патент
№ RU 2638810
МПК G01N33/18

Способ определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в клиническом материале, смывах с объектов окружающей среды, в почве

Авторы:
Рахманин Юрий Анатольевич Асланова Мария Михайловна Кузнецова Камаля Юнис кызы
Все (15)
Номер заявки
2016148899
Дата подачи заявки
13.12.2016
Опубликовано
15.12.2017
Страна
RU
Дата приоритета
16.06.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Иллюстрации 
1
Реферат

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и представляет собой способ определения в одной постановке цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале - кале, в смывах объектов окружающей среды и в почве, заключающийся в подготовке пробы, внесении в пробу иммуномагнитных частиц, иммунохимическом связывании, в результате чего образуются агрегаты цист и ооцист с магнитными частицами, улавливании агрегатов цист и ооцист в магнитном поле, отмывке зафиксированных агрегатов цист и ооцист буферным раствором, диссоциации меркаптоэтанолом или соляной кислотой, разделении цист, ооцист и магнитных частиц в магнитном поле, переносе выделенных цист и ооцист на предметное стекло для последующего иммунофлуоресцентного мечения и последующей оценки микроскопированием с применением насадки «Опти-Люм» на микроскоп, где результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных от 8 до 14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты же криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями. Изобретение обеспечивает повышение эффективности определения в одной постановке цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале - кале, в смывах с овощей и объектов окружающей среды, в почве и сокращение временных затрат на исследование одной пробы исследуемого материала адаптированным до 15 минут. 7 пр., 7 табл., 1 ил.

Формула изобретения

Способ определения в одной постановке цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале - кале, в смывах объектов окружающей среды и в почве, заключающийся в подготовке пробы, внесении в пробу иммуномагнитных частиц, иммунохимическом связывании, в результате чего образуются агрегаты цист и ооцист с магнитными частицами, улавливании агрегатов цист и ооцист в магнитном поле, отмывке зафиксированных агрегатов цист и ооцист буферным раствором, диссоциации меркаптоэтанолом или соляной кислотой, разделении цист, ооцист и магнитных частиц в магнитном поле, переносе выделенных цист и ооцист на предметное стекло для последующего иммунофлюоресцентного мечения и последующей оценки микроскопированием с применением насадки «Опти-Люм» на микроскоп, где результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных от 8 до 14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты же криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Описание

Предлагаемое изобретение относится к области клинической медицины, более конкретно к работам по определению паразитологических агентов в клиническом материале - кале, в смывах объектов окружающей среды, в почве адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением с разработанной пробоподготовкой биологического материала к проведению исследований.

Современный этап развития паразитологических лабораторных исследований позволяет проводить комплексную оценку паразитарной системы с использованием микроскопических, иммунных, иммунохимических и высокотехнологических методов анализа, в т.ч. метода полимеразной цепной реакции и применение комплекса автоматизированной микроскопии. В последние годы методика паразитологических анализов подверглась радикальной модернизации, позволившей создать современный уровень условий труда врача, точности и производительности. Однако при аналитической обработке показателей паразитарной заболеваемости населения независимые эксперты применяют термины «истинной» и «регистрируемой» распространенности паразитозов, подчеркивая невысокую эффективность диагностической работы учреждений здравоохранения и несоответствующие расчетам статистические показатели загрязнения окружающей среды паразитарными патогенами. До настоящего времени в паразитологических лабораториях при определении качества воды на наличие ооцист криптоспоридий и цист лямблий применяются архаичные классические методы, обладающие очень низкой чувствительностью.

Известен способ по исследованию воды на наличие цист лямбли и ооцист криптоспоридий методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами, включающий отбор проб, проведение исследований и оценку результатов. (Методические указания МУК 4.2.2314-08, МУК 4.2.2959-11).Указанный способ достаточно длительный по времени и трудоемкий и для его реализации необходимо дорогостоящее оборудование и реактивы, ограничен объектом исследования - вода.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является повышение эффективности комплексного определения яиц гельминтов, цист патогенных кишечных простейших, в том числе ооцист криптоспоридий в одной постановке методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением в биологическом материале кале, в смывах объектов окружающей среды, в почве и сокращении временных затрат на исследование одной пробы исследуемого материала до 15 минут.

Технический результат достигается тем, что в способе определения в одной постановке цист лямблий и ооцист криптоспоридий в биологическом материале - кале, в смывах объектов окружающей среды, в почве, включающем отбор проб, проведение исследований и оценку результатов, при проведении исследований при связывании и промывке цист лямблий и ооцист криптоспоридий переносят ресуспензированный исследуемый осадок в магнитную пробирку и производят оценку микроскопированием с применением насадки «Опти-Люм» на микроскоп, результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных от 8 до 14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Процедура связывания и промывки цист лямблий и ооцист криптоспоридий заключается в следующем: вносят 5 мл буфера из диагностического набора в магнитную пробирку с плоской боковой поверхностью для иммуномагнитной сепарации, закрывают пробирку крышкой и вращают пробирку, смачивая буфером ее внутренние стенки; в нее вносят диагностический осадок. Весь объем иммуномагнитной суспензии Cryptosporidium Beads и Giardia Beads диагностического набора перемешивают на вортексе в течение 10-15 с, отбирают микродозатором из каждого флакона по 100 мкл (0,1 мл) суспензии и переносят ее в ИМС-пробирку, в которой уже находится порция с диагностическим осадком. Закрывают крышку, закрепляют магнитную пробирку в штативе лабораторного ротатора и перемешивают в течение одного часа при скорости 15-25 об/мин маятникообразными движениями (не переворачивая пробирку!). Затем магнитную пробирку извлекают из ротатора и помещают в магнитный штатив MagnetOn 4Т™; при этом плоская сторона пробирки должна быть обращена к магниту штатива; в течение 2 мин, не переворачивая пробирку, наклоняют пробирку вместе с магнитным штативом по направлению от дна к крышке пробирки и наоборот. По мере движения на плоской стороне магнитной пробирки будет образовываться осадок (налет). Не вынимая ИМС-пробирку из магнитного штатива, открывают крышку и осторожно сливают надосадочную жидкость из пробирки. В магнитную пробирку добавляют 1 мл моющего буфера IT-Wash Buffer (WB), снимают пробирку из штатива, взбалтывают ее для полного смыва осадка с плоской стороны пробирки. С помощью магнитной ручки SepPen собирают магнитную суспензию. Из магнитную пробирки удаляют магнитную ручку SepPen.

В микроцентрифужную пробирку типа Epindorf (объемом на 1,5-2 мл) помещают 1 мл моющего буфера WB и в нее вносят ранее собранную суспензию. Во вторую магнитную пробирку добавляют 1 мл буфера WB, закрывают крышку и промывают буфером внутренние стенки пробирки и крышки, магнитную пробирку помещают в магнитный штатив Magnet Оn4Т™; наклоняя вправо-влево в течение 30-60 с, промывают внутреннюю поверхность пробирки и собирают остатки магнитной суспензии. Не вынимая магнитную пробирку из магнитного штатива, сливают моющий буфер WB из пробирки и добавляют в пробирку новую порцию моющего буфера WB объемом 1 мл. Крышку закрывают и повторяют процедуру промывки. Далее магнитную пробирку снимают со штатива и взбалтыванием смывают суспензию с плоской стороны пробирки. С помощью магнитной ручки SepPen образовавшуюся суспензию переносят в микроцентрифужную пробирку, в которую предварительно внесли моющий буфер WB и первую порцию обработанного диагностического осадка, устанавливают ее в магнитный штатив и в течение 1 мин вместе со штативом наклоняют вправо-влево, оставляют на 15 с в вертикальном положении. Не вынимая микроцентрифужную пробирку из магнитного штатива, сливают моющий буфер WB из пробирки, добавляют в пробирку 1 мл новой порции моющего буфера WB.

Процедура диссоциации заключается в следующем: не вынимая микроцентрифужную пробирку из магнитного штатива, открывают крышку и сливают моющий буфер из пробирки, добавляют в пробирку 100 мкл рабочего раствора 2-меркаптоэтанола, суспензию перемешивают на вортексе в течение 30 с и помещают в термостат или водяную баню при 50°C на 5 мин, затем повторно суспензию в микроцентрифужной пробирке перемешивают на вортексе в течение 30 с и устанавливают в магнитный штатив. Не вынимая пробирку из магнитного штатива, отбирают супернатант и переносят его на слайд SuperStick™ для последующего иммунофлюоресцентного мечения. Во второе окно слайда S100-2 вносят каплю положительного контроля - G. lamblia, С. parvum.

Детекцию (идентификация) ооцист криптоспоридий и цист лямблий методом иммунофлюоресцентного мечения проводят в несколько этапов. Подготовка к мечению. По одной капле (около 45 мкл) рабочего раствора иммунореагента AquaGlo™ G/C* вносят в каждую лунку слайда с подсушенной пробой и контролем. Слайды помещают в ячейку влажности в темноте и инкубируют не менее 30 мин при 37°C или не менее 40 мин при комнатной температуре. В каждую лунку наносят по одной капле фосфатного буфера (PBS) или солевого раствора и выдерживают не менее 2 мин. Каждый слайд наклоняют на чистую фильтровальную бумагу и осторожно аспирируют излишек жидкости.

Процедура мечения заключается в следующем: по одной капле контрастирующего красителя вносят в каждую лунку и выдерживают 1 мин при комнатной температуре, далее в нее добавляют по одной капле разведенного с дистиллированной водой (в соотношении 1:19) фосфатного буфера (PBS) или солевого моющего буфера 20XWash Buffer и выдерживают 1 мин при комнатной температуре. Излишек жидкости из нижней части лунок слайдов аспирируют с помощью фильтровальной бумаги или пастеровской пипетки. Слайды раскладывают на наклонном штативе и подсушивают при комнатной температуре. Затем в лунки вносят по 1 капле монтирующей среды No-Fade™, покрывают покровным стеклом, края заклеивают канадским бальзамом или бесцветным лаком.

Препараты микроскопируют под масляной иммерсией на люминесцентном микроскопе или с применением насадки «Опти-Люм», преобразующей световой микроскоп в люминесцентный. Исследуют препараты при х200. Перед началом микроскопии диагностических препаратов предварительно просматривают препараты положительного контроля из диагностического набора с подсчитанными цистами лямблий и ооцистами криптоспоридий.

Результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий - сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных (8-14 мкм в длину на 7-10 мкм в ширину), с ярко подсвеченными краями; ооцисты криптоспоридий - сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от овальных до сферических (от 3 до 5 мкм в диаметре), с ярко подсвеченными краями.

Предлагаемый способ поясняется примерами.

Пример 1. Выявление ряда преимуществ адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами при сравнительной оценке классических методов выявления паразитологических возбудителей из различных объектов окружающей среды и клиническом материале (Таблица 1).

Адаптированный метод иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами занимает 25 мин для пробоподготовки, кроме эфирформалинового, позволяет быстро учесть результат, препараты хранятся несколько месяцев, ооцисты криптоспоридий определяются только методом ИМС, кроме дополнительного метода окрашивания по Циль-Нильсону при исследовании клинического материала - кал, 100% достоверность результата по выявлению цист лямблий и ооцист криптоспоридий (Таблица 1).

На Фиг. 1. Схематично изображены этапы адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами.

Пример 2. Проведена экспериментальная серия исследований по определению чувствительности адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами по всем видам образцов. В результате установлено, что чувствительность адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами при исследованиях проб объектов окружающей среды без потери исследуемого материала на этапе пробоподготовки (кал, смывы с поверхностей) составляет до 100%. Чувствительность адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами при исследованиях проб с частичной потерей исследуемого материала на этапе пробоподготовки (почва) составляет до 85-90% (Таблица 2).

Пример 3. При исследовании 650 проб натурного материала 2 методами установлена 100% эффективность адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами при определении цист лямблий и ооцист криптоспоридий. Для определения специфичности адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами использовали экспериментальные модели с искусственным заражением натурного материала. Эффективность адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами в экспериментальной серии исследований проб кала составила 100% цист лямблий, 100% ооцист криптоспоридий при показателях исследований экспериментальных проб кала методом эфирформалинового осаждения соответственно 95.0% цист лямблий, 0 - ооцист криптоспоридий, не обнаружены (Таблица 3).

Пример 4. При исследовании 900 проб натурного материала 2 методами, осадка и надосадочной жидкости, установлена 90.0% выявляемость определения цист лямблий и 70.0% ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами, объясняющейся частичной потерей паразитарных патогенов при проведении пробоподготовки.

Выявляемость определения составляет около 30,0% цист лямблий и 0% ооцист криптоспоридий методом Падченко. При эффективности определения паразитарных патогенов в почве адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами определяется 90% цист лямблий и 100% ооцист криптоспоридий. Для определения специфичности адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами использовали экспериментальные модели с искусственным заражением натурного материала. Эффективность адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами в экспериментальной серии исследований составила 100.0% цист лямблий, 100.0% ооцист криптоспоридий, в отличии от метода Падченко, эффективность которого составила 55.0% для цист лямблий, 0% - для ооцист криптоспоридий (Таблица 4).

Пример 5. При исследовании 900 проб натурного материала осадка и надосадочной жидкости 2 методами установлена 90.0% выявляемость определения цист лямблий и 70.0% ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами, объясняющейся частичной потерей паразитарных патогенов при проведении пробоподготовки.

Методом Падченко определяется около 30,0% цист лямблий и 0% - ооцист криптоспоридий. Процент эффективности определения паразитарных патогенов в почве методом ИМС составляет 90% цист лямблий и 100% ооцист криптоспоридий.

Для определения специфичности адаптированного метода иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами использовали натурные исследования 20 проб смывов с поверхностей объектов окружающей среды (пробы отбирались в плавательных детских и взрослых бассейнах, объекты - полы, стены, ручки дверей) и экспериментальные модели с искусственным заражением проб смывов. По результатам исследований смывов с поверхностей адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами обнаружено 5 цист лямблий и 3 ооцисты криптоспоридий, а методом Романенко цисты лямблий и ооцисты криптоспоридий не обнаружены. Пробы смывов с поверхностей бассейнов искусственно заражали по 20 ед. цист лямблий и 20 ед. ооцист криптоспоридий. Эффективность определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в экспериментальной серии исследований адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами составила 100.0%, в отличие от метода Романенко, эффективность которого составила 55.0% цист лямблий и 0% ооцист криптоспоридий (Таблица 5).

Пример 6. Исследование 500 проб натурного материала с плодовоовощной продукции (свекла, морковь, картофель, клубника) осуществлялось 3 методами: надосадочную жидкость исследовали методом Романенко и адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами, почвенный осадок исследовали методом последовательной фильтрации через аналитические трековые мембраны фильтрации и адаптированный метод иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами. В надосадочной жидкости установлена 100% эффективность определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами. Процент выявляемости паразитарных патогенов при исследовании почвенного осадка классическим методом фильтрации составляет 25.0% для цист лямблий и 0 - ооцист криптоспоридий, а адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами 90.0% для цист лямблий и 85.0% для ооцист криптоспоридий (Таблица 6).

Пример 7. Сравнительная оценка классических методов выявления паразитологических патогенов из различных объектов окружающей среды и в клиническом материале в сравнении с адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами и выявление ряда преимуществ предлагаемого метода: занимает 25 мин для пробоподготовки; позволяет быстро учесть результат; препараты хранятся несколько месяцев; ооцисты криптоспоридий определяются только адаптированным методом иммуномагнитного разделения и мечения флюоресцирующими антителами, кроме дополнительного метода окрашивания по Циль-Нильсону при исследовании клинического материала (кал); 100% достоверность результата по выявлению цист лямблий и ооцист криптоспоридий (Таблица 7).

Таким образом, высокая чувствительность, специфичность и целевая направленность способа определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в клиническом материале - кале, в смывах с объектов окружающей среды и в почве адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлюоресцентным мечением позволяет определять малые дозы паразитарных патогенов в окружающей среде, что имеет особенно важное значение при санитарно-эпидемиологической и экологической оценке рисков на территориях с нехарактерной для данной местности и/или на удаленной от источника циркуляции возбудителей. Указанные характеристики нового метода, возможность его применения для комплексной оценки паразитологической ситуации, позволят обеспечить достоверность исследований, их информативность и оперативность в принятии управленческих решений и способствовать повышению эффективности государственного мониторинга в области охраны здоровья и окружающей среды.

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты