создание эффективного микробиологического дрожжевого продуцента белка L1 HPV типа 16. Под эффективностью понимается возможность получения целевого продукта, обладающего необходимыми биологическими свойствами и низкой себестоимостью.
[10]Задача решена тем, что, согласно изобретению, для получения рекомбинантного штамма-продуцента капсидного белка L1 HPV16 экспрессионную плазмиду, содержащую фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HPV16-L1, под контролем промотора гена DAK (дегидрооксиацетон киназа) Hansenula polymorpha и селективным маркером (ген LEU2 H.polymorpha) интегрируют в геном реципиентного штамма DL1-L H.polymorpha. В результате отбора клонов, способных синтезировать белок HPV16-L1, был выделен трансформант с наибольшей продуктивностью, обозначенный КБТ-09/pHV-161. Искусственный ген интегрирован в геном, т.е. находится в составе одной из хромосом H.polymorpha. Это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. В соответствии с изменениями, внесенными в классификацию дрожжей, H.polymorpha является синонимом таксономического названия Pichia angusta [Hansenula Polymorpha. Biology and Applications. Edited by G. Gellissen, 2002, pp.3-4].
[11]Полученный рекомбинантный штамм Р.angusta позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка HPV16-L1 при более простых способах получения культур высокой плотности.
[12]Штамм депонирован под номером ВКМ Y-2988D, 7.04.2010 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К.Скрябина. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.
[13]Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
[14]При этом все рутинные генно-инженерные операции осуществляют согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Для ПЦР во всех случаях использовали полимеразу Pfu (Fermentas). Синтез олигонуклеотидов и фрагмента ДНК, кодирующего полипептид HPV16-L1, а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО "Евроген" г.Москва. Нуклеотидные последовательности синтезированных праймеров и фрагмента двуцепочечной ДНК, кодирующего полипептид HPV16-L1, приведены в Перечне последовательностей нуклеотидов.
[15]Пример 1. Получение рекомбинантного гена, содержащего промотор гена DAK и последовательность, кодирующую полипептид HPV16-L1.
[16]Фрагмент ДНК, содержащий промотор гена DAK H.polymorpha, получали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого приготовили реакционную смесь, содержащую однократный реакционный буфер для Pfu, dATP, dTTP, dGTP, dCTP в концентрации 200 мкМ каждый, праймеры DAK1 (SEQ ID NO:1) и DAK2 (SEQ ID NO:2) в концентрации 0,5 мкМ каждый, ДНК из штамма H.polymorpha DL1-L [Agaphonov et al., 1994, Yeast v10, pp.509-513; коллекция штаммов лаборатории молекулярной генетики РКНПК МЗ РФ] в концентрации 10 мкг/мл и полимеразу Pfu в концентрации 20 ед/мл. Праймер DAK2 перед ПЦР был фосфорилирован при помощи Т4 полинуклеотидкиназы. Эту смесь инкубировали в течение 30 циклов изменения температуры, каждый из которых включал инкубации при 95°С в течение 15 с, при 50°С в течение 30 с, при 72°С в течение 60 с. После этого полученные продукты реакции разделили в агарозном геле и выделили фрагмент размером 1095 п.н. Этот фрагмент смешали с фрагментом, кодирующим полипептид HPV16-L1 (SEQ ID NO:5), в концентрации 100 нг/мкл каждый и инкубировали с Т4 ДНК лигазой в однократном лигазном буфере при 20°С в течение двух часов. После этого 1 мкл лигазной смеси добавили к 100 мкл смеси для проведения ПЦР, содержащей однократный реакционный буфер для Pfu, dATP, dTTP, dGTP, dCTP в концентрации 200 мкМ каждый, праймеры DAK1 (SEQ ID NO:1) и HPV16L1/3'a (SEQ ID NO:3) в концентрации 0,5 мкМ каждый, и полимеразу Pfu в концентрации 20 ед/мл. Эту смесь инкубировали в течение 15 циклов изменения температуры, каждый из которых включал инкубации при 95°С в течение 15 с, при 50°С в течение 30 с, при 72°С в течение 150 с. После этого полученные продукты реакции разделили в агарозном геле и выделили фрагмент размером 2600 п.н. Этот фрагмент содержал рекомбинантный ген, включающий промотор гена DAK H.polymorpha и последовательность, кодирующую HPV16-L1.
[17]Пример 2. Получение плазмидного вектора рАМ517, содержащего рекомбинантный ген HPV16-L1 и селективный маркер ген LEU2 H.polymorpha.
[18]Фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HPV16-L1, под контролем промотора гена DAK H.polymorpha был гидролизован рестриктазой BglII. Препарат плазмиды AMIpLD1 [Agaphonov et al., 1999, Yeast 15:541-551], содержащей ген LEU2 H.polymorpha в качестве дрожжевого селективного маркера, был гидролизован рестриктазой BamHI и обработан щелочной фосфатазой из тимуса теленка. Полученные препараты фрагмента ДНК с рекомбинантным геном и линеаризованной плазмиды AMIpLD1 внесли в реакционную смесь для проведения лигирования в концентрации 30 нг/мкл. После инкубации с Т4 ДНК лигазой в течение 2 часов 2 мкл реакционной смеси использовали для трансформации штамма Escherichia coli DH5α. Из нескольких выросших трансформантов выделили плазмидную ДНК и использовали в качестве матрицы для проведения аналитической ПЦР с праймерами HPV16L1/3'a (SEQ ID NO:3) и HPV16L1/5'a (SEQ ID NO:4). Продукты ПЦР проанализировали методом электрофореза в агарозном геле. Был отобран препарат плазмиды, из которого в результате ПЦР образовывался фрагмент размером 1500 п.н. Определение последовательности нуклеотидов этой плазмиды подтвердило, что она содержит участок, кодирующий HPV16-L1 под контролем промотора DAK. H.polymorpha. Полученную плазмиду обозначили рАМ517.
[19]Пример 3. Введение плазмиды рАМ517 в геном H.polymorpha DL1-L.
[20]Штамм H.polymorpha DL1-L, являющийся ауксотрофом по лейцину, выращивали в течение 15-18 часов в жидкой среде YPD при 37°С. Полученную культуру разводили в 100 раз свежей средой YPD и инкубировали 4 часа в тех же условиях. Клетки из 200 мкл полученной культуры осаждали центрифугированием промывали стерильной дистиллированной водой и суспендировали в 30 мкл буфера Т (10 мМ трис-HCl рН 7,4; 100 мМ CH3COOLi; 0,5 мМ ЭДТА). К суспензии добавляли 1 мкг плазмиды рАМ517, 5 мкг ДНК носителя (фрагментированная и денатурированная ДНК сельди) и 60 мкл 70%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000. Все компоненты перемешивали и инкубировали 30 мин при 30°С и 18 мин при 45°С. Смесь разводили в 1 мл среды YPD и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Клетки высевали на чашки Петри со средой YNB-D и инкубировали несколько дней до появления колоний трансформантов. Клетки выросших трансформантов рассевали истощающим штрихом на свежих чашках с YNB-D и после двух дней инкубации при 37°С отбирали быстрорастущие колонии.
[21]Отобранные клоны проверяли на способность синтезировать белок LI HPV при росте клеток на среде, содержащей метанол. Один из трансформантов с наибольшей продуктивностью был обозначен КБТ-09/рНР-161.
[22]Пример 4. Культивирование и выделение рекомбинантного белка HPV16-L1 из клеток Н. polymorpha.
[23]Ферментацию штамма-продуцента дрожжей Н. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона и 4% глицерина. Когда сырая биомасса достигала плотности 150 г/л (примерно через 28-32 часа ферментации), добавляли индуктор до концентрации 0.5-0.8% и поддерживали на этом уровне в течение 48-72 часов.
[24]После ферментации штамма-продуцента белок HPV16-L1 выделяли согласно опубликованной методике [Kim H.J. et al., Protein Expression and Purification, v.70, p.68-74, 2010] с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 15 минут при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до концентрации 380 г влажных клеток на литр суспензии в буфере для экстракции: PBS (рН 7.2) с добавлением 1.7 mM EDTA, 2 mM PMSF, 0.01% Tween-80. Далее клетки разрушали в мельнице Dyno-Mill типа KDL, используя стеклянные шары диаметром 0,5-0,7 мм. Для удаления основной массы нецелевых белков и выделения антигена полученный экстракт насыщали сульфатом аммония до 45% насыщения и осажденные белки отделяли центрифугированием при 12000g в течение 10 минут. Осадок разводили в минимальном объеме буфера PBS (рН 7.2) + 0.01% Tween-80 и диализовали в этот же буфер в течение 24 часов при комнатной температуре для осаждения части оставшихся примесных белков, которые затем отделяли центрифугированием при 12000g в течение 10 минут. Полученный супернатант диализовали в буфер для связывания: PBS (рН 7.0), содержащий 0.33 М NaCl и 0.01% Tween-80 с последующей адсорбцией на сорбент Heparin Sepharose CL-6B (GE Healthcare, USA). После промывки сорбента тем же буфером для связывания белок HPV16-L1 элюировали линейным градиентом от 0.33 до 1.5 М NaCl. Объединенные фракции, содержащие антиген (по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией (500 KDa) и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте глицерин/сахароза. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65 (ToyoSoda Corp., Japan). Чистоту полученного таким образом рекомбинантного белка HPV-L1 определяли методом электрофореза. Если чистота белка была недостаточна (менее 95%), производили дополнительную очистку при помощи катионобменной хроматографии на сорбенте Toyopearl SP-650C. Выход целевого белка составлял не менее 50 мг с 1 л культуральной жидкости.
[25]Пример 5. Анализ рекомбинантного HPV16-L1.
[26]1. Чистота рекомбинантного HPV-L1 определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания серебром и Coomassie Brilliant Blue R-250. Чистота выделенного рекомбинантного белка HPV-L1 составляет не менее 95%.
[27]2. Иммуноспецифичность рекомбинантного HPV16-L1 определяют методом иммуноблотинга. Первичными моноклональными антителами к белку HPV-L1 серотипа 16 (Camvir-1, AbCam, UK) окрашивают иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген HPV16-L1 представлен в виде полосы мономера белка размером 55-60 кДа.
[28]Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой.
[29]Хранение - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.
[30]Генетические особенности: Фаги у дрожжей не обнаружены. Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным.
[31]Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.
[32]Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5,0-5,5 в питательной среде, содержащей до 4% глицерина.
[33]Способ определения активности: в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноблотинга или иммуноферментного анализа. Активность штамма - не менее 50 мг/л культуральной жидкости.
[34]Выделенный белок L1 HPV типа 16 может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека.
[35]
