[2]Изобретение относится к области высокомолекулярных соединений, содержащих квантовые точки, а именно к способу получения полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.
[3]Полимерные микросферы широко используются в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии, светорассеивании, при счете аэрозольных частиц и малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для определения размеров пор фильтров и биологических мембран, в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии, стабильности, седиментации и т.д., а также в качестве носителей биолигандов при создании диагностических тест-систем. При этом полимерные микросферы должны характеризоваться узким распределением по размерам и быть агрегативно устойчивыми в процессе синтеза, при хранении и в физиологических растворах [1-3].
[4]Кроме того, полимерные микросферы могут содержать визуализурующие метки, в частности квантовые точки, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций [4-6].
[5]Квантовые точки (КТ) представляют собой полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы, размеры которых, как правило, находятся в диапазоне от 1 до 10 нм и состоят из атомов элементов, находящихся в II-VI (например, CdSe) или II-V (например, InP) группах периодической таблицы Д.И. Менделеева. Квантовые точки обладают фотостабильностью и высоким квантовым выходом и широко применяются в современных методах флуоресцентной визуализации и оптической диагностики, в частности для флуоресцентного анализа биологических образцов, исследования иммунохимических реакций, диагностики различных вирусных и инфекционных заболеваний и заболеваний сердечно-сосудистой системы, например, исследования кровеносного русла, состояния сосудов и капилляров [7-9].
[6]Из уровня техники известны различные способы получения полимерных микросфер, содержащих квантовые точки, направленные на включение квантовых точек либо в объем полимерных микросфер, либо на локализацию на их поверхности. Такие способы основаны на: 1) набухании полимерных микросфер в растворителе и введении квантовых точек; 2) послойном осаждении квантовых точек на поверхность микросфер; 3) электростатическом взаимодействии; 4) непосредственном ковалентном присоединении квантовых точек; 5) включении квантовых точек в процессе синтеза полимерных микросфер. [10]
[7]Из уровня техники известен способ включения квантовых точек в полистирольные микросферы в процессе эмульсионной полимеризации стирола [11]. Однако полученные полимерные микросферы характеризовались широким распределением по размерам и низкой интенсивностью флуоресценции.
[8]Введение квантовых точек на стадии синтеза полимерных микросфер снижает их агрегативную устойчивость при хранении, что усложняет процесс их получения с заданным комплексом свойств. Кроме того, такой подход является трудоемким и малоэффективным.
[9]Из уровня техники известен способ включения квантовых точек в полиакролеиновые микросферы и сополимерные (акролеин/стирол) микросферы путем их набухания в смеси растворителей пропанол-2/ хлороформ, содержащей квантовые точки [12].
[10]В качестве недостатков указанного способа можно отметить невысокую агрегативную устойчивость полимерных микросфер и невозможность введения квантовых точек в полимерных микросферы в контролируемом количестве.
[11]Также известен способ получения функционализированных сополимерных (акролеин/стирол) микросфер, заключающийся в обработке их поочередно положительно заряженным полиэлектролитом, затем отрицательно заряженным полиэлектролитом, что приводит к формированию полиэлектролитного комплекса на поверхности микросфер, и после двукратного повторения процедуры последовательного осаждения полиэлектролитного комплекса в один или более слоев вводят квантовые точки [5].
[12]В качестве недостатков указанного способа можно отметить невысокую агрегативную устойчивость полимерных микросфер и невозможность введения квантовых точек в полимерных микросферы в контролируемом количестве.
[13]Настоящее изобретение направлено на разработку эффективного способа получения полимерных микросфер, содержащих квантовые точки в контролируемом количестве, которые характеризуются высокой интенсивностью сигнала, устойчивостью и стабильностью свойств во времени.
[14]Техническим результатом заявленного изобретения является повышение агрегативной устойчивости полимерных микросфер и квантовых точек на всех стадиях, предшествующих иммобилизации их в полимерные микросферы, и в увеличении процента квантовых точек, иммобилизованных в полимерные микросферы.
[15]Технический результат достигается тем, что готовят раствор квантовых точек в органическом растворителе, содержащем катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания, в количестве 1-2% мас., таким образом, что концентрация квантовых точек в растворе составляет 0,1-1,0 г/л, к раствору добавляют полимерные микросферы при соотношении полимер:раствор квантовых точек, равном 1:1, полученную смесь подвергают ультразвуковой обработке, затем выдерживают в течение 2-6 часов при комнатной температуре и диспергируют в С2-С4-алифатическом спирте, содержащем катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания, взятый в количестве 1-2% мас., выдерживают в течение 5-15 минут, затем центрифугируют для выделения образовавшегося осадка, состоящего из полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.
[16]В процессе осуществления изобретения в качестве растворителя можно использовать хлороформ, дихлорэтан стирол, толуол или метилметакрилат, в качестве С2-С4-алифатического спирта - этанол, в качестве катионактивного ПАВ - алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорид.
[17]При осуществлении заявленного способа использовали квантовые точки марки QD-Light - поставляются Центром высоких технологий ФГУП «НИИПА» (http://www.nanotech-dubna.ru) в толуольном либо хлороформном растворе концентрацией 1 г/л.
[18]Необходимой концентрации квантовых точек в растворе (0,1-1,0 г/л) добиваются разбавлением исходного раствора квантовых точек.
[19]При осаждении на полимерную поверхность квантовые точки ведут себя одинаково вне зависимости от того, в каком растворителе они диспергированы: в толуоле, хлороформе или их смеси. Их устойчивость и способность к самоагрегации определяется исключительно степенью стабилизации и отсутствием резкого перехода от неполярной среды к полярной.
[21]К 0,5 г толуольного раствора квантовых точек (концентрация квантовых точек 0,1 г/л), содержащего 0,01 г (2% мас.) алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида (катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания), добавляли 0,5 г полистирольных микросфер диаметром 0,2 мкм. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут, затем выдерживали в течение 3 часов при комнатной температуре. Окончание набухания полимерных микросфер наблюдали визуально. Затем смесь диспергировали в этаноле, содержащем 2% мас. алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида, выдерживали в течение 10 минут, затем центрифугировали для выделения образовавшегося осадка, состоящего из полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.
[23]К 1,0 г толуольного раствора квантовых точек (концентрация квантовых точек 0,2 г/л), содержащего 0,01 г (1% мас.) алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида (катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания), добавляли 1,0 г полиметилметакрилатных микросфер диаметром 1 мкм. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, затем выдерживали в течение 4 часов при комнатной температуре. Окончание набухания полимерных микросфер наблюдали визуально. Затем смесь диспергировали в изопропаноле, содержащем 2% мас. алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида, выдерживали в течение 15 минут, затем центрифугировали для выделения образовавшегося осадка, состоящего из полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.
[25]К 1,5 г толуольного раствора квантовых точек (концентрация квантовых точек 0,5 г/л), содержащего 0,03 г (2% мас.) алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида (катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания), добавляли 1,5 г полистирольных микросфер диаметром 6,0 мкм. Полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, затем выдерживали в течение 5 часов при комнатной температуре. Окончание набухания полимерных микросфер наблюдали визуально. Затем смесь диспергировали в этаноле, содержащем 2% мас. алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида, выдерживали в течение 15 минут, затем центрифугировали для выделения образовавшегося осадка, состоящего из полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.
[26]После осаждения квантовых точек процедура набухания-осаждения может повторяться многократно для достижения необходимой концентрации квантовых точек на поверхности. Чем меньше концентрация квантовых точек в исходном растворе, тем большее количество стадий осаждения необходимо провести. Это увеличивает время получения продукта, но позволяет добиться равномерного распределения квантовых точек на поверхности микросферы.
[27]Процент включения квантовых точек определяли по сравнению интенсивностей флуоресценций суспензии полимерных микросфер с квантовыми точками на поверхности и остаточных квантовых точек в супернатанте. Для этих исследований использовался спектрометр. Доля иммобилизованных квантовых точек составляла от 70% до 90%.
[28]С помощью микроскопа марки «Levenhuk D670T» было визуально установлено, что полученные полимерные микросферы с иммобилизованными на их поверхности квантовыми точками устойчивы к агрегации. На фиг. 1 показана флуоресценция полимерных микросфер, содержащих квантовые точки, полученных по примеру 3.
[29]Разработанный способ позволяет использовать полимерные микросферы требуемого размера в соответствии с областью применения получаемого продукта. Отличительной особенностью заявленного способа является то, что могут использоваться полимерные микросферы с различным диаметром частиц в интервале от 0,1 до 10,0 мкм с узким распределением частиц по размерам, полученные, например, способами, описанными в уровне техники [13-16].
[31]1. Волкова Е.В. / Создание диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер / Автореф. дис. на соиск. учен, степ. канд. хим. наук / М. - 2014.
[32]2. Грицкова И.А. и др. Биотест-системы на основе полимерных микросфер // Вестник МИТХТ / 2006, Т. 2, С. 5-21.
[33]3. P. Tallury, K. Payton, S. Santra. / Silica-based multimodal / multifunctional nanoparticles for bioimaging and biosensing applications / Nanomedicine, 2008, Vol. 3, P. 579-592.
[34]4. Сизова C.B. / Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов / Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. хим. Наук / М. - 2009.
[35]5. Патент РФ №2532559.
[36]6. Синтез опалоподобных структур на основе монодисперсных люминофор-содержащих полимерных частиц / Сборник трудов Всероссийской молодежной конференции «Опалоподобные структуры», Санкт-Петербург - 2012, С. 15-19.
[37]7. Здобнова Т.А. и др. / Квантовые точки для молекулярной диагностики опухолей / ACTA NATURAE, 2011, Т. 3, №1 (8), С. 30-50.
[38]8. Ralph A Tripp et al. / Bioconjugated nanoparticle detection of respiratory syncytial virus infection / International Journal of Nanomedicine, 2007, Vol. 2, N3, P. 117-124.
[39]9. Byron Ballou et al. / Imaging Vasculature and Lymphatic Flow in Mice Using Quantum Dots / Methods in Molecular Biology, 2009, Vol. 574, P. 63-74.
[40]10. Олейников В.A. / Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах (обзорная статья) / Биоорганическая химия, 2011, Т. 37, №2, С. 171-189.
[41]11. Yang X et al. / Encapsulation of quantum nanodots in polystyrene and silica micro-nanoparticles / Langmuir, 2004, Vol. 20, P. 6071-6073.
[42]12. Генералова A.H. и др. / Синтез субмикронных сополимерных (акролеин/стирол) микросфер, содержащих флуоресцентные полупроводниковые CdSe/ZnS нанокристаллы / Российские нанотехнологии, 2007, Т. 2, №7-8, С. 144-154.
[43]13. Патент РФ №2459834.
[44]14. Грицкова И.А. и др. / Разработка полимерных микросфер для иммунофлуоресцентного анализа / Биотехнология, 2012, №4, С. 74-80.
[45]15. Чадаев П.Н. / Полимерные микросферы в качестве антистатических компонентов защитных слоев фотографических материалов / Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. хим. наук / М. - 2011.
[46]16. Злыднева Л.Ю. / Гетерофазная полимеризация виниловых мономеров в присутствии кремнийорганических ПАВ различной природы / Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. хим. наук / М. - 2013.
