[1]Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования риска раннего развития профессиональной бронхиальной астмы при воздействии на организм вредных производственных факторов сенсибилизирующего и раздражающего действия.
[2]Известен способ прогнозирования риска развития профессиональной бронхиальной астмы, включающий забор венозной крови (см. Патент РФ №2583948, МКИ G01N 33/48, А61В 5/00, 03.12.2014).
[3]Однако данный способ осуществляет прогнозирование риска развития профессиональной бронхиальной астмы на стадии преморбидных изменений, что не позволяет применять его для определения риска развития профессиональной бронхиальной астмы при предварительном медицинском осмотре. Кроме того, используя этот способ, прогнозируют риск развития профессиональной бронхиальной астмы только аллергической формы, не учитывая воздействие химических веществ раздражающего и токсического действия в процессе контакта с ними, что не позволяет прогнозировать риск развития профессиональной бронхиальной астмы неаллергической и смешанной формы.
[4]Задачей настоящего изобретения является прогнозирование риска развития профессиональной бронхиальной астмы у работника в течение 5-ти лет от начала работы с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия при предварительном медицинском осмотре.
[5]Техническим результатом изобретения является возможность своевременного выявления лиц предрасположенных к развитию профессиональной бронхиальной астмы для предупреждения развития профессиональной патологии путем рационального трудоустройства вне контакта с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия, проведения своевременной коррекции и повышения адаптационных способностей организма различными неспецифическими способами.
[6]Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования риска развития профессиональной бронхиальной астмы, включающем забор венозной крови, дополнительно осуществляют определение в сыворотке крови уровня эозинофильного катионного протеина (ЭКП), выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами, амплификацию последовательности в промоторной области гена супероксиддисмутазы MnSOD Т-58С и гена эпоксидгидролазы ЕРНХ1 Tyr-113His, и при одновременном обнаружении неблагоприятной аллели С гена MnSOD Т-58С и неблагоприятной аллели С гена ЕРНХ1 Tyr-113His и уровня ЭКП выше 10 мкг/л прогнозируют риск развития профессиональной бронхиальной астмы у работника в течение 5-ти лет от начала работы с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия.
[7]Супероксиддисмутаза марганец зависимая (СОД 2, SOD2 Mn, митхондриальная) относится к группе антиоксидантных ферментов и контролирует уровень свободных радикалов в клетке. Гены СОД 2 локализуются на 6 хромосоме (6q25). Наличие неблагоприятной аллели С гена MnSOD Т-58С приводит к замене аминокислоты валин (Val) на аланин (Ala), что изменяет вторичную структуру белка, затрудняет транспорт фермента в митохондрии и формирование активного тетрамера MnSOD в митохондриальном матриксе. MnSOD катализирует реакцию дисмутации супероксидного радикала аниона (O2-) в перекись водорода, которая затем преобразуется в безвредные O2 и Н2O под действием глутатионпероксидазы и каталазы. MnSOD играет важную роль в дифференцировке клеток и онкогенезе, в механизме защиты при легочной токсичности, индуцированной гипероксией. Наличие неблагоприятной аллели С гена MnSOD Т-58С является фактором риска раннего развития и тяжелого течения профессиональной бронхиальной астмы в связи с понижением экспрессии гена MnSOD, что приводит снижению уровня MnSOD, обладающей протективными свойствами.
[8]Микросомальная эпоксидгидролаза 1 (ЕРНХ1) фермент второй фазы детоксикации инактивирует реактивные промежуточные метаболиты. Полиморфный вариант гена ЕРНХ1 Т-337С приводит к аминокислотным заменам тирозина на гистидин в 113 положении (Tyr-113His), что изменяет свойства фермента и приводит к снижению его активности на 50% - «медленный» аллель и уменьшает его способность к гидроксилированию ксенобиотиков, в результате чего снижается эффективность инактивации токсических метаболитов, что ведет к развитию «оксидативного стресса», сущность которого заключается в выделении большого, значительно превышающего физиологические потребности, количества свободных радикалов, обладающих мощным повреждающим действием. «Медленный» аллель данного фермента уменьшает его способность к гидроксилированию ксенобиотиков. Наличие неблагоприятной аллели С гена ЕРНХ1 Т-337С является фактором риска раннего развития и тяжелого течения профессиональной бронхиальной астмы в связи со снижением активности микросомальной эпоксидгидролазы 1, что приводит к накоплению промежуточных токсичных метаболитов, которые приводят к усилению токсического действия химических веществ.
[9]Эозинофильный катионный протеин (ЭКП) - это один из основных медиаторов эозинофилов, высвобождаемый из их гранул в ответ на взаимодействие аллергена и IgE-иммуноглобулина. ЭКП является объективным маркером активации эозинофилов. Он составляет 70% от всех белков, продуцируемых эозинофилами, стимулирует секрецию слизи, тормозит пролиферацию Т-лимфоцитов, действует на свертываемость крови, обладает цитотоксичностью. Цитотоксичность ЭКП продемонстрирована в отношении эпителиальных, тучных, гладкомышечных клеток и фибробластов. Уровень ЭКП в плазме крови значительно возрастает при развитии аллергического ответа на попадание в организм аллергена.
[10]Таким образом, одновременное наличие неблагоприятной аллели С гена MnSOD Т-58С, неблагоприятной аллели С гена ЕРНХ1 Т-337С и уровня ЭКП выше 10 мкг/л позволяет прогнозировать риск раннего развития профессиональной бронхиальной астмы при воздействии вредных производственных факторов сенсибилизирующего и раздражающего действия в связи с одновременным нарушением функционирования систем антиоксидантной защиты и детоксикации химических веществ и повышенной активацией эозинофилов, что приводит к усилению токсического воздействия вредных производственных факторов сенсибилизирующего и раздражающего действия и активации воспалительного процесса в дыхательных путях.
[11]Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".
[12]Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.
[13]Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.
[14]Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
[15]У пациентов осуществляют забор венозной крови.
[16]В сыворотке венозной крови осуществляют определение уровня эозинофильного катионного протеина (ЭКП).
[17]Определение уровня ЭКП в сыворотке венозной крови у пациента проводят методом твердофазного двухциклового хемилюминисцентного иммунометрического анализа с использованием наборов, например, SIEMENS IMMULITE 2000 (Великобритания) при использовании автоматического анализатора IMMULITE 2000 (SIEMENS, Великобритания) в соответствии с инструкцией к используемому набору.
[18]Далее из цельной крови выделяют ДНК с использованием, например, комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "Ампли Прайм ДНК-сорб-В" в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
[19]Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК используют для постановки полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.
[20]Выявление полиморфизма Т-58С гена MnSOD проводят с помощью наборов, например, НПФ «Литех», Россия. При этом используют набор реагентов "SNP-экспресс-shot''- PB: разбавитель, реакционная смесь, Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.
[21]Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма Т-58С гена MnSOD проводят по следующей программе.
[22]При использовании амплификатора «CFX 96» (BioRad, США) выдерживают пробирки при +94°С - 3 мин, затем 40 циклов: при 94°С - 15 с, при 64°С - 40 с. При этом используют каналы FAM и HEX. Детекция продуктов амплификации осуществляют на каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM - для аллели Val, по каналу HEX - для аллели Ala.
[23]Выявление полиморфизма Tyr-113His гена ЕРНХ1 проводят с помощью наборов, например, НПФ «Литех», Россия. При этом используют набор реагентов "SNP-экспресс": разбавитель, реакционная смесь, Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.
[24]Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма Tyr-113His гена ЕРНХ1 проводят по следующей программе.
[25]При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (BioRad, США) выдерживают пробирки при +93°С - 1 мин, затем 35 циклов: при 93°С - 10 с, при 64°С - 10 с, при 72°С - 20 с, а в конце при 72°С - 1 мин. После проведения амплификации осуществляют анализ продуктов реакции в 3% агарозном геле с окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем УФ-свете.
[26]При обнаружении одновременного наличия неблагоприятной аллели С гена супероксиддисмутазы, неблагоприятной аллели С гена эпоксидгидроксилазы и уровня ЭКП выше 10 мкг/л прогнозируют развитие профессиональной бронхиальной астмы менее чем через 5 лет от начала работы в контакте с производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия.
[27]Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществить прогнозирование риска раннего развития профессиональной бронхиальной астмы у работника в течение 5-ти лет от начала работы с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия в процессе проведения предварительного медицинского осмотра при поступлении его на работу. Это позволит своевременно выявлять лиц, предрасположенных к развитию профессиональной бронхиальной астмы, с целью предупреждения развития профессиональной патологии путем рационального трудоустройства вне контакта с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия, а также проведения своевременной коррекции и повышения адаптационных способностей организма различными неспецифическими способами.
[28]Кроме того, предлагаемый способ позволяет повысить воспроизводимость и скорость проведения прогнозирования риска раннего развития профессиональной бронхиальной астмы при воздействии на организм вредных производственных факторов сенсибилизирующего и раздражающего действия, что, в свою очередь, позволит повысить достоверность прогнозирования риска раннего развития профессиональной бронхиальной астмы, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и\или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
[29]Пример 1. Пациентка Б., 47 лет.
[30]При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента, было выявлено, что пациентка Б. работала на заводе железобетонных изделий в течение 5 лет, подвергаясь воздействию пыли цемента, в состав которой входят хром, никель, кобальт. Через 4 года работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональная бронхиальная астма.
[31]В процессе медицинского осмотра у пациентки Б. осуществили забор венозной крови.
[32]Кровь исследовали заявленным способом.
[33]Определение уровня ЭКП в сыворотке крови проводили методом твердофазного двухциклового хемилюминисцентного иммунометрического анализа с использованием наборов SIEMENS IMMULITE 2000 (Великобритания) при использовании автоматического анализатора IMMULITE 2000 (SIEMENS, Великобритания) в соответствии с инструкцией к используемому набору.
[34]Далее из цельной крови выделили ДНК с использованием, например, комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "Ампли Прайм ДНК-сорб-В" в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
[35]Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.
[36]Выявление полиморфизма Т-58С гена MnSOD проводили с помощью наборов НПФ «Литех», Россия. При этом использовали набор реагентов "SNP-экспресс-shot" - РВ: разбавитель, реакционная смесь, Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.
[37]Полимеразную цепную реакцию выявления полиморфизма Т-58С гена MnSOD проводили по следующей программе.
[38]При использовании амплификатора «CFX 96» (BioRad, США) выдерживали пробирки при +94°С - 3 мин, затем 40 циклов: при 94°С - 15 с, при 64°С - 40 с. При этом использовали каналы FAM и HEX. Детекция продуктов амплификации осуществлялась на каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа построила кривые накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM - для аллели Val, по каналу HEX - для аллели Ala.
[39]Выявление полиморфизма Tyr-113His гена ЕРНХ1 проводили с помощью наборов НПФ «Литех», Россия. При этом использовали набор реагентов "SNP-экспресс": разбавитель, реакционная смесь, Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.
[40]Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма Tyr-113His гена ЕРНХ1 проводили по следующей программе.
[41]При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (BioRad, США) выдерживали пробирки при +93°С - 1 мин, затем 35 циклов: при 93°С - 10 с, при 64°С - 10 с, при 72°С - 20 с, а в конце при 72°С - 1 мин. После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3% агарозном геле с окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем УФ-свете.
[42]При анализе результатов были выявлены неблагоприятная аллель С гена супероксиддисмутазы, неблагоприятная аллель С гена эпоксидгидроксилазы и уровень ЭКП - 15 мкг/л.
[43]Вывод: у пациентки В. были выявлены неблагоприятная аллель С гена супероксиддисмутазы, неблагоприятная аллель С гена эпоксидгидроксилазы и уровень ЭКП - 15 мкг/л, что свидетельствует нарушении функционирования систем антиоксидантной защиты и детоксикации химических веществ и повышенной активацией эозинофилов. Это привело к усилению токсического воздействия вредных производственных факторов сенсибилизирующего и раздражающего действия, следствием чего явилось ранее развитие профессиональной бронхиальной астмы (через 4 года от начала работы).
[44]Пример 2. Пациентка С, 54 года.
[45]При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациентки С, было выявлено, что она работала на ОАО «Залесье-Сервис» ровничницей, оператором ленточного оборудования в контакте с аэрозолем хлопка, капрона, формальдегидом, ацетальдегидом без превышения ПДК в течение 30 лет. В течение этих 30 лет работы по результатам проводимых обследований не было выявлено признаков профессиональная бронхиальная астма
[46]Кровь пациентки С. исследовали заявленным способом.
[47]У пациентки С. осуществили забор венозной крови.
[48]Определение уровня ЭКП в сыворотке крови проводили методом твердофазного двухциклового хемилюминисцентного иммунометрического анализа с использованием наборов SIEMENS IMMULITE 2000 (Великобритания) при использовании автоматического анализатора IMMULITE 2000 (SIEMENS, Великобритания) в соответствии с инструкцией к используемому набору.
[49]Далее из цельной крови выделили ДНК с использованием например, комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "Ампли Прайм ДНК-сорб-В" в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.
[50]Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации (1÷3) нг/мкл. Данный раствор ДНК использовали для постановки полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами.
[51]Выявление полиморфизма Т-58С гена MnSOD проводили с помощью наборов НПФ «Литех», Россия. При этом использовали набор реагентов "SNP-экспресс-shot" - РВ: разбавитель, реакционная смесь, Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.
[52]Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма Т-58С гена MnSOD проводили по следующей программе.
[53]При использовании амплификатора «CFX 96» (BioRad, США) выдерживали пробирки при +94°С - 3 мин, затем 40 циклов: при 94°С - 15 с, при 64°С - 40 с. При этом использовали каналы FAM и HEX. Детекция продуктов амплификации осуществлялась на каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа построила кривые накопления флуоресцентного сигнала: по каналу FAM - для аллели Val, по каналу HEX - для аллели Ala.
[54]Выявление полиморфизма Tyr-113His гена ЕРНХ1 проводили с помощью наборов НПФ «Литех», Россия. При этом использовали набор реагентов "SNP-экспресс": разбавитель, реакционная смесь, Taq-полимераза. Объем амплификационной смеси - 25 мкл.
[55]Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма Tyr-113 His гена ЕРНХ1 проводили по следующей программе.
[56]При использовании термоциклера Т 100 Thermal Cycler (BioRad, США) выдерживали пробирки при +93°С - 1 мин, затем 35 циклов: при 93°С - 10 с, при 64°С - 10 с, при 72°С - 20 с, а в конце при 72°С - 1 мин. После проведения амплификации осуществляли анализ продуктов реакции в 3% агарозном геле с окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем УФ-свете.
[57]При анализе результатов было выявлено отсутствие неблагоприятной аллели С гена супероксиддисмутазы, отсутствие неблагоприятной аллели С гена эпоксидгидроксилазы и уровень ЭКП - 7 мкг/л.
[58]Вывод: у пациентки С. было выявлено отсутствие неблагоприятной аллели С гена супероксиддисмутазы, отсутствие неблагоприятной аллели С гена эпоксидгидроксилазы и уровень ЭКП - 7 мкг/л, что свидетельствует о нормальном функционировании систем антиоксидантной защиты и детоксикации химических веществ и нормальной функции эозинофилов, следствием чего явилось отсутствие развития профессиональной бронхиальной астмы через 30 лет от начала работы с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия.
[59]Таким образом, предложенная совокупность приемов прогнозирования риска раннего развития профессиональной бронхиальной астмы может быть использована в процессе предварительных или периодических медицинских осмотров большого количества работающих или поступающих на работу с вредными производственными факторами сенсибилизирующего и раздражающего действия.
[60]Предлагаемый способ может быть использован в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
