[1]Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к способу кормления сельскохозяйственной птицы, способствующему активизации иммунного ответа организма выраженного в увеличении экспрессии генов бета-дефензинов.
[2]Дефензины - катионные пептиды иммунной системы, активные в отношении бактерий, грибков и многих оболочечных и без-оболочечных вирусов. Иммунные клетки используют дефензины для уничтожения бактерий, поглощенных при фагоцитозе. Дефензины позвоночных подразделяются на альфа и бета-дефензины по различию в паттерне дисульфидных связей. У птиц содержатся бета-дефензины (галлинацины), которые играют жизненно важную роль во врожденном иммунном ответе на бактериальные инфекции. Экспрессия β-дефензинов индуцируется под действием провоспалительных цитокинов и различными микроорганизмами. β-дефензин является неотъемлемой частью врожденной иммунной системы и благодаря своему антибактериальному действию способствует барьерной функции эпителиальных клеток кишечника.
[3]Изобретение относится к сельскому хозяйству и биохимии, а также может быть использовано в птицеводстве при кормлении птицы.
[5]Цель изобретения - разработка высокоэффективного способа кормления птицы, позволяющего одновременно с увеличением зоотехнических показателей, оценить иммунный ответ организма посредством увеличения экспрессии генов бета-дефензинов.
[6]Разработан оригинальный способ кормления сельскохозяйственной птицы включающий компоненты из смеси растительных масел с высокой фитобиотической активностью. Смесь масел дают с кормом один раз в день в течение всего периода выращивания птицы. Смесь эфирных масел состоит из эвкалипта, чеснока и лимона при соотношении 1:3:1, нанесенных на отруби пшеничные и высушенных с получением сухого концентрата в виде порошка. Все компоненты взяты в определённых количествах и вводится в состав корма в количестве 20 г/тонну.
[7]Способ кормления сельскохозяйственной птицы с вводом в рацион смеси масел обеспечивает увеличение прироста массы птицы, а также оказывает иммуномодулирующее и антимикробное действие, вызывает иммунный ответ организма, выраженный в усилении экспрессии бета-дефензинов, выявляемой при помощи метода ПЦР в реальном времени.
[8]В основу настоящего изобретения положено решение задачи усиления иммунного ответа организма при одновременном повышении зоотехнических показателей сельскохозяйственной птицы. Иммунный ответ организма обнаруживается молекулярно-генетическими методами - увеличением экспрессии цитокинов и генов бета-дефензинов. Инициирование заявленных молекулярно-генетических и биохимических процессов происходит вследствие воздействия на макроорганизм посредством введения в пищу разработанной кормовой смеси.
[9]Выявление влияния на увеличение экспрессии генов бета-дефензинов у сельскохозяйственной птицы при скармливании смеси эфирных масел эвкалипта, чеснока и лимона, также обладающих иммуномодулирующим действием, позволяет получить новый способ стимулирования иммунного ответа через коррекцию рационов птицы, выраженный в биохимических процессах связанных с иммунитетом.
[10]Известны другие способы кормления и методы увеличения экспрессии дефензинов в организме животных и человека, но заявителю не известны какие-либо публикации или патенты, которые содержали бы сведения об одновременном влиянии смеси растительных масел, как на повышение зоотехнических показателей сельскохозяйственной птицы, так и на четко выраженный иммунный ответ организма - увеличении экспрессии генов бета-дефензинов.
[11]Известна кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы, содержащая биологически активные вещества, в качестве которых используется вытяжка из растений: женьшеня, крапивы двудомной и других подобных растений, способствующих восстановлению репродуктивной функции организма сельскохозяйственных птиц, RU №2202223 С2, А23К 1/16, А23К 1/175, 20.04.2003.
[12]Известна кормовая добавка, содержащая биологически активное вещество - экстракты хвойной зелени, RU №2304397 C1, А23К 1/00, А23К 1/12, А23К 1/14, А23К 1/16, 20.08.2007.
[13]Известно средство для профилактики колибактериоза птиц, содержащее биологически активное вещество, включающее растительные экстракты из листьев облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides L.), и/или экстракт травы маклейи сердцевидной (Macleaya cordata Will L.) или маклейи мелкоплодной (М. microcarpas), и/или экстракт расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), и/или экстракт корней и травы эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea L.), RU №2355410 C2, A61K 36/00, 20.05.2009.
[14]Известен препарат для повышения жизнеспособности цыплят, представляющий собой водно-аммиачную вытяжку из смеси растительных компонентов, содержащую почки березовые, цветки бессмертника, лепестки календулы, траву золототысячника зонтичного, крапиву двудомную, зверобой продырявленный, цветки липы мелколистной, листья мать-и-мачехи, одуванчик лекарственный, подорожник большой, пустырник сердечный, почки сосновые, плоды фенхеля, чабрец обыкновенный, череду трехраздельную, сушеницу лесную и ламинарию, корень элеутерококка колючего, расторопшу, цветки пижмы, кукурузные рыльца и плоды кориандра, RU №2428998 C1, А61К 36/00, 20.09.2011.
[15]Все представленные способы кормления и кормовые добавки для сельскохозяйственной птицы способствуют увеличению зоотехнических показателей и иммунитета, однако, в данном изобретении впервые появляется новое свойство, а именно увеличение экспрессии генов бета-дефензинов при скармливании данной смеси растительных масел в установленном соотношении.
[16]Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».
[17]Способ кормления может быть полезным как в сельскохозяйственном производстве птицы для увеличения важных зоотехнических показателей, таких как продуктивность и сохранность поголовья.
[18]Способ кормления может быть полезным для молекулярно-генетических исследований при оценке иммунного ответа, связанного с увеличением экспрессии генов бета-дефензинов: Gal-9, Gal-10, Gal-11 у сельскохозяйственной птицы.
[19]Смесь эфирных масел используют в составе корма для сельскохозяйственных животных и птицы.
[20]Исследования по использованию смеси эфирных масел в предложенных соотношениях представлены в примере.
[21]Экспериментальная часть исследования проходила в условиях вивария ВНИВИП, где был поставлен опыт по выращиванию цыплят с применением смеси эфирных масел. Также был проведен анализ действия сухого концентрата смеси эфирных масел при заражении птицы эпизоотическим штаммом Salmonella enteritidis, так как по данным Россельхознадзора сальмонеллез является одной из наиболее частых инфекционных болезней в птицеводстве (Петрова, 2011).
[22]Для исследования были созданы условия выращивания, вакцинации и кормления птицы, максимально приближенные к производственным. Исследуемая птица - цыплята кросса Росс-308 в количестве 180 голов содержали с 1-го дня до 42-дневного возраста с разделением на группы-аналоги:
[24]2. сухой концентрат смеси эфирных масел.
[25]В дальнейшем, после заражения части поголовья, птица была дополнительно разделена на следующие группы:
[27]2. контроль + заражение S. enteritidis;
[28]3. сухой концентрат смеси эфирных масел;
[29]4. сухой концентрат смеси эфирных масел + заражение S. enteritidis.
[30]Вся птица в суточном возрасте была вакцинирована подкожно в верхнюю треть вакциной от болезни Гамборо. Дачу сухого концентрата смеси эфирных масел эфирных масел начали проводить с первого дня по 20 г/тонну корма.
[31]В возрасте 19 дней было проведено заражение части поголовья эпизоотическим штаммом Salmonella enteritidis в количестве 500 млн КОЕ внутримышечно в грудную мышцу, после чего было произведено дальнейшее разделение на группы по заражению.
[32]Раз в неделю проводили поголовное взвешивание цыплят и отбор проб на дальнейший анализ экспрессии геном - бета-дефензинов.
[33]Отбор образцов осуществляли при условии строгого соблюдения стерильности.
[34]Подготовка образцов осуществлялась согласно требованиям «Инструкции по санитарно-микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и перерабатывающих предприятиях».
[35]Молекулярно-генетические исследования проводили в соответствии с протоколами, разработанными в ходе 1 года выполнения проекта в рамках гранта №14. W03.31.0013 от 20 февраля 2017 г.
[36]Лабораторное исследование проб проводили в компании ООО «БИОТРОФ+», где создана лаборатория молекулярно-генетических исследований, включающих применение комплекса методик на основе молекулярно-генетических подходов, позволяющих максимально полно и точно определить состав микрофлоры кишечника сельскохозяйственных животных.
[37]Был проведен анализ экспрессии генов, ответственных за иммунный ответ - бета-дефензинов (табл. 1). Исследование было проведено экспрессии генов в эксперименте, проведенном на цыплятах зараженных Salmonella ssp., и получавших дополнительно к основному рациону сухой концентрат смеси эфирных масел, через сутки после заражения (19-суточные цыплята). Было проведено выделение РНК из стенок слепых отростков цыплят, проведена реакция обратной транскрипции и получена кДНК. Затем, был проведен анализ экспрессии генов при помощи метода ПЦР в реальном времени. В качестве рефферентного гена был выбран ген бета-актина. Анализ экспрессии генов позволяет обнаружить, какие гены активируются в ответ на то или иное воздействие на макроорганизм. Анализ экспрессии генов был проведен при помощи метода ПЦР в реальном времени. Расчет относительной экспрессии был произведен при помощи метода 2 -ΔΔCt [delta delta Ct] (Livak, Schmittgen, 2001).
[38]
[39]В результате исследования выявлена значительная разница в уровне экспрессии бета-дефензинов, а также в приросте массы исследованных птиц.
[40]Усреднённые данные в динамике по группам представлены в таблице 2.
[41]Если в начале постановки эксперимента вся птица была примерно одного веса, то уже через две недели прослеживается сильная разница в приросте массы. Так, цыплята контрольной группы имели средний вес 322 г, в то время как группа, получающая сухой концентрат смеси эфирных масел - 360 г. К концу постановки опыта наилучший весовой показатель среди незараженной птицы был у группы, получавшей сухой концентрат смеси эфирных масел, со средним весом 2403 г, против 2294 г у контрольной группы.
[42]Среди птицы, заражённой вирулентным штаммом S. enteritidis, весовой результат у групп, получавшей и не получавшей сухой концентрат смеси эфирных масел статистически не различался.
[43]
[44]Пробы для анализа экспрессии генов отбирались у птицы через сутки после заражения (20 день опыта). Отбирались пробы у следующих групп: контроль, контроль + S. enteritidis, сухой концентрат смеси эфирных масел и сухой концентрат смеси эфирных масел +S. enteritidis.
[45]Результаты оценки экспрессии генов представлены в таблицах 3 и 4.
[46]В целом заражение сальмонеллой способствовало увеличению уровня экспрессии бета-дефензинов по отношению к контролю через сутки после заражения. При этом установлено значительное усиление экспрессии бета-дефензинов у птицы в результате применения сухого концентрата смеси эфирных масел, как на фоне заражения, так и без заражения сальмонеллой.
[47]Так, наименьшая экспрессия бета-дефензина 10 наблюдалась у птиц контрольной группы. Экспрессия гена бета-дефензина 10 выросла в 1,84 раза после заражения сальмонеллой. Введение сухого концентрата смеси эфирных масел в рацион цыплят привело к увеличению экспрессии бета-дефензина в 17,51 раза без заражения сальмонеллой и к увеличению в 2,1 раза при заражении сальмонеллой.
[48]Уровень экспрессии бета-дефензинов 9 и 11 увеличивался в результате заражения птицы сальмонеллой в 1,19 и 0,72 раза соответственно. В результате применения сухого концентрата смеси эфирных масел отмечено усиление экспрессии бета-дефензинов 9 и 11 в 1,57 и 1,70 раз соответственно на фоне заражения, а без заражения - в 1,46 и 1,29 раз соответственно.
[49]Это может говорить об иммуномодулирующих свойствах добавки. Вероятно, высокий уровень экспрессии в группе, в рацион которой был введен сухой концентрат смеси эфирных масел (без заражения), свидетельствует о более высоком уровне активации врожденного иммунитета.
[50]Ранее было показано увеличение экспрессии галлинацина 3 и галлинацина 6 у птиц при заражении рядом патогенов (Zhao et al., 2001; van Dijk et al., 2007). Об увеличении количества цитокинов и иммунных белков, таких как IL1β, IL6, IL8, IL12, IL17, IL18, IL22, IL23, IFNγ, LITAF после заражения цыплят сальмонеллой неоднократно сообщалось во многих исследованиях (Berndt et al, 2007; Crhanova et al., 2011). Данные, полученные рядом исследователей в значительной степени подтверждают роль галлинацинов в качестве защитных молекул против кишечных патогенов (Hasenstein & Lamont, 2007; Mukhopadhyay et al., 2010). Некоторые исследователи предлагают использовать галлинацин в качестве потенциального маркера против грамотрицательной инфекции (Mukhopadhyay et al., 2010).
[51]Таким образом, на фоне применения сухого концентрата смеси эфирных масел отмечена более высокая активность данных генов, связанных с иммунитетом, что свидетельствует о более быстром развитии иммунной реакции в ответ на заражение сальмонеллой.
[52]Анализ экспрессии генов через три недели после заражения (42 суточная птица) показал тенденцию к снижению уровня экспрессии генов, связанных с иммунитетом. При этом на фоне заражения отмечена более высокая активность генов.
[53]Применение сухого концентрата смеси эфирных масел в среднем способствовало более низкому уровню экспрессии генов по сравнению с контролем в это время при заражении сальмонеллой и без нее. Это может свидетельствовать о более раннем затухании воспалительной реакции и восстановлении здоровья зараженной птицы.
[54]
[55]
[56]Примечание: при р≤0.05 по отношению к контрольной группе
[57]
[58]Примечание: при р≤0.05 по отношению к контрольной группе
