[2]Известны многочисленные примеры использования иммунохроматографических тест-систем для детектирования аналитов (ЕР 0890103 В1; ЕР 1046913 А2; US 50968375238; US 5238652…). Подобные примеры описаны также в книге "Lateral flow immunoassay" R.C.Wong, H.Y. Tse, eds., Humana Press N-Y, 2009. В этих примерах в качестве дисперсной фазы для конъюгирования антител (антигенов) используют наночастицы (диаметр 5-80 нм) золота, окрашенные или флуоресцирующие полимерные частицы субмикронного размера (СА 2049919), наночастицы полупроводниковых материалов, способных к люминесценции (US 2006/0008921).
[3]Наиболее близкий аналог (прототип) предлагаемого изобретения описан в патенте ЕР 0890103 В1 "Quantitative immunochromatographic assay". В приспособлении, для проведения иммунохроматографического анализа, описанном в прототипе, предполагается, что мембрана для конъюгата содержит привнесенные в нее искусственно микрочастицы, такие как: коллоидные частицы металлов, молекулы органических соединений, липосомы, или органические полимерные латексные частицы. Указанные частицы связаны с детектирующим антителом, способным к связыванию с аналитом.
[4]В процессе иммунохроматографического анализа жидкая проба, содержащая аналит, взаимодействует с антителами микрочастиц, образованные комплексы аналита и микрочастиц капиллярным током жидкости увлекаются по аналитической мембране к узкой аналитической зоне, в которой находятся антитела захвата, останавливающие микрочастицы, связанные с аналитом, образуя при этом окрашенный или люминесцирующий комплекс.
[5]Указанный метод анализа на наш взгляд имеет, по меньшей мере, два недостатка.
[6]I. Коллоидные частицы металлов, молекулы органических соединений и, особенно, липосомы или органические полимерные латексные частицы дороги в изготовлении, требуют сложных методик синтеза самих частиц, трудоемких химических методик привнесения функциональных групп на поверхность для последующего связывания с антителами (антигенами).
[7]II. Скорость миграции по аналитической мембране комплекса аналит-микрочастицы и скорость формирования аналитического сигнала лимитируется конвекцией и диффузией в мембране [S.Qian, H.H.Bau. A mathematical model of lateral flow bioreactions applied to sandwich assays. / Analytical Biochemistry 2003, v.333, pp.89-98]. Коэффициент диффузии в мембранах с идентичными физическими свойствами зависит от гидродинамического радиуса комплекса микрочастиц с аналитом и вязкости элюирующего растворителя. Типичные времена формирования аналитической зоны при использовании микрочастиц коллоидного золота средним диаметром 35 нм, в мембранах с различной скоростью капиллярного течения (например, Millipor HF120 и Millipor HF240), при комнатной температуре, составляют от 20 до 45 мин.
[8]Кроме того, микрочастицы (особенно частицы полимерных латексов и липосом) обладают способностью к агрегации, что вызывает уменьшение скорости миграции последних. Об этой проблеме и способах ее преодоления говорится в патенте СА 2049919.
[9]При проведении иммунохроматографии фронт элюирующего растворителя на мембране опережает фронт распространения комплекса микрочастиц с аналитом, что приводит к неравномерному движению окрашенных (люминесцирующих) комплексов и их агрегатов по аналитической мембране, понижая контраст между микрочастицами на мембране и микрочастицами в аналитической зоне, понижая тем самым и чувствительность анализа. Предлагаемая нами дисперсная фаза гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III) лишена указанных недостатков. Указанная дисперсная фаза обладает следующими преимуществами:
[10]- Стоимость исходных материалов для ее получения и сам конечный продукт менее дорогостоящи, чем окрашенные или флуоресцирующие полимерные латексы, коллоиды металлов (золота), липосомы.
[11]- Процесс синтеза гидрозоля гексацианферрата (II) железа (III) весьма прост, нетрудоемок и хорошо воспроизводим.
[12]- Обладает хорошо развитой поверхностью и способностью к адсорбционному связыванию антител и антигенов, как белкового, так и липополисахаридного характера.
[13]- Движение комплекса микрочастиц с аналитом по иммунохроматографической мембране происходит равномерно, одновременно с фронтом элюирующего растворителя. Типичное время прохождения иммунохроматографического процесса на мембранах Millipor HF120 составляет от 2 до 15 мин. Это в несколько раз быстрее, чем для иммунохроматографии с применением других микрочастиц. Из-за равномерного движения дисперсной фазы иммунохроматографическая мембрана вне аналитической зоны практически не окрашивается, в аналитической зоне образуются высококонтрастные полосы ярко-синего цвета, делая анализ чувствительнее.
[14]Цель изобретения - детектирование аналитов в исследуемом образце за более короткое время и с более высокой чувствительностью.
[15]Технический результат: обеспечивается ускорение процедуры иммунохроматографического анализа, по сравнению с используемыми традиционно в качестве дисперсной фазы золями золота, окрашенных полимерных латексов или квантовых точек, обеспечивается повышение контраста между аналитической зоной и белой поверхностью мембраны.
[16]Заявленный технический результат достигается за счет того, что способ проведения иммунохроматографического анализа для детектирования аналитов в образце, включающий создание мультимембранного композита, состоящего из мембраны для нанесения образца, мембраны для конъюгата, аналитической мембраны и мембраны для впитывания образца, содержащего сухой конъюгат дисперсной фазы с антителом (антигеном) к одному из антигенных эпитопов аналита, нанесение иммунореагента (второго антитела к другому антигенному эпитопу аналита, либо антигена) на аналитическую мембрану в виде узкой зоны, проведение иммунохимической реакции и отделение иммунохимического комплекса одновременно в процессе хроматографической миграции на поверхности аналитической мембраны, отличается тем, что в качестве дисперсной фазы для конъюгирования первого антитела (антигена) используют гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III).
[17]Сущность изобретения заключается в том, что в иммунохроматографическом анализе используют в качестве дисперсной фазы гидрозоль гексацианферрата (II) железа (III), конъюгированную с антителами (антигенами) к искомому аналиту. Проводят иммунохроматографический анализ, о наличии аналита судят по появлению на аналитической мембране окрашенной в ярко-синий цвет полосы.
[18]Способ осуществляется следующим образом.
[19]При осуществлении способа получают конъюгат частиц гидрозоля гексацианоферрата (II) железа (III) (ГЦФЖ; другое наименование этого соединения - «берлинская лазурь») с антителами к аналиту (антигену), либо с антигеном к исследуемому аналиту (антителам), наносят конъюгат на конъюгатную мембрану с последующим высушиванием, наносят второе антитело к антигенному эпитопу аналита, либо антигена на аналитическую мембрану, в виде узкой полосы в аналитической зоне, формируют мультимембранный композит, проводят иммунохимическую реакцию на поверхности аналитической мембраны, с последующим определением исследуемого аналита (антигена, либо антител) по появлению окрашенной полосы в аналитической зоне. Содержание аналита в исследуемом образце пропорционально количеству образовавшихся комплексов конъюгата частиц гидрозоля ГЦФЖ с аналитом, захваченных в аналитической зоне. Частицы гидрозоля ГЦФЖ окрашены в ярко-синий цвет, интенсивность окраски полосы аналитической зоны пропорциональна количеству аналита в образце.
[21]Пример 1. Получение конъюгатов гидрозоля ГЦФЖ с антителами, либо с антигенами
[22]Гидрозольные препараты ГЦФЖ получают при смешивании растворов хлорного железа и железисто-синеродистого калия в воде.
[23]Для сенсибилизации поверхности частиц гидрозоля ГЦФЖ антителами, либо антигенами к препарату гидрозоля добавляют водный раствор, содержащий иммунный компонент, смесь инкубируют на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре и добавляют бычий сывороточный альбумин (БСА) до конечной концентрации 0,1%. Через 2 мин инкубации при тех же условиях смесь центрифугируют при 50000-60000 xg в течение 30 мин. Осадок суспендируют в 0,1% растворе БСА. Суспензию повторно центрифугируют в тех же условиях. Осадок суспендируют в 0,1% растворе БСА. Определяют длину волны поглощения в максимуме и величину оптической плотности (ОП) в максимуме на спектрофотометре. С помощью раствора состава 5% сахарозы, 0,25% БСА готовят суспензии гидрозоля с плотностью (ОП), равной 3,0 в максимуме поглощения, и наносят ее на мембрану для конъюгата. Указанную мембрану высушивают не менее суток в помещении с относительной влажностью воздуха от 20 до 30% и температуре плюс 20°C - плюс 25°C.
[24]Пример 2. Создание мультимембранного композита
[25]Сборку композита (фиг.1) осуществляют при относительной влажности воздуха в пределах от 20 до 30% при температуре от 20 до 25°C.
[26]На нитроцеллюлозную мембрану (3) в область аналитической зоны в виде узкой полосы (4) наносят растворы антител к антигенным эпитопам аналита, либо антигена (при определении в качестве аналита антител). В область контрольной зоны (5) наносят антивидовые поликлональные, либо моноклональные антитела.
[27]На ламинатную подложку нитроцеллюлозной мембраны (6) наклеивают высушенную конъюгатную мембрану (2) с нанесенным конъюгатом с ОП=3,0 и мембрану (1) для нанесения образца. С противоположной стороны, на ламинатную подложку нитроцеллюлозной мембраны наклеивают мембрану для впитывания образца (7). Собранный мультимембранный композит нарезают на полоски шириной 5 мм, и длиной 60 мм, которые помещают в пластиковые оправки (фиг.2), верхняя поверхность которых имеет отверстие для нанесения образца (S) и отверстие для считывания результатов анализа, обозначенное буквами Т и С.
[28]Пример 3. Определение холерного экзотоксина (XT)
[29]Используют мультимембранный композит (пример 2), в аналитическую зону которого нанесены поликлональные кроличьи антитела к XT, в контрольную зону нанесены козьи антикроличьи антитела, конъюгатная подложка содержит конъюгат частиц гидрозоля ГЦФЖ с антителами к XT. В отверстие для нанесения образца вносят 120 мкл раствора, содержащего 1% твин 20 и 1% БСА, или XT, в том же растворе.
[30]Введение в отверстие для нанесения образца 120 мкл раствора 1% твин 20 и 1% БСА приводит к появлению интенсивной полосы синего цвета в контрольной зоне и ее отсутствию в зоне аналитической полосы (фиг.3А), что свидетельствует об отсутствии неспецифического взаимодействия конъюгатов частиц гидрозоля ГЦФЖ, содержащих антитела к XT, с антихолерогенными антителами и компонентами сыворотки крови, нанесенными в аналитическую зону.
[31]Введение в исследуемый образец XT (источник - холерная вакцина) приводит к появлению на мембране двух полос синего цвета: в области аналитической (8) и контрольной (9) зон (фиг.3Б). Интенсивность сигнала в аналитической зоне повышается с увеличением концентрации аналита в пробе и времени анализа. Диапазон измеряемых концентраций XT от 2,0 до 500 мкг/мл исходного раствора по белку. График зависимости интенсивности окрашивания контрольной зоны от концентрации XT в пробе приведен на фиг.4. Время анализа 2-15 мин. Оценку интенсивности сигнала в аналитической зоне проводят визуально или регистрируют с помощью анализатора видеоцифрового «Рефлеком».
[32]Если при введении в отверстие для нанесения образца анализируемых растворов не образуется окрашенных линий (фиг.2В), то такая тест-система считается непригодной, а результаты ее не учитываются.
[33]Пример 4. Определение в образце сыворотки крови титра антител к возбудителю сальмонеллеза
[34]Используют мультимембранный композит (полученный по примеру 2), в аналитическую зону которого нанесен препарат липополисахарида (ЛПС) Salmonella typhimurium, в контрольную зону нанесены моноклональные антитела к O-антигену сальмонелл группы В, конъюгатная подложка содержит конъюгат частиц гидрозоля ГЦФЖ с сорбированным ЛПС к S. typhimurium с ОП=3,0. Для получения конъюгата используют растворы ЛПС с концентрацией 50 нг/мл и 200 нг/мл.
[35]На растворе, содержащем 1% твин 20 и 1% БСА, готовят ряд последовательных рабочих разведений антисыворотки kS.typhimurium от 1:20 до 1:10 240.
[36]Введение в отверстие для образца 120 мкл раствора, состоящего из 1% твин 20 и 1% БСА, приводит к появлению в области контрольной зоны полосы синего цвета при отсутствии окрашенной полосы в области аналитической зоны.
[37]Введение в указанную выше смесь AT к возбудителю сальмонеллеза, приводит к появлению в аналитической зоне полосы синего цвета, интенсивность которой зависит от уровня специфических AT и времени реакции. Диапазон измеряемых титров AT к возбудителю сальмонеллеза от 1:20 до 1:5120. На фиг.5 приведен график зависимости интенсивности окрашивания аналитической зоны от разведения антител к возбудителю сальмонеллеза. Время анализа 1-15 мин. Оценку интенсивности сигнала в аналитической зоне проводят визуально или регистрируют с помощью анализатора видеоцифрового «Рефлеком».
[38]Пример 5. Определение в образце сыворотки (плазмы) крови человека антител к возбудителю туберкулеза
[39]Используют мультимембранный композит (полученный по примеру 2), в аналитическую зону которого нанесен препарат рекомбинантного антигена - гликопротеинового комплекса Mycobacterium tuberculosis H37Rv, в контрольную зону нанесены козьи кроличьи антитела, конъюгатная подложка содержит конъюгат частиц гидрозоля ГЦФЖ с ОП=3,0 с сорбированными кроличьими антителами к сумме иммуноглобулинов человека классов (IgG+IgM+IgA). На растворе, содержащем 1% твин 20 и 1% БСА, готовят ряд последовательных рабочих разведений сыворотки (плазмы) крови человека от 1:2 до 1:10, предположительно содержащих антитела к возбудителю туберкулеза
[40]Введение в отверстие для образца 120 мкл раствора, состоящего из 1% твин 20 и 1% БСА, приводит к появлению в области контрольной зоны полосы синего цвета при отсутствии окрашенной полосы в области аналитической зоны (фиг.2Б), что свидетельствует об отсутствии в исследуемом образце антител к возбудителю туберкулеза. Введение в отверстие для образца 120 мкл раствора, состоящего из 1% твин 20 и 1% БСА и содержащего сыворотку (плазму) крови человека, больного туберкулезом, приводит к появлению в аналитической зоне двух полос синего цвета (фиг.2А), интенсивность которых зависит от уровня специфических AT и времени реакции. Время анализа 1-15 мин. Регистрацию результатов проводят визуально, либо при помощи прибора «Рефлеком». Если при введении в отверстие для нанесения образца анализируемых растворов не образуется окрашенных линий (фиг.2В), то такая тест-система считается непригодной, а результаты ее не учитываются.
[41]Пример 6. Определение времени достижения максимального аналитического сигнала при использовании в качестве дисперсной фазы гидрозоля ГЦФЖ и коллоидного золота на примере регистрации XT.
[42]Пример иллюстрирует уменьшение времени анализа одного и того же аналита, при прочих равных условиях.
[43]Получали мультимембранный композит с ГЦФЖ (как описано в примере 2) и мультимембранный композит с коллоидным золотом.
[44]Для получения конъюгатов частиц коллоидного золота с антителами к XT к препарату коллоидного золота добавляют водный раствор, содержащий антихолерогенные антитела, смесь инкубируют на магнитной мешалке в течение 10 мин при комнатной температуре и добавляют БСА до конечной концентрации 0,1%. Через 1 мин инкубации в тех же условиях смесь центрифугируют при 50000 × g в течение 30 мин. Суспензию два раза промывают раствором, содержащим 10% сахарозу и 0,25% БСА, каждый раз осаждая частицы центрифугированием в тех же условиях. Осадок суспендируют в 0,02 М фосфатном буфере pH 7,9, содержащем 10% сахарозу и 0,25% БСА. Определяют длину волны поглощения в максимуме и величину ОП в максимуме на спектрофотометре. С помощью того же буферного раствора готовят суспензию золя золота с ОП, равной 3,0 в максимуме поглощения, и наносят ее на мембрану для конъюгата. Мембрану высушивают, как описано в примере 1. Сборку мультимембранного композита осуществляют, как описано в примере 2.
[45]В отверстие для нанесения образца оправки, содержащей конъюгат частиц коллоидного золота с антихолерогенными антителами, вносят 120 мкл раствора XT, приготовленного на 0,1 М фосфатном буферном растворе pH 7,9, содержащем 0,5% БСА и 0,4% твин 20.
[46]XT определяют, как описано в примере 3. Интенсивность сигналов в аналитической зоне регистрируют с помощью видеоцифрового анализатора «Рефлеком». График зависимости интенсивности сигнала в аналитической зоне от времени анализа приведен на фиг.6. При использовании в качестве дисперсной фазы гидрозоля ГЦФЖ максимальный сигнал в зоне аналитической полосы появляется через 5 мин после внесения образца. При применении конъюгатов золя золота для достижения максимального аналитического ответа требуется более длительное время (более 40 мин).
[47]Для всех описанных выше примеров характерна быстрота перемещения частиц конъюгата гидрозоля ГЦФЖ по нитроцеллюлозной мембране и появления окрашенных полос в аналитической и контрольной зонах, что отличает иммунохроматографические тесты с использованием гидрозольных препаратов ГЦФЖ от иммунохроматографических тестов на основе золей золота, для которых время анализа составляет 15-40 мин. При высоких концентрациях аналита видимый глазом сигнал появлялся через 1-2 мин после введения образца. Частицы гидрозоля ГЦФЖ, сенсибилизированные антителами или антигеном, проходили через аналитическую мембрану ровным фронтом, практически не давая «подтеков» и «наплывов». Фон аналитической мембраны был от белого до светло-голубого, сформированные линии в аналитической и контрольной зонах отличались хорошим контрастом.
[48]Повышение контраста между аналитической зоной и белой поверхностью мембраны обеспечивается за счет более полного удаления окрашивающего гидрозоля гексацианферрата (II) железа (III) и, как следствие, улучшение визуальной или приборной регистрации результатов анализа.
