[1]Изобретение относится к иммунологическому анализу и может найти применение в иммунохроматографическом анализе, осуществляемом на стрип-тестах.
[2]Для одновременного выявления патогенов иммунохроматографическим анализом применяются устройства с одним стрип-тестом в одном корпусе и несколькими стрип-тестами объединенными в один пластиковый корпус.
[3]Известны способы получения устройств с несколькими стрип-тестами: патент US 5238847, патент US 5556789, патент US 5962336, патент US 6203757, международная заявка WO 2007024633, заявка AU 2007349145.
[4]Известны способы соединения нескольких стрип-тестов в одном устройстве: патент US 5238847, патент US 5556789, патент US 6203757.
[5]Наиболее близким аналогом является устройство «RAID 5» для одновременного выявления иммунохроматографическим анализом спор сибирской язвы, рицина, ботулинических токсинов, стафилококкового энтеротоксина B, чумы производства Alexeter Technologies LLC, США [http://www.alexeter.com/biow/products/products/strips/RAID.asp; опубл.: 18.07.2015].
[6]Устройство для выявления нескольких патогенов, состоящее из иммунохроматографических стрип-тестов, предназначенных для выявления одного вида патогена, помещенных в единый корпус, работает следующим образом. Жидкий образец, содержащий патогены, вносят в отверстие корпуса, под которым находится пористая впитывающая жидкость мембрана, соединяющая отдельные стрип-тесты между собой. Жидкая проба, содержащая патогенны, смачивает данную мембрану и распространяется далее по стрип-тестам. Каждый стрип-тест состоит из полоски мультимембранного композита: мембраны для нанесения образца, мембраны с конъюгатом антител к выявляемому патогену, аналитической мембраны, на которой нанесены в тестовой зоне антитела к выявляемому патогену, в контрольной зоне - антивидовые антитела по отношению к антителу конъюгата, впитывающей мембраны. В процессе иммунохроматографического анализа жидкая проба, содержащая патогены, специфично взаимодействует с антителом конъюгата, образованные иммунные комплексы с током жидкости перемещаются по аналитической мембране до тестовых зон, где происходит взаимодействие с комплексом, в результате чего образуется окраска, не прореагировавший с патогеном конъюгат связывается с антителами контрольной зоны. Впитывающая мембрана, установленная на противоположном (от места нанесения образца) конце стрип-теста, служит для продвижения капиллярного тока жидкости по мембранам стрип-теста. На наличие патогена(-ов) в образце указывает окраска тестовой зоны, окраска контрольной зоны указывает на правильность проведения иммунохроматографического анализа, достаточность объема образца, сохранность функциональных свойств стрип-теста.
[7]Недостатком прототипа и иных известных решений является то, что в аналогичных устройствах выявляются споры возбудителя сибирской язвы, возбудитель чумы, токсины, но нет возможности выявления биологического препарата на основе развивающегося куриного эмбриона и желточного мешка (РКЭ+ЖМ), который является питательной средой для выращивания вирусов и риккетсий, наличие которого в исследуемом образце может свидетельствовать о присутствии вирусов и риккетсий.
[8]Также недостатком является то, что температурный диапазон применения данных устройств колеблется от комнатной температуры до плюс 48,9°C, что существенно снижает возможности тестирования, поскольку на практике определение патогенных микробов и токсинов может осуществляться во внелабораторных (полевых) условиях, где температура окружающей среды может быть ниже нуля.
[9]Задача изобретения - одновременное выявление патогенных микроорганизмов и токсинов, относящихся к разным условным таксономическим группам в широком температурном диапазоне в смывах, полученных из объектов окружающей среды.
[10]Технический результат изобретения:
[11]- увеличивается производительность иммунохроматографического анализа;
[12]- расширяется температурный диапазон иммунохроматографического анализа от минус 20 до плюс 50°C;
[13]- сокращается время получения результата до 10 мин по сравнению с анализом при комнатной температуре (20 мин), при условии достижении одинаковой чувствительности;
[14]- повышается чувствительность анализа по сравнению с анализом, проводимым при комнатной температуре.
[15]Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных, характеризующийся использованием как минимум пяти иммунохроматографических стрип-тестов, размещенных в едином корпусе, при этом в первом и втором каналах корпуса устройства находятся стрип-тесты для выявления токсинов, в третьем канале - стрип-тест для выявления вегетативных форм бактерий, в четвертом - споровых форм бактерий, а в пятом - стрип-тест для выявления питательной среды культивирования вирусов и риккетсий, отличающийся тем, что тестирование ведут путем укладки корпуса иммунохроматографических стрип-тестов в теплоизолирующий цефленовый пакет, состоящий из двух слоев цефлена, с теплоизолирующей прокладкой из пористого теплоизолирующего материала между ними, а корпус иммунохроматографических стрип-тестов внутри пакета нагревают источником постоянного тепла, причем отверстие пакета закрывают механическим зажимом и считают этот момент началом тестирования.
[16]Предпочтительно, используют химический источник тепла, который помещают в теплоизолирующий цефленовый пакет и кладут на горизонтальную поверхность, а сверху на химический источник тепла помещают устройство и пробирку с образцом; после прогрева вносят жидкий образец в устройство и вновь помещают устройство в теплоизолирующий цефленовый пакет на химический источник тепла, инкубируют в течение 20 мин и регистрируют результаты анализа.
[17]Предпочтительно, используют электрический источник тепла, который помещают в теплоизолирующий цефленовый пакет и кладут на горизонтальную поверхность, а рядом с электрическим источником тепла помещают устройство и пробирку с образцом; после прогрева вносят жидкий образец в устройство и вновь помещают устройство в теплоизолирующий цефленовый пакет с электрическим источником тепла, инкубируют в течение 20 мин и регистрируют результаты анализа.
[18]Предпочтительно, в качестве электрического источника тепла используют электрический нагреватель, контактный конец шнура питания которого выводят на внешнюю поверхность пакета в виде клеммы, к которой снаружи пакета подключают питание от розетки через адаптер 12B либо от аккумулятора.
[19]Предпочтительно, дополнительно внутри пакета вместе с электрическим источником тепла размещают датчик температуры, который используют для отключения электропитания нагревателя при превышении температуры внутри пакета определенного порогового значения.
[20]Также заявлено устройство для иммунохроматографического анализа, содержащее иммунохроматографические стрип-тесты, размещенные в едином корпусе, при этом в первом и втором каналах корпуса устройства находятся стрип-тесты для выявления токсинов, в третьем канале - стрип-тест для выявления вегетативных форм бактерий, в четвертом - споровых форм бактерий, а в пятом - стрип-тест для выявления питательной среды культивирования вирусов и риккетсий, отличающееся тем, что корпус иммунохроматографических стрип-тестов помещен в теплоизолирующий цефленовый пакет, состоящий из двух слоев цефлена, с теплоизолирующей прокладкой из пористого теплоизолирующего материала между ними, а корпус иммунохроматографических стрип-тестов внутри пакета расположен вплотную или рядом с источником постоянного тепла, причем отверстие пакета выполнено с возможностью закрытия механическим зажимом.
[21]Предпочтительно, использован химический источник тепла.
[22]Предпочтительно, использован электрический источник тепла в виде электрического нагревателя, контактный конец шнура питания которого выведен на внешнюю поверхность пакета в виде клеммы, к которой снаружи пакета подключают питание от розетки через адаптер 12B либо от аккумулятора.
[23]Предпочтительно, дополнительно внутри пакета вместе с электрическим источником тепла размещен датчик температуры, который подключен к прерывателю электрического контакта, подающего электропитание на нагреватель.
[24]Краткое описание чертежей
[25]На Фиг. 1 показана схема проведения иммунохроматографического анализа с применением химического источника тепла, где: 1 - слой цефлена, 2 - горизонтальная поверхность, 3 - химический источник тепла, 4 - устройство для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов и токсинов, патогенных для человека и животных, 5 - зажим, 6 - слой теплоизолятора.
[26]На Фиг. 2 показана схема проведения иммунохроматографического анализа с применением электрического источника тепла, где: 7 - электрический контакт нагревателя, выведенный наружу пакета, 8 - штекер шнура подачи электропитания, 9 - электронагреватель, 10 - датчик температуры.
[27]На Фиг. 3 показано устройство для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных, где: 11 - отверстия для регистрации результата анализа, 12 - отверстия для контроля правильности укладки стрип-тестов, 13 - тестовая зона, 14 - контрольная зона, 15 - отверстие для нанесения образца.
[28]На Фиг. 4 показаны примеры результатов иммунохроматографического анализа образцов, содержащих представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных, где:
[29]А - положительный результат анализа для ботулинического токсина типа А,
[30]Б - положительный результат анализа для стафилококкового энтеротоксина типа В,
[31]В - положительный результат анализа для возбудителя чумы,
[32]Г - положительный результат анализа для спор возбудителя сибирской язвы,
[33]Д - положительный результат анализа для биологического препарата (РКЭ+ЖМ).
[34]На Фиг. 5 показан результат иммунохроматографического анализа образца, содержащего представителей пяти условных таксономических групп микроорганизмов и токсинов, патогенных для человека и животных.
[35]Осуществление изобретения
[36]Сущность изобретения заключается в том, что в устройстве применяются иммунохроматографические стрип-тесты, выявляющие представителей условных таксономических групп патогенных микроорганизмов (спор бактерий, вегетативных форм бактерий, вирусов и риккетсий), токсинов, и внешний химический источник тепла, позволяющие осуществлять иммунохроматографический анализ при температурах от минус 20°C до плюс 10°C, ускорять и повышать чувствительность анализа, если он проводится при температурах выше плюс 10°C. О наличии в исследуемой пробе патогенных микроорганизмов или токсинов судят по появлению двух окрашенных полос на поверхности аналитической мембраны.
[37]Способ характеризуется использованием как минимум пяти иммунохроматических стрип-тестов, размещенных в едином корпусе, при этом в первом и втором каналах корпуса устройства находятся стрип-тесты для выявления токсинов, в третьем канале - стрип-тест для выявления вегетативных форм бактерий, в четвертом - споровых форм бактерий, а в пятом - стрип-тест для выявления питательной среды культивирования вирусов и риккетсий.
[38]Отличием является то, что тестирование ведут путем укладки корпуса иммунохроматических стрип-тестов в теплоизолирующий цефленовый пакет, состоящий из двух слоев цефлена, с теплоизолирующей прокладкой из пористого теплоизолирующего материала между ними, а корпус иммунохроматических стрип-тестов внутри пакета нагревают источником постоянного тепла, причем отверстие пакета закрывают механическим зажимом и считают этот момент началом тестирования.
[39]Способ может быть реализован с использованием устройства (см. Фиг. 1, Фиг. 2) для иммунохроматографического анализа, содержащего иммунохроматографические стрип-тесты 4, размещенные в едином корпусе, содержащем каналы 11 стрип-тестов. При этом в первом и втором каналах корпуса устройства находятся стрип-тесты для выявления токсинов, в третьем канале - стрип-тест для выявления вегетативных форм бактерий, в четвертом - споровых форм бактерий, а в пятом - стрип-тест для выявления питательной среды культивирования вирусов и риккетсий.
[40]Корпус иммунохроматографических стрип-тестов 4 помещен в цефленовый пакет, состоящий из двух слоев цефлена 1, с теплоизолирующей прокладкой 6 из пористого теплоизолирующего материала между ними.
[41]Цефленовый пакет, в который помещают корпус с иммунохроматографическими стрип-тестами 4 содержит источник постоянного тепла, причем отверстие пакета выполнено с возможностью закрытия механическим зажимом 5.
[42]В качестве источника тепла может быть использован химический источник тепла 3 (см. Фиг. 1), который помещают в теплоизолирующий цефленовый пакет и кладут на горизонтальную поверхность, а сверху на химический источник тепла 3 помещают устройство 4 и пробирку с образцом. После прогрева вносят жидкий образец в устройство 4 и вновь помещают устройство 4 в теплоизолирующий цефленовый пакет на химический источник тепла 3, инкубируют в течение 20 мин и регистрируют результаты анализа.
[43]В качестве источника тепла может быть использован также электрический источник тепла 9 (см. Фиг. 2), который помещают в теплоизолирующий цефленовый пакет и кладут на горизонтальную поверхность, а рядом с электрическим источником тепла 9 помещают устройство 4 и пробирку с образцом; после прогрева вносят жидкий образец в устройство 4 и вновь помещают устройство в теплоизолирующий цефленовый пакет с источником тепла 9, инкубируют в течение 20 мин и регистрируют результаты анализа.
[44]Электрический нагреватель 9 может быть выполнен так, что его контактный конец шнура питания выведен на внешнюю поверхность пакета в виде клеммы 7, к которой снаружи пакета подключают питание 8 от розетки через адаптер 12B либо от аккумулятора. Желательно, чтобы внутри пакета вместе с электрическим нагревателем 9 был размещен датчик температуры 10, который используют для отключения электропитания нагревателя при превышении температуры внутри пакета определенного порогового значения. Датчик температуры 10 позволяет исключить перегрев образцов в корпусе 4 в случае проведения тестирования при высоких окружающих температурах воздуха и тем самым повысить качество тестирования. При отрицательных температурах воздуха использование датчика температуры 10 не обязательно.
[45]Многие вирусы (вирусы вакцины, бешенства, свинки, кори, герпеса и др.) [Общая вирусология. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Пер. с англ. Меклера Л.Б. / М.: Мир. 1981. 680 с.] и риккетсий [Лобан К.М. Лихорадка Ky (коксиеллез). / М.: Медицина. 1987. 128 с.] хорошо культивируются в клетках развивающегося куриного эмбриона. Наибольшее практическое применение получило нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полость и в желточный мешок куриного эмбриона [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. Бирнера М.О. / М.: Медицина. 1982. 464 с.]. Для культивирования риккетсий широко используют желточные мешки развивающихся куриных эмбрионов. Поэтому выявление сопутствующих выше описанным рецептурам белков среды накопления позволяет предполагать наличие в исследуемой пробе, взятой из объектов окружающей среды, вирусов или риккетсий.
[46]Путем иммунизации животных белковым препаратом, содержащим ткани развивающегося куриного эмбриона и желточный мешок, нарабатывают и выделяют из сыворотки крови животных специфические иммуноглобулины (антитела) против указанного антигена. Получают конъюгаты наночастиц коллоидного золота с указанными антителами, а также с антителами к спорам сибирской язвы, возбудителю чумы, ботулиническому токсину типа А и стафилококковому энтеротоксину типа В. Наносят конъюгаты на конъюгатные мембраны и высушивают. Получают пять конъюгатных мембран с нанесенными конъюгатами антител и коллоидным золотом. Получают пять аналитических мембран нанесением в виде тонких линий в тестовой зоне антител к биологическому препарату (РКЭ+ЖМ), антител к спорам сибирской язвы, возбудителя чумы, ботулинического токсина типа A и стафилококкового энтеротоксина типа В. Собирают мультимембранные композиты, комбинируя конъюгаты нанесенные на мембраны и аналитические мембраны для выявления одного патогена. Мультимембранные композиты нарезают на полоски, получают стрип-тесты, которые укладывают по одному каждого вида в твердый корпус. Твердый корпус состоит из двух частей. Нижняя часть - предназначена для укладывания и фиксирования стрип-тестов в определенных позициях. Верхняя часть корпуса имеет отверстия для проведения анализа, регистрации результата анализа и контроля правильности укладки стрип-тестов в нижней части корпуса. Стрип-тесты соединяют между собой мембраной, которая накладывается на мембраны для нанесения образца стрип-тестов под углом 90°, накрывают верхней частью корпуса, верхнюю и нижнюю части корпуса соединяют. Получают устройство для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека (далее устройство). Устройство помещают и запаивают до употребления в цефленовый мешок с осушителем.
[47]Готовят теплоизолирующий цефленовый пакет (см. Фиг. 1), состоящий из двух слоев цефлена, с теплоизолирующей прокладкой из пористого теплоизолирующего материала, например пенополиуретана или холофайбера, с одним отверстием, которое закрывается механическим зажимом.
[48]Для проведения анализа при температуре окружающей среды от минус 20°C до плюс 10°C активируют химический источник тепла, помещают его в теплоизолирующий цефленовый пакет, который кладут на горизонтальную поверхность. Сверху на химический источник тепла помещают устройство и пробирку с образцом. После прогрева вносят жидкий образец в устройство и вновь помещают устройство в теплоизолирующий цефленовый пакет на химический источник тепла, инкубируют в течение 20 мин и регистрируют результаты анализа.
[49]Для ускорения анализа и повышения его чувствительности при температуре окружающей среды выше плюс 10°C активируют химический (или электрический) источник тепла, помещают его в теплоизолирующий цефленовый пакет, который кладут на горизонтальную поверхность. Вносят жидкий образец в устройство, помещают устройство в теплоизолирующий цефленовый пакет на химический (или электрический) источник тепла, инкубируют в течение 20 мин и регистрируют результаты анализа.
[50]Пример 1. Получение устройства для одновременного выявления представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека и животных
[51]Получение мембран с конъюгатами. Применяют конъюгаты наночастиц коллоидного золота со средним диаметром 20 нм с антителами к биологическому препарату (РКЭ+ЖМ), спор сибирской язвы, возбудителя чумы, ботулинического токсина типа A и стафилококкового энтеротоксина типа B. Конъюгаты с оптической плотностью А525=3,0 наносят на стекловолоконные мембраны Millipore и высушивают в помещении с относительной влажностью воздуха от 20 до 30% и температуре плюс 50°C.
[52]Получение аналитических мембран. На нитроцеллюлозные мембраны Millipore для иммунохроматографии в виде тонких линий наносят антитела в концентрации 2,0 мг/мл. Для стрип-теста для выявления биологического препарата (РКЭ+ЖМ) в тестовую зону наносят антитела к биологическому препарату (РКЭ+ЖМ), в контрольную зону аналитической мембраны - козьи антитела к иммуноглобулинам кролика. Для стрип-теста для выявления спор сибирской язвы в тестовую зону наносят антитела к спорам сибирской язвы, в контрольную - кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши. Для стрип-теста для выявления возбудителя чумы в тестовую зону наносят антитела к возбудителю чумы, в контрольную - кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши. Для стрип-теста для выявления ботулинического токсина типа A в тестовую зону наносят антитела к ботулиническому токсину типа A, в контрольную - кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши. Для стрип-теста для выявления стафилококкового энтеротоксина типа B в тестовую зону наносят антитела к стафилококковому энтеротоксину типа B, в контрольную - кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши. Полученные аналитические мембраны высушивают в помещении с относительной влажностью воздуха от 20 до 30% и температуре от плюс 20 до плюс 25°C.
[53]Сборка мультимембранных композитов. На пластиковую подложку с клеевым слоем для прикрепления мембран мультимембранного композита с перекрытием аналитической мембраны наклеивают мембрану с конъюгатом, на мембрану с конъюгатом - мембрану для нанесения образца (целлюлозную мембрану Millipore). С другой стороны аналитической мембраны - впитывающую мембрану (целлюлозную мембрану Millipore) и цветную самоклеющуюся пленку для цветографической маркировки стрип-теста. Для ботулинического токсина типа A цвет пленки оранжевый, стафилококкового энтеротоксина типа B - зеленый, возбудителя чумы - желтый, спор сибирской язвы - синий, биологического препарата на основе развивающегося куриного эмбриона и желточного мешка - красный.
[54]Получение стрип-тестов. Мультимембранные композиты нарезают на полоски шириной 4 мм.
[55]Сборка устройства. В нижнюю часть пластиковой оправы помещают стрип-тесты, на подложки для нанесения образца накладывают стекловолоконную мембрану для соединения стрип-тестов. Наклеивают этикетку с наименованием выявляемых аналитов на верхнюю часть оправы. На этикетке наносят маркировку:
[56]- БОТОКСА - стрип-тест выявляет ботулинический токсин типа A,
[57]- СТАФТОКСВ - стрип-тест выявляет стафилококковый энтеротоксин типа B,
[58]- ЧУМА - стрип-тест выявляет возбудитель чумы,
[59]- СИБЯЗВА - стрип-тест выявляет споры сибирской язвы
[60]- РКЭ+ЖМ - стрип-тест выявляет биологический препарат на основе развивающегося куриного эмбриона и желточного мешка.
[61]Пластиковые оправы с мультимембранным композитом помещают в упаковочные пакеты с осушителем и герметично упаковывают.
[62]Получают устройство (Фиг. 3), которое имеет отверстие для нанесения образца (15), пять отверстий для регистрации результата анализа (11) и пять отверстий для контроля правильности укладки стрип-тестов (12). В устройстве выполнена тестовая 13 и контрольная 14 зоны.
[63]Пример 2. Выявление представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека, при температуре окружающей среды выше плюс 10°C
[64]В буфере для проведения иммунохроматографического анализа (ТУ 4354-05031637-2007) готовят по 1,0 мл растворов ботулинического анатоксина типа A с концентрацией 30 нг/мл, энтеротоксина типа B из Staphilococcus aureus в концентрации 40 нг/мл, биологический препарат на основе развивающегося куриного эмбриона и желточного мешка в концентрации 100 нг/мл; суспензий вакцины сибиреязвенной живой штамм СТИ-1 (споры В. anthracis) (ФС 42-0095-1376-01) с концентрацией 1×106 спор/мл, взвеси убитой культуры Yersinia pestis вакцинный штамм EV (ФС 42-3810-99) с концентрацией 5×105 м.к./мл. Вскрывают пять упаковочных пакетов, вынимают устройства, кладут их на горизонтальную поверхность лицевой стороной вверх. В отверстие для нанесения образца 1 (рисунок 5) каждого из устройств, вносят по 500 мкл одного вида приготовленных растворов или взвесей бактериальных клеток. Через 20-25 мин регистрируют результат анализа. В отверстии для регистрации результата анализа, соответствующем ботулиническому токсину типа A (БОТОКСА), наблюдают две окрашенные линии в тестовой зоне и контрольной зоне (положительный результат), в остальных отверстиях - по одной окрашенной линии в контрольных зонах (отрицательный результат) (Фиг. 4А). В отверстии для регистрации результата анализа, соответствующем стафилококковому энтеротоксину типа В (СТАФТОКСВ), наблюдают две окрашенные линии в тестовой зоне и контрольной зоне (положительный результат), в остальных отверстиях - по одной окрашенной линии в контрольных зонах (отрицательный результат) (Фиг. 4Б). В отверстии для регистрации результата анализа, соответствующем возбудителю чумы (ЧУМА), наблюдают две окрашенные линии в тестовой зоне и контрольной зоне (положительный результат), в остальных отверстиях - по одной окрашенной линии в контрольных зонах (отрицательный результат) (Фиг. 4В). В отверстии для регистрации результата анализа, соответствующем возбудителю спор сибирской язвы (СИБЯЗВА), наблюдают две окрашенные линии в тестовой зоне и контрольной зоне (положительный результат), в остальных отверстиях - по одной окрашенной линии в контрольных зонах (отрицательный результат) (Фиг. 4Г). В отверстии для регистрации результата анализа, соответствующем биологическому препарату (РКЭ+ЖМ), наблюдают две окрашенные линии в тестовой зоне и контрольной зоне (положительный результат), в остальных отверстиях - по одной окрашенной линии в контрольных зонах (отрицательный результат) (Фиг. 4Д).
[65]Пример 3. Одновременное выявление представителей условных таксономических групп микроорганизмов, патогенных для человека, при температуре окружающей среды выше плюс 10°C
[66]В буфере для проведения иммунохроматографического анализа (ТУ 4354-05031637-2007) готовят по 1,0 мл растворов ботулинического анатоксина типа A с концентрацией 150 нг/мл, энтеротоксина типа B из Staphilococcus aureus в концентрации 200 нг/мл, биологический препарат (РКЭ+ЖМ) в концентрации 500 нг/мл; суспензий вакцины сибиреязвенной живой (споры В. anthracis) штамм СТИ-1 (ФС 42-0095-1376-01) с концентрацией 5×106 спор/мл, взвеси убитой культуры Yersinia pestis вакцинный штамм EV (ФС 42-3810-99) с концентрацией 2,5×106 м.к./мл. Смешивают по 100 мкл приготовленных растворов, получая 500 мкл исследуемого образца. Вскрывают один упаковочный пакет, вынимают устройство, помещают его на горизонтальную поверхность. В отверстие для нанесения образца устройства вносят 500 мкл приготовленного, как описано выше, образца. Через 20-25 мин регистрируют результат анализа. Во всех пяти отверстиях регистрации результата анализа наблюдали положительный результат - две окрашенные линии в тестовой и контрольной зонах (Фиг. 5).
[67]Пример 4. Выявление биологического препарата на основе развивающегося куриного эмбриона и желточного мешка при температуре окружающей среды ниже 0°C.
[68]Обычно при температуре окружающей среды от 0 до 10°C иммунохимические реакции идут очень медленно, капиллярное движение тока жидкости и диффузия в иммунохроматографических мембранах затруднены из-за повышенной вязкости водно-солевых буферных растворов. Проведение анализа при отрицательных температурах невозможно из-за того, что водные растворы образцов находятся в замороженном состоянии. Тем не менее на практике выявление патогенов в окружающей среде необходимо и при пониженных температурах. На данном примере показана возможность проведения иммунохроматографического анализа при температуре окружающей среды минус 20°C.
[69]Механическим воздействием активируют автономный химический источник тепла 3 (например, АИСТ ТУ 2389-003-14665192-2004) до ощущения тепла и помещают его в цефленовый пакет, имеющий слой изолятора 6, размещенный между слоями цефлена 1. Устройство в упаковке, пробирку с раствором биологического препарата (РКЭ+ЖМ), помещают на разогретый химический источник тепла в теплоизолирующем цефленовом пакете, пакет закрывают зажимом, кладут на горизонтальную поверхность в климатической камере, где температура окружающего воздуха составляет минус 20°C. Через 10 мин открывают теплоизолирующий цефленовый пакет, вынимают устройство 4 в упаковке и пробирку с раствором аналита. Вскрывают пакет устройства, в отверстие вносят 500 мкл раствора биологического препарата (РКЭ+ЖМ) пипеткой устройства. Устройство аккуратно помещают на химический источник тепла 3 в теплоизолирующем цефленовом пакете, который закрывают зажимом 5. Через 20-25 мин регистрируют результат анализа. В отверстии для регистрации результата анализа, соответствующем биологическому препарату (РКЭ+ЖМ), наблюдают две окрашенные линии в аналитической зоне и контрольной зоне, в остальных отверстиях - по одной окрашенной линии в контрольных зонах (Фиг. 4).
[70]Пример 5. Ускоренное выявление спор возбудителя сибирской язвы
[71]При температуре окружающей среды от 10 до 35°C иммунохроматографический анализ спор возбудителя сибирской язвы занимает 20-25 мин. Для снижения времени анализа в два раза активируют автономный химический источник тепла (например, АИСТ ТУ 2389-003-14665192-2004), кладут грелку на горизонтальную поверхность в теплоизолирующем цефленовом пакете, как это описано в примере 4. В буфере для проведения иммунохроматографического анализа готовят суспензию вакцины сибиреязвенной живой (споры В. anthracis) штамм СТИ-1 (ФС 42-0095-1376-01) с концентрацией 1×106 спор/мл объемом 1,0 мл. Вскрывают два упаковочных пакета, вынимают два устройства, одно кладут на химический источник тепла, второе - на горизонтальную поверхность. Отбирают 500 мкл суспензии спор возбудителя сибирской язвы пипеткой и вносят ее в отверстие для нанесения образца обоих устройств. Регистрируют результат анализа через 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин. Результаты анализа показаны в таблице 1.
[72]
[73]Пример 6. Увеличение чувствительности выявления клеток возбудителя чумы
[74]При температуре окружающей среды от 10 до 35°C чувствительность выявления клеток Y. pestis вакцинный штамм EV с помощью устройства составляет 5×105 м.к./мл. Для увеличения чувствительности в пять раз механически активируют два автономных химических источника тепла (например, АИСТ ТУ 2389-003-14665192-2004), помещают их в теплоизолирующие цефленовые пакеты на горизонтальной поверхности. В буфере для проведения иммунохроматографического анализа готовят суспензии из взвеси убитой культуры Yersinia pestis вакцинный штамм EV (ФС 42-3810-99) с концентрациями 1×105 м.к./мл и 5×105 м.к./мл объемом 1,0 мл. Вскрывают четыре упаковочных пакета, вынимают устройства, два устройства кладут на химический источник тепла, по одному на каждый, и в теплоизолирующий цефленовый пакет, как это описано в примере 4, оставшиеся - на горизонтальную поверхность без нагрева. Отбирают 500 мкл суспензии клеток возбудителя чумы с концентрацией 1×105 м.к./мл и вносят ее в отверстие для нанесения образца одного из устройств, расположенных на грелке, и на горизонтальной поверхности. В оставшиеся устройства вносят суспензию клеток возбудителя чумы с концентрацией 5×105 м.к./мл. Через 20 мин регистрируют результат анализа. Результаты анализа представлены в таблице 2.
[75]
[76]Пример 7. Ускоренное выявление спор возбудителя сибирской язвы
[77]При температуре окружающей среды от 10 до 35°C иммунохроматографический анализ спор возбудителя сибирской язвы занимает 20-25 мин. Для снижения времени анализа в два раза используют электрический нагреватель, работающий от электрического адаптера 12B. В буфере для проведения иммунохроматографического анализа готовят суспензию вакцины сибиреязвенной живой (споры В. anthracis) штамм СТИ-1 (ФС 42-0095-1376-01) с концентрацией 1×106 спор/мл объемом 1,0 мл. Вскрывают два упаковочных пакета, вынимают два устройства, одно кладут на нагреватель, второе - на горизонтальную поверхность. Отбирают 500 мкл суспензии спор возбудителя сибирской язвы пипеткой и вносят ее в отверстие для нанесения образца обоих устройств. Регистрируют результат анализа через 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин. Результаты анализа показаны в таблице 3.
[78]
[79]Пример 8. Увеличение чувствительности выявления стафилококкового энтеротоксина типа B
[80]При температуре окружающей среды от 10 до 35°C чувствительность выявления стафилококкового энтеротоксина типа B составляет 40 нг/мл. Для увеличения чувствительности в два раза используют электрический нагреватель, работающий от электрического адаптера 12B, помещенный в теплоизолирующие цефленовые пакеты и обеспечивающий температуру 50°C. В буфере для проведения иммунохроматографического анализа готовят раствор стафилококкового энтеротоксина типа В с концентрациями 20 нг/мл и 40 нг/мл объемом 1,0 мл каждой концентрации. Вскрывают четыре упаковочных пакета, вынимают устройства, два устройства помещают в теплоизолирующий цефленовый пакет с электрическим нагревателем, оставшиеся - на горизонтальную поверхность без нагрева. Отбирают 500 мкл раствора энтерококкового токсина типа B с концентрацией 20 нг/мл и 40 нг/мл и вносят их в отверстия для нанесения образца каждого из устройств, расположенных в цефленовых пакетах с нагревателем. В оставшиеся устройства, расположенные на горизонтальной поверхности без нагрева, вносят раствор энтерококкового токсина типа B с концентрацией 20 нг/мл и 40 нг/мл. Через 20 мин регистрируют результат анализа. Результаты анализа представлены в таблице 4.
[81]
[82]Из всего вышесказанного следует, что благодаря проведению тестирования с использованием двойного цефленового пакета с теплоизоляционным слоем между слоями цефлена, внутрь которого помещают устройство для стрип-тестов и проводят его нагрев, а сам пакет закрывают и фиксируют зажимом, удается обеспечить стабильную температуру внутри пакета, которая оптимальна для осуществления иммунохимической реакции с антигенами микроорганизмов или токсинов. Это позволяет:
[83]- увеличить производительность иммунохроматографического анализа, т.к. за один цикл анализа одновременно выявляется как минимум пять наименований патогенов, относящихся к различным условным таксономическим группам (у прототипа нет возможности для обнаружения среды накопления вирусов и риккетсий);
[84]- расширить температурный диапазон иммунохроматографического анализа от минус 20 до плюс 50°C (у прототипа температурный диапазон от комнатной температуры и до плюс 48,9°C);
[85]- сократить время получения результата до 10 мин по сравнению с анализом при комнатной температуре (20 мин), при условии достижения одинаковой чувствительности;
[86]- повысить чувствительность анализа по сравнению с анализом, проводимым при комнатной температуре.
