[1]Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для получения биополимеров из кератинсодержащего сырья.
[2]На современном этапе развития промышленности биоконверсия возобновляемого сырья становится все более актуальной задачей. При эффективном использовании методов биоконверсии становится возможным производство новых продуктов с добавленной стоимостью из малоценных сырьевых ресурсов. Анализ мирового рынка биотехнологий показывает низкий уровень развития высокоэффективных технологий переработки отходов различного происхождения. В первую очередь это касается отходов животноводческой отрасли агропромышленного комплекса, основная масса которых подвергается захоронению на свалках. Например, существующие технологии переработки кератинсодержащих отходов (шерсть, перо, рога, копыта и т.д.) являются ресурсо- и энергозатратными, а получаемые кормовые добавки - продуктами с очень низкой добавочной стоимостью.
[3]Все больший интерес во всем мире вызывает создание и исследование биополимеров, что связано с ухудшением экологической обстановки. Одним из основных достоинств данных материалов является возможность биодеградации. Биополимеры могут быть использованы при создании различных упаковок, для нужд агропромышленного комплекса и т.д. Однако наиболее перспективным направлением их использования являются различные области медицины, в том числе создание систем доставки лекарств.
[4]Задачей изобретения является разработка нового способа биосинтетической и биокаталитической конверсии возобновляемого сырья в полезные продукты с высокой добавленной стоимостью, а именно биополимеры, которые могут быть внедрены в различных отраслях медицины: стоматологии, пластической хирургии и т.д.
[5]В качестве исходного материала для получения биополимеров используют белковые гидролизаты кератинсодержащего сырья.
[6]Белковые гидролизаты кератинсодержащего сырья, например пера, получают путем гидротермической обработки в соответствии со следующими технологическими параметрами гидротермического гидролиза:
[7]- исходная влажность пера - 55%;
[8]- температура нагрева - 190-200°С;
[9]- продолжительность нагрева - 90 сек.
[10]Далее проводится ферментативный гидролиз при температуре 55°С и начальном значении рН реакционной среды 7,2, что соответствует рН- и термооптимумам ферментного препарата Novo-Pro D. Реакционная среда содержала 0,5% сульфита натрия в качестве компонента для расщепления дисульфидных связей в молекуле кератина. Полученный гидролизат представляет собой белково-пептидную смесь.
[11]Для получения биополимеров могут быть использованы коммерчески доступные белковые гидролизаты, такие как Nutrilan keratin W (Cognis), Keratek Pep (Croda) и др.
[12]Одним из основных критериев для выбора белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья для получения биополимеров является молекулярно-массовое распределение белково-пептидной фракции, представленное в таблице 1.
[13]| Таблица 1 |
| Молекулярно-массовое распределение белково-пептидной фракции белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья |
| Относительное содержание фракций с |
| соответствующими диапазонами молекулярных масс, % |
| >10кДа | 3-10 кДа | <3 кДа |
| 6 - 7 | 57 - 59 | 34 - 36 |
[14]Преобладающими в составе ферментативных гидролизатов кератинсодержащего сырья являются компоненты с молекулярной массой 3-10 кДа. Их относительная доля составляет 57,6-58,5%. Содержание низкомолекулярных компонентов (М.в. <3 кДа) варьирует в пределах 34,3-36,3%, высокомолекулярных белковых компонентов (М.в. >10 кДа) - 6,1-7,3%. Следует отметить высокую воспроизводимость молекулярно-массового распределения ферментативных гидролизатов кератинсодержащего сырья.
[15]Помимо биодоступности степень гидролиза кератинового сырья определяет растворимость получаемых гидролизатов и их совместимость с различными матрицами. Гидролизаты кератина со средневесовой молекулярной массой менее 4 кДа, как правило, хорошо растворимы в воде в широком диапазоне рН, водно-спиртовых смесях, глицерине и совместимы с различными ПАВ. Гидролизаты кератина с более высокой средневесовой молекулярной массой характеризуются меньшей растворимостью, особенно в присутствии в среде органических растворителей.
[16]Еще одним критерием выбора белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья для получения биополимеров является характеристика их аминокислотного состава.
[17]При характеристике аминокислотного состава гидролизатов кератинсодержащего сырья определяют содержание свободных и общих аминокислот. Общее содержание аминокислот (за исключением триптофана, цистина и метионина) определяют с использованием аминокислотного анализатора после предварительного кислотного гидролиза в стандартных условиях. Метионин и цистин определяют в форме метионин-сульфона и цистеиновой кислоты с использованием предварительной окислительной обработки реакционной смеси надмуравьиной кислотой и последующего кислотного гидролиза. Содержание триптофана определяют спектрофотометрическим методом (см. Fletouris, D.J., Botsoglou, N.A., Papageorgiou, G.E., Mantis, A.J. Rapid-Determination of Tryptophan in Intact Proteins by Derivative Spectrophotometry // Journal of Aoac International - 1993.- V. 76.- N. 6.- P.1168-1173). Результаты анализа содержания свободных аминокислот в гидролизатах кератинсодержащего сырья представлены в таблице 2.
[18]Следует отметить, что содержание свободных аминокислот в гидролизатах кератинсодержащего сырья довольно невелико - 3,0-3,1 г/100 г белка (2,8-2,9%). Таким образом, основными компонентами низкомолекулярной фракции (М.в. <3 кДа) гидролизатов являются не свободные аминокислоты, а различные пептиды. Среди свободных аминокислот максимальным содержанием в гидролизатах характеризуются серин и лизин. На их долю суммарно приходится 2/3 от общего содержания свободных аминокислот в исследуемых гидролизатах кератинсодержащего сырья.
[19]| Таблица 2 |
| Содержание свободных аминокислот (г/100 г белка) в белковых гидролизатах кератинсодержащего сырья |
| Аминокислота | г/100 г белка |
| Глицин | 0,08 - 0,10 |
| Алании | 0,13 - 0,16 |
| Серин | 0,68 - 0,75 |
| Треонин | 0,07 - 0,08 |
| Цистин | 0,00 |
| Метионин | 0,01 |
| Аспарагин | 0,11 - 0,12 |
| Аспарагиновая кислота | 0,13 - 0,15 |
| Глутамин | 0,08 - 0,09 |
| Глутаминовая кислота | 0,11 - 0,12 |
| Пролин | 0,02 |
| Лизин | 1,26 - 1,36 |
| Аргинин | 0,03 - 0,04 |
| Гистидин | 0,01 |
| Валин | 0,02 - 0,03 |
| Изолейцин | 0,01 - 0,02 |
| Лейцин | 0,08 - 0,09 |
| Тирозин | 0,02 - 0,03 |
| Фенилаланин | 0,02 - 0,03 |
| Триптофан | 0,01 |
[20]Данные по общему содержанию аминокислот в белковых гидролизатах кератинсодержащего сырья приведены в таблице 3. Среди аминокислот наиболее высоким содержанием в исследуемых гидролизатах характеризуются глутаминовая кислота (15,1 - 15,3 г/100г белка), серин (14,3 - 14,4 г/100 г белка), аспарагиновая кислота (9,3-9,5 г/100 г белка), лейцин (8,5-8,6 г/100 г белка), пролин (7,4-7,7 г/100 г белка). Высокое содержание данных аминокислот, особенно серина, является характерной особенностью кератиновых белков.
[21]| Таблица 3 |
Содержание общих аминокислот (г/100 г белка) в
белковых гидролизатах кератинсодержащего сырья |
| Аминокислота | г/100 г белка |
| Глицин | 5,62 - 5,81 |
| Алании | 6,93 - 7,05 |
| Серин | 14,28 - 14,41 |
| Треонин | 5,21 - 5,31 |
| Цистин | 2,14 - 2,36 |
| Метионин | 0,32 - 0,39 |
| Аспарагиновая кислота | 9,34 - 9,48 |
| Глутаминовая кислота | 15,08 - 15,27 |
| Пролин | 7,39 - 7,72 |
| Лизин | 2,24 - 2,31 |
| Аргинин | 5,53 - 5,79 |
| Гистидин | 0,74 - 0,83 |
| Валин | 6,49 - 6,66 |
| Изолейцин | 5,98 - 6,00 |
| Лейцин | 8,48 - 8,59 |
| Тирозин | 2,20 - 2,37 |
| Фенилаланин | 5,12 - 5,37 |
| Триптофан | 0,63 - 0,71 |
[22]Установлено, что преобладающими в составе белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья являются компоненты с молекулярной массой 3 - 10 кДа, средняя молекулярная масса составляет 4,70-4,79 кДа. В составе белкового гидролизата кератинсодержащего сырья идентифицировано 119 различных пептидов, размером от 5 до 20 а.о. Предшественниками для 45% пептидов, идентифицированных в составе белкового гидролизата кератинсодержащего сырья, являются различные виды кератина, являющиеся ключевым белком пера птицы. Для остальных пептидов предшественниками являются белки, связанные с β-кератином, гистоновые белки, белки теплового шока, коллаген α-2(I), β-субъединица гемоглобина и ряд других.
[23]Основные характеристики гидролизата кератинсодержащего сырья приведены выше. В гидролизате содержатся свободные аминокислоты и полипептиды. В том числе, аминокислоты, которые могут участвовать в реакции, катализируемой лакказой.
[24]Лакказа (n-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) - фермент, катализирующий реакцию восстановления молекулярного кислорода до воды, минуя стадию образования перекиси водорода с сопутствующим окислением субстрата донора электронов. Лакказы относятся к классу медьсодержащих оксидаз наряду с такими ферментами, как аскорбатоксидаза, церулоплазмин, билирубин оксидаза и феноксазимсинтаза. Лакказа является ферментом, представляющим интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и с практической.
[25]Лакказы широко распространены в природе, что может объясняться разнообразием выполняемых ими физиологических функций. Наиболее изученной растительной лакказой является фермент, выделенный из лакового дерева Rhus vernicifera. Кроме него частично охарактеризованы лакказы из других растений: Rhus succedanea, Acer pseudoplatanus, Pinus taeda, Populus euramericana, Liriodendron tulipifera, Nicotiana tobacco и др.
[26]В животном царстве лакказы обнаружены в насекомых, таких как Bombyx, Calliphora, Diploptera, Drosophila, Lucilia, Manduca, Musca, Orycetes, Papilio, Phormia, Rhodnius, Sarcophaga, Schistocerca и Tenebrio.
[27]Большинство описанных в литературе лакказ выделены из высших грибов. Лакказы обнаружены в базидиомицетах, аскомицетах и дейтеромицетах, однако наиболее эффективными продуцентами лакказы являются представители базидиомицетов, относящихся к грибам возбудителям белой гнили древесины.
[28]В ходе реакции, катализируемой лакказой, происходит окисление донора электронов (в данном случае тирозина) и восстановление молекулярного кислорода до воды. Для восстановления одной молекулы кислорода требуется 4 электрона. Раствор гидролизата представляет собой смесь различных полипептидов и аминокислот, потенциально являющихся субстратами для лакказы, при этом детекция реакции оптическими методами (по изменению спектра) невозможна, поэтому реакцию детектировали амперометрически с использованием платинового электрода Кларка по потреблению растворенного молекулярного кислорода. Одним из важных преимуществ данной методики является возможность наблюдения за реакцией в режиме реального времени.
[29]Получение биополимеров
[30]Предварительно был определен диапазон концентраций гидролизата для проведения реакции. Считается, что субстратом для лакказы является аминокислотный остаток тирозина. Общее содержание тирозина в гидролизате 2,2 г на 100 г гидролизата, т.е. для получения раствора гидролизата с концентрацией тирозина 1 мМ нужно растворить 8,33 г сухого гидролизата в объеме 1 литр. Для окисления 1 мМ тирозина необходимо 0,25 мМ молекулярного кислорода, что практически совпадает с концентрацией кислорода в дистиллированной воде при температуре 25°С и нормальном атмосферном давлении.
[31]Для работы использовали гидролизат из пера птицы, который был получен в виде сухого порошка. Технологический процесс получения гидролизата и его характеристика в целом описаны выше. Растворы гидролизата готовили по навеске. Концентрация гидролизата указывается в виде концентраций аминокислотных остатков тирозина, так как именно они участвуют в реакции радикальной полимеризации. Эта концентрация практически совпадает с концентрацией пептидов в растворе, что следует из среднего содержания остатков тирозина на пептид. 5 г гидролизата на 100 мл раствора соответствует концентрации аминокислотных остатков тирозина [tyr] = 6 мМ.
[32]Для активации радикальных процессов полимеризации использовали высокоредокспотенциальную лакказу из Т. hirsuta. Данный ферментный препарат представляет собой раствор фермента в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе рН 6,0-7,0. Концентрация препарата фермента составляла 1,8-2,2 мг/мл. Концентрация фермента лакказы в реакционной среде во всех экспериментах составляла 1,5-3 мкг на 1 мл. Активность используемого препарата лакказы должна составлять не менее 1,2 - 1,5 мккат/мг белка (Катал (кат) - единица измерения активности катализатора в системе СИ. Если присутствие катализатора увеличивает скорость химической реакции на один моль в секунду, то активность данного количества данного катализатора равна одному каталу).
[33]Измерение активности лакказы проводили амперометрически по убыли кислорода при следующих условиях: 0,1 М Na-ацетатный буфер (рН=4,5), 25°С, [ABTS] = 500 мкМ, [O2] = 270 мкМ.
[34]Степень гомогенности ферментного препарата должна составлять не менее 95% (или 90%) электрофоретической чистоты.
[35]Для проведения полимеризации лакказу добавляют в количестве 5-10 мкг на 50 мл раствора белкового гидролизата (20-60%-ной концентрации по массе).
[36]Для получения биополимеров из белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья используют лакказу и сшивающий агент - водный раствор глутарового альдегида. Глутаровый альдегид представляет собой жидкость желтоватого цвета с характерным запахом и содержанием действующего вещества 25%. Глутаровый альдегид вносится в реакционную смесь в количестве 1,5, 10 или 20 масс.%.
[37]Получение растворов белкового гидролизата и обработка лакказой
[38]Белковый гидролизат растворяют в дистилированной водой в концентрациях 20 - 60 масс.%. После полного растворения белкового гидролизата в раствор вносят лакказу в дозировке 1,5-3 мкг/мл. Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25-50°С в течение 0,5-1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[39]Добавление сшивающего агента
[40]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют необходимое количество 25% водного раствора глутарового альдегида. Итоговая концентрация глутарового альдегида в растворе белкового гидролизата должна составлять 20 - 1 масс.%. Полученную смесь растворов белкового гидролизата и глутарового альдегида ставят на перемешивание при температуре 25-50°С в течение 1 часа.
[42]Смесь, полученную в ходе предыдущего этапа методики, переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см)
[43]Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[46]Получение биополимера из 40 масс% раствора белкового гидролизата с добавлением 5 масс% глутарового альдегида.
[47]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше+5°С.
[48]К 3 г белкового гидролизата добавляют 3 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С 60 мин до получения вязкого раствора насыщенного коричневого цвета.
[49]В полученный раствор вносят 4 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
[50]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 60 мин. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводят в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[51]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 1,6 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа, после чего полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[53]Получение биополимера из 20 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 10 масс.% глутарового альдегида.
[54]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
[55]К 3 г белкового гидролизата добавляют 11,4 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 25°С в течение 30 мин.
[56]В полученный раствор вносят 11 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
[57]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[58]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 6,4 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 25°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[60]Получение биополимера из 40 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 1 масс.% глутарового альдегида.
[61]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
[62]К 3 г белкового гидролизата добавляют 4,2 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 25°С в течение 30 мин.
[63]В полученный раствор вносят 5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
[64]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[65]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 0,32 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 25°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[67]Получение биополимера из 60 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 1 масс.% глутарового альдегида.
[68]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
[69]К 3 г белкового гидролизата добавляют 1,8 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С в течение 60 мин.
[70]В полученный раствор вносят 2,5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0.
[71]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[72]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 0,21 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[74]Получение биополимера из 60 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 5 масс.% глутарового альдегида.
[75]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги, в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
[76]К 3 г белкового гидролизата добавляют 1,0 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С в течение 60 мин.
[77]В полученный раствор вносят 1,5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0.
[78]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[79]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 1,1 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[81]Получение биополимера из 20 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 20 масс.% глутарового альдегида.
[82]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
[83]К 2 г белкового гидролизата добавляют 0,5 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С в течение 60 мин.
[84]В полученный раствор вносят 1,0 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,0.
[85]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[86]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 8,4 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
[88]Получение биополимера из 20 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 1 масс.% глутарового альдегида.
[89]Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
[90]К 3 г белкового гидролизата добавляют 11,4 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 25°С в течение 30 мин.
[91]В полученный раствор вносят 11,5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
[92]Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25°С в течение 30 мин. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
[93]К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 0,64 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 25°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
