Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и медицины, в частности к новым ПЭГилированным производным факторов эритропоэза, и касается создания новых молекул конъюгатов низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающих эритропоэз-стимулирующей активностью, не вызывающих резкого снижения глюкозы, с улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими параметрами общей формулы (I) или (II). 7 н. и 21 з.п. ф-лы, 13 ил., 6 табл., 21 пр.

1. Конъюгат низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающий эритропоэз-стимулирующей активностью, пролонгированным действием и не вызывающий резкого снижения глюкозы в крови, формулы (I)

где n - целые значения от 568 до 796;

m – целое число = 4;

дЭПО-нс – низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных олигосахаридных структур.

2. Конъюгат по п.1, в котором низкосиалированный дарбепоетин представляет собой природный или рекомбинантный дарбепоетин.

3. Конъюгат по п.1, в котором полиэтиленгликоль имеет линейную структуру с молекулярной массой от 25 до 35 кДа.

4. Конъюгат по п.1, в котором N-концевая группа представлена остатком аланина (ALA).

5. Конъюгат низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающий эритропоэз-стимулирующей активностью и пролонгированным действием, формулы (II):

где n - целые значения от 284 до 398;

дЭПО-нс – низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных олигосахаридных структур.

6. Конъюгат по п.5, в котором низкосиалированный дарбепоетин представляет собой природный или рекомбинантный дарбепоетин.

7. Конъюгат по п.5, в котором полиэтиленгликоль имеет разветвленную структуру с молекулярной массой от 35 до 45 кДа.

8. Фармацевтическая композиция, обладающая эритропоэз-стимулирующей активностью, не вызывающая резкого снижения уровня глюкозы, содержащая конъюгат по п. 1 или конъюгат по п. 5 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8 для применения в качестве лекарственного средства для лечения и профилактики различных анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО.

10. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с хронической почечной недостаточностью.

11. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с цитостатической химиотерапией.

12. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с массивной кровопотерью различного генеза.

13. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с химиотерапией вирусных заболеваний.

14. Лекарственное средство, включающее конъюгат по п. 1 или конъюгат по п. 2, обладающее эритропоэз-стимулирующей активностью.

15. Лекарственное средство, по п. 14, включающее буфер, изотонирующий агент, антиокислитель, стабилизатор и воду.

16. Лекарственное средство по п. 14, включающее натрия фосфат, или гистидин, натрий хлористый, и/или маннитол, и/или сорбитол, полисорбат 80 или полисорбат 20, ЭДТА, метинонин, воду для инъекций.

17. Применение конъюгата по п. 1 или конъюгата по п. 5 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы.

18. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, ассоциированных с хронической почечной недостаточностью.

19. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, ассоциированных с цитостатической терапией.

20. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, вызванных массивной кровопотерью различного генеза.

21. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, ассоциированных с терапией вирусных заболеваний.

22. Способ профилактики и/или лечения анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата по п. 1 или 5.

23. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с хронической почечной недостаточностью.

24. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с цитостатической терапией.

25. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с массивными кровопотерями различного генеза.

26. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с ассоциированных с терапией вирусных заболеваний.

27. Набор для лечения анемий, включающий фармацевтическую композицию по п.8 и инструкцию по применению.

28. Набор по п.27, где фармацевтическая композиция содержится в контейнере, герметично запаянном в стерильных условиях.

Изобретение относится к фармацевтике и медицине, а именно к новым биологически активным конъюгатам фактора эритропоэза с пролонгированным действием, в частности к новым конъюгатам дарбепоетина с полиэтиленгликолем, которые могут быть использованы в медицине, например, для лечения и профилактики целого ряда анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, в том числе для лечения анемий, ассоциированных с хронической почечной недостаточностью, цитостатической химиотерапией и терапией вирусных заболеваний, и анемий, вызванных массивными кровопотерями различного генеза и вирусными заболеваниями.

В настоящее время для лечения анемий различного генеза используют рекомбинантные препараты эритропоетина (ЭПО) и дарбепоетина (дЭПО). Рекомбинантный ЭПО по своей структуре идентичен природному ЭПО человека и представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа. Молекула ЭПО состоит из 165 аминокислотных остатка и содержит три сайта N-гликозилирования по остаткам аспарагина в положении 24, 38 и 83 и один сайт О-гликозилирования по серину в положении 126 [1-2] Терминальное положение олигосахаридов занимают остатки сиаловой кислоты, от содержания которых зависят стабильность и функциональная активность ЭПО in vivo [3-4].

Для получения рекомбинантных белков с корректным гликозилированием обычно применяют клетки яичников китайского хомячка (СНО), трансформированные целевым геном [5]. Рекомбинантный человеческий ЭПО, продуцируемый клетками СНО, представляет собой смесь из 14 изоформ, различающихся по содержанию сиаловых кислот, так что одна молекула белка может содержать от 0 до 14 остатков сиаловых кислот. Изоформы ЭПО, не содержащие сиаловой кислоты (асиало-ЭПО), более эффективно связываются с клеточным рецептором ЭПО in vitro [5], однако их функциональная активность in vivo намного ниже из быстрого выведения асиало-ЭПО из организма в результате взаимодействия с асиалогликопротеин-связывающим белком печени [6-7]. Изоформы ЭПО, содержащие максимальное количество остатков сиаловой кислоты, обладают более высокой активностью in vivo и терапевтической ценностью, поскольку наличие сиаловой кислоты предотвращает быстрый клиренс молекул сиалированных молекул ЭПО из организма. Функциональная активность ЭПО in vivo прямо пропорциональна содержанию сиаловых кислот [7].

Для получения более стабильного фактора эритропоэза был создан гипергликозилированный аналог человеческого ЭПО (novel erythropoiesis stimulating protein,NESP) - рекомбинантный дарбепоетин [8]. По сравнению с природным ЭПО, молекула дарбепоетина (дЭПО) содержит пять аминокислотных замен (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn и Pro90Thr). Молекула дЭПО имеет 5 сайтов N-гликозилирования по аспарарагинам в положении 24, 30, 38, 83 и 88 один сайт О-гликозилирования по серину в положении 126, так что, по сравнению с ЭПО, максимально возможное количество остатков сиаловых кислот на молекулу белка увеличилось с 14 до 22. Белок дЭПО, состоящий из изоформ 18-22, получил название дарбепоетин-альфа (дЭПО-альфа). По сравнению с ЭПО, эффективность связывания дЭПО-альфа с рецептором ЭПО на клетках in vitro меньше, однако, in vivo препарат дЭПО-альфа является более стабильным и обладает улучшенными фармакокинетическими характеристиками по сравнению с ЭПО. Общий клиренс препарата дЭПО значительно меньше, чем у ЭПО, в результате время полувыведения дЭПО из крови больных в три раза выше чем у ЭПО.

Рекомбинантный дЭПО-альфа получают из трансформированных клеток СНО, несущих ген дарбепоетина. Синтезируемый в клетках дЭПО представляет собой гетерогенную смесь изомеров, отличающихся по содержанию сиаловых кислот. Количество молекул сиаловых кислот на молекулу белка варьирует от 0 до 22. Содержание высокосиалированных изоформ (18-22) варьирует от 5 30% в зависимости от используемых клеток и условий культивирования. Суммарную смесь изоформ дЭПО фракционируют методом ионной хроматографии, и высокосиалированные очищенные изоформы 18-22 используют для получения дЭПО-альфа. Низкосиалированные изоформы дарбепоетина (дЭПО-нс), составляющие не менее 50% синтезированного белка дЭПО, не используют.

В клинической практике препарат Аранесп на основе дЭПО-альфа в основном используется для лечения различных анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, в основном анемии, ассоциированной с хронической почечной недостаточностью.

Однако, применяемые факторы эритропоэза обладают рядом негативных побочных действий. Так, например, показано, что введение препаратов на основе ЭПО и дЭПО-альфа приводит к снижению уровня глюкозы в крови пациентов [9-12].

Кроме того, следует отметить, что терапевтическая эффективность препаратов, стимулирующих эритропоэз, может быть повышена при использовании препаратов более пролонгированного действия, например, на основе ПЭГилированных ЭПО/дЭПО, в которых нативная молекула белка химически связана с полиэтиленгликолем [13-17] или на основе гибридных белков ЭПО/дЭПО, слитых с Fc-фрагметом иммуноглобулина или синтетическим пептидом [18].

Известно, что использование пролонгированных белковых препаратов приводит к улучшению фармакокинетики, повышению стабильности, увеличению времени полувыведения из крови, снижению колебаний концентрации в крови, увеличению активности in vivo. Среди пролонгированных форм терапевтических белков, ПЭГилированные препараты являются наиболее распространенными. Известны конъюгаты терапевтических цитокинов с ПЭГ, которые успешно применяются в клинике для лечения различных заболеваний [19].

Следует отметить, что каждая новая по структуре молекула ПЭГилированного белка будет обладать уникальными биологическими и физико-химическими свойствами. Причем, предсказать каким образом будут меняться свойства получаемых ПЭГилированных белков - невозможно. Также невозможно теоретически предсказать степень и направленность (отрицательное, положительное) влияния ПЭГилирования - на свойства полученных конъюгатов [19-23], которые могут обеспечить наиболее эффективный терапевтический эффект ПЭГилированного белка без негативных побочных действиях при последующем применении в клинической практике.

Из уровня техники известны различные конъюгаты ПЭГ с ЭПО и дЭПО.

Так, в работах [14, 24] описан конъюгат рекомбинантного ЭПО, в котором ПЭГ присоединен к эритропоэтину посредством ароматической азогруппы. Использованный ПЭГ, содержащий ароматическую азогруппу, связывается с белком по аминокислотным остаткам тирозина и гистидина [24]. Полученный конъюгат обладал биологической активностью, однако, в приведенных примерах нет данных о молекулярной массе использованных ПЭГ.

В работах [13, 25-26] описаны конъюгаты различных производных ЭПО с ПЭГ через бифункциональный линкер который сначала связывался со свободными аминогруппами белка через стабильную амидную связь, образуя промежуточный продукт, который через SH-группу линкера затем связывался с активированными йодацетилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ-винилсульфон и метокси-ПЭГ-малеимид. Молекулярная масса использованных ПЭГ варьировала от 20 до 40 кДа. Для получения моноПЭГилированного ЭПО реакционную смесь подвергали двух этапной хроматографии на колонке с катионообменным сорбентом. Полученные конъюгаты моноПЭГилированного ЭПО обладали пролонгированным действием и сохраняли биологическую активность in vivo. Недостатком описанной технологии является сложная двухэтапная технология, реализация которой требует дорогостоящих ресурсов.

В работе [27] описаны конъюгаты ПЭГ-ЭПО, в котором ПЭГ с молекулярной массой 12 кДа, содержащий различные активированные группы (SC-PEG, SS-PEG, PEG-imidate или mPEG- cyanuric chloride) связывались с ЭПО через доступные NH₂-группы белка, в частности через N-концевую альфа-аминогруппу и эпсилон аминогруппы лизинов в положении 52, 116 и 154 с образованием карбаматной связи. Реакцию ПЭГилирования проводили при рН 6.5-7.5. В зависимости от условий проведения реакции менялось соотношение различных позиционных изомеров в полученных конъюгатах. Полученные конъюгаты обладали биологической активность и пролонгированным действием. Недостаком предложенной модификации является использование активированных ПЭГ с низкой молекулярной массой, которые обладали способностью связываться с различными участками белка, что приводило к появлению в полученных конъюгатов нескольких позиционных изомеров.

В работах [15, 28-29] описан конъюгат ПЭГ сЭПО, полученный с использованием сукцинимидиловых производных ПЭГ (SBA-PEG и SPA-PEG) с молекулярной массой 30 кДа, которые способны взаимодействовать со свободными аминогруппами белка с образованием амидной связи. Реакция ПЭГилирования проходила при рН 7,5. Содержание модифицированного ПЭГ достигало 75%, моноПЭГилированный ЭПО составлял 30-40% , и 25-38% приходилось на нецелевые диПЭГилированные молекулы.

В работах [30-32] описаны конъюгаты ПЭГ-дЭПО, содержащие гликоПЭГилированный ЭПО. В описанных конъюгатах связывание ПЭГ с молекулой ЭПО проводили через нативные или окисленные углеводные остатки с использованием ряда ферментов. ПЭГилирование проводили в условиях 250 кратного избытка ПЭГ (EAPO 007812). Данные о выходе и чистоте получаемого целевого моноПЭГилированного конъюгата - не указаны. Показано, что полученные конъюгаты ПЭГ-ЭПО [30-31] обладали пролонгированным действием, по сравнению с немодифицированным ЭПО и гипергликозилированным ЭПО. Недостатками получения описанных конъюгатов является использование дорогостоящих ферментов и проведение реакции в условиях чрезмерного избытка дорогостоящего ПЭГ.

В работе [33] описана конъюгация ЭПО с ПЭГ с молекулярной массой 400-4000 Да при помощи ионизирующего излучения. Описанные конъюгаты обладали специфической активностью. Недостатками полученных конъюгатов является использование ПЭГ с низкой молекулярной массой, поскольку ранее было показано, что присоединение к белку ПЭГ с молекулярной массой менее 5 кДа практически не влияет на фармакокинетические свойства получаемых конъюгатов [34].

В работе [16] описана конъюгация ЭПО с дендример подобным ПЭГ (четырехразветвленным). Описанный конъюгат обладал улучшенной стабильностью по сравнению с немодифицированным ЭПО. Данных о пролонгированных свойствах и биологической активности полученного конъюгата ПЭГ-ЭПО- не представлены.

В работе [35] описаны варианты конъюгатов фрагментов ЭПО и мутированных вариантов ЭПО с NHS-производными ПЭГ. Полученные конъюгаты обладали специфической активностью, однако их фармакокинетические свойства в патенте - не представлены. Недостатком полученных конъюгатов является использование фрагментов ЭПО и мутантных форм ЭПО, первичная структура которых отличается от природного ЭПО, что может увеличивать иммуногенность таких конъюгатов при клиническом применении.

В работе[36] описано ПЭГилирование различных вариантов негликозилированного ЭПО. Недостатками полученных конъюгатов является использование рекомбинантного ЭПО, полученного из клеток E. coli и обладающего низкой биологической активностью in vivo.

В работе[37] описано получение конъюгатов ПЭГ с N-концевым фрагментом или с мутантной формой ЭПО. Связывание ПЭГ проводили прямо по амино или опосредованно через тиололовые группу белка. Полученные конъюгаты очищали от продуктов реакции при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Недостатком полученных конъюгатов является использование мутантных форм белка и двухэтапной технологии ПЭГилирования.

Прототипом для настоящего изобретения является конъюгат ПЭГ с молекулой дЭПО, описанный в работах [38-39]. Для реакции ПЭГилирования использовали препарат дЭПО-альфа и различные активированные мПЭГ, в частности мПЭГ-SPA, и мПЭГ-альдегид. Молекулярная масса присоединенных мПЭГ составляла 5 и 20 кДа. Наибольшую биологическую активность in vivo показали конъюгаты ПЭГ-дЭПО, полученные при использовании активированных мПЭГ-ALD и мПЭГ-SPA с молекулярной массой 20 кДа. Для очистки полученных конъюгатов использовали хроматографическую очистку в одну стадию с использованием ионообменной хроматографии. Реакцию дЭПО-альфа с мПЭГ-альдегидом проводили при рН 5 в условиях 5-20 кратного молярного избытка ПЭГ по отношению к дЭПО-альфа в течении 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией реакционной смеси при температуре 5°С Очищенный конъюгат содержал до 20% диПЭГилированных форм. Реакцию дЭПО-альфа с мПЭГ-SPA проводили при рН 8 в условиях 10-20 кратного молярного избытка ПЭГ по отношению к дЭПО-альфа в течение 1 часа при комнатной температуре. В экспериментах на животных полученные конъюгаты обладали улучшенными фармакокинетическими параметрами по сравнению с немодифицированным дЭПО-альфа. Недостатком является использование дЭПО-альфа, получение которого отличается высокой себестоимостью. Для получения дЭПО-альфа используют культуральную жидкость трансформированных клеток CHO, содержащую смесь изомеров дЭПО, с разным количеством сиаловых кислот на моль белка (от 0 до 22). Высокосиалированные изоформы дЭПО с содержанием сиаловых кислот от 18-22 моль/моль белка, используемые для получения дЭПО-альфа, обычно составляют 5-30% от синтезируемого в клетке белка. Низкосиалированные изоформы дЭПО (8-17), составлющие не менее 50% синтезированного дЭПО, не используют. Кроме того, дЭПО-альфа из за высокой степени сиалирования обладает более низкой аффинностью при связывании с клеточным рецептором ЭПР in vitro, чем низкосиалированные формы дЭПО. Присоединение молекулы ПЭГ к высоко сиализированному дЭПО-альфа будет приводит к дальнейшему снижению биологической активности in vitro.

Улучшение фармакокинетических параметров дЭПО с сохранением относительно высокой аффинности связывания с клеточным рецептором in vitro, может быть достигнуто за счет использования низкосиалированных форм дЭПО (дЭПО-нс), обладающих более высоким сродством к рецептору ЭПО in vitro. Конъюгирование таких форм дЭПО-нс с ПЭГ с большей молекулярной массой приведет к созданию новых молекул дЭПО с улучшенными терапевтическими свойствами за счет более эффективного связывания с рецептором, с одной стороны, и за счет более пролонгированного действием , с другой стороны. Более того, новые молекулы могут обладать биологическими свойствами, отличными от характеристик немодифицированного дЭПО.

Например, известно, что использование препаратов с эритропоэз-стимулирующим действием, в частности дЭПО, сопровождается выраженным побочным действием - снижением концентрации глюкозы в крови пациентов [9-12]. Возможность развития гипогликемии требует постоянного мониторинга уровня глюкозы в крови пациентов, и незамедлительной коррекции при его снижении.

Улучшение безопасности применения дЭПО в клинике может быть достигнуто за счет использования новых молекул дЭПО, не обладающих гипогликемическим действием.

Задача настоящего изобретения состояла в получении нового стабильного конъюгата ПЭГ и дЭПО-нс с улучшенными фармакокинетическими параметрами и улучшенной безопасностью за счет использования в составе конъюгата низкосиалированного дЭПО-нс и мПЭГ с молекулярной массой 30-40 кДа, пригодного для создания безопасного лекарственного препарата медицинского назначения, способствующего расширению арсенала лекарственных средств заданной направленности и фармацевтической композиции на основе полученного конъюгата ПЭГ-дЭПО-нс.

Поставленная задача решается созданием новых молекул функционально активных конъюгатов ПЭГ и дЭПО, обладающих эритропоэз-стимулирующей активностью с пролонгированным действием, не вызывающих выраженной гипогликемии, в которых линейная молекула ПЭГ с молекулярной массой 30 000 Да или разветвленная молекула ПЭГ с молекулярной массой 40 000 Да связана с низкосиалированной молекулой дЭПО стабильной связью через свободные аминогруппы белка, так, что общие формулы конъюгатов ПЭГ-дЭПО с линейным мПЭГ 30 000 Да и разветвленным мПЭГ-40000 Да представляют собой следующие соединения (I) и (II), соответственно:

где: n - целые значения от 568 до 796;

m - целое число ≥ 4;

дЭПО-нс - низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных структур

где n - целые значения от 284 до 398;

дЭПО-нс - низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных структур.

Новым по сравнению с прототипом является:

1. Для получения конъюгата ПЭГ-дЭПО использован низкосиалированный дарбепоетин (дЭПО-нс), содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных структур, функциональная активность которого in vitro (связывание с клеточным рецептором, определяющим пролиферационную активность дЭПО на клетках TF1,) в 4 раза выше, чем у дЭПО-альфа (в способе-прототипе использовали дЭПО-альфа);

2. Для получения конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс использовали различные активированные мПЭГи с молекулярной массой 30000 и 40000 Да (в способе-прототипе приведены примеры с использованием мПЭГ с молекулярной массой 5 и 20 кДа).

3. Структурная формула полученных конъюгата ПЭГ-дЭПО-нс.

4. Увеличение молекулярной массы конъюгатов ПЭГ-дЭПО за счет размера присоединенного ПЭГ;

5. Улучшенная безопасность заявляемых конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс, связанная с отсутствием резко выраженного гипогликемического эффекта.

6. Улучшенные фармакокинетические параметры заявляемых конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс по сравнению с немодифицированными дЭПО-нс и дЭПО-альфа.

Для получения заявляемых конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс был использован рекомбинантный низкосиалированный дЭПО (дЭПО-нс, производства ЗАО «Биокад») и бутиральдегидное производное мПЭГ формулы (III) с молекулярной массой 30000 Да или сукциниимидное производное мПЭГ формулы (IV)с молекулярной массой 40000 Да , соответственно.

где n - целые значения от 568 до 795;

m - целое число ≥ 3;

где n - целые значения от от 284 до 398;

Для получения конъюгата формулы (I), реакцию конъюгирования проводили при рН ниже 6.0 в присутствии восстанавливающего агента при температуре, равной или ниже 20°С в течении 20-24 часов. Молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 1,5-6/1. Для получения конъюгата формулы (II), реакцию конъюгирования проводили при рН выше 8,5 при температуре, равной или ниже 20°С в течение 4 часов. Молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 1,5-3/1 Контроль образования конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС) в восстанавливающих условиях и обратно-фазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Очистку конъюгатов моноПЭГ30-дЭПО-нс и моноПЭГ40-дЭПО-нс от продуктов реакции, немодифицированного дЭПО-нс и от нежелательных ПЭГилированныхформ дЭПО-нс, содержащих две и более молекулы ПЭГ на молекулу белка, проводили при помощи одноэтапной хроматографии на анионообменных сорбентах. Элюцию целевых фракций моноПЭГ-ДЭПО-нс проводили градиентом концентрации хлористого натрия от 0,05 до 0,2 М в буферном растворе с рН ниже 6. Очищенный препарат моноПЭГ-дЭПО диализовали против 1-20 мМ буферного раствора с рН 4-5, добавляли соли, или полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпирролидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и неионные детергенты и хранили в пластиковых или стеклянных флаконах с силиконизированной поверхностью при температуре 4-2°С.

Для характеристики полученных конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс исследовали его чистоту, гомогенность, физико-химические свойства, влияние на уровень глюкозы в крови при многократном введении, функциональную активность in vivo и in vitro и фармакокинетические параметры в сравнении с немодифицированным дЭПО-альфа и дЭПО-нс.

В качестве дЭПО-альфа использовали препарат Аранесп, производства Амджен Европа Б.В. лот 1042847 или препарат дЭПО-альфа, производства «ЗАО Биокад», серия 115061212Р. Распределение изоформ дЭПО-нс и дЭПО-альфа проводили в сравнении с эпоетином-альфа (ЭПО-альфа, препарат Эпрекс производства Янссен Фармацевтика НВ, серия SSC6100).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурами графического изображения, где представлены:

Фиг. 1. Анализ препаратов препаратов дЭПО-альфа (препарат Аранесп, Амджен Европа Б.В., лот 1042847), дЭПО-нс («ЗАО Биокад») и ЭПО-альфа (препарат Эпрекс, ) методом изоэлектрофокусирования.

Трек 1 - препарат ЭПО-альфа; Трек 2 - препарат дЭПО-нс, полученный по п.1; Трек 3 - препарат дЭПО-альфа (препарат Аранесп, Амджен Европа Б.В., лот 1042847.).

Фиг. 2. Содержание олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами в препаратах дЭПО-нс и дЭПО-альфа.

А - дЭПО-альфа (препарат Аранесп, Амджен Европа Б.В. лот 1042847); B-дЭПО-нс, полученный по п.1; 1-4 - олигосахаридные структуры: 1 - моносиалированные, 2 - дисиалированные, 3 - трисиалированные, 4 - тетрасиалированные.

Фиг. 3. Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vitro по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1. -!- дЭПО-нс; -,- дЭПО-альфа (ЗАО Биокад, ); -Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).

Фиг. 4. Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo. -!- дЭПО-нс; -,- дЭПО-альфа(ЗАО Биокад, ); -Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).

Фиг 5. Анализ кинетики образования конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс при проведении реакции с использованием бутиральдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 30000 Да методом ЭФ в 8% ПААГ в присутствии ДДС. Mr- стандарты молекулярных масс (HMW). Сверху указано время реакции в часах. Слева указаны молекулярные массы стандартов в кДа.

Фиг. 6. Электрофоретический анализ полученных конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс. Mr - стандарты молекулярных масс (HMW). Сбоку указаны молекулярные массы стандартов в кДа. Трек 1 - препарат дЭПО-нс, полученный по п.1; Трек 2 - Конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс, полученный по п.9; Трек 3 - Конъюгат ПЭГ40-дЭПО-нс, полученный по п.10.

Фиг. 7. Обратнофазная ВЭЖХ конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п. 9, колонке "Symmetry C18 " (4,6×150 mm).

Фиг. 8. Эксклюзионная ВЭЖХ конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п. 9, колонке " TSK Gel 4000 SW ХL " (7.8×300 mm).

Фиг. 9. MALDI Масс-спектр конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п. 9, в области m/z 15 000-90000.

Фиг. 10. Влияние конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п. 9, на уровень глюкозы в крови животных при многократном введении крысам. 1 -3- конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс; 1 - 4 мкг/кг; 2 - 8 мкг/кг; 3- 20 мкг/кг; 5- дЭПО-альфа (20 мкг/кг), 6- дЭПО-нс (20 мкг/кг); 7 - плацебо.

Фиг. 11. Определение функциональной активности конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО-нс и дЭПО-альфа) in vitro по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1. -ξ- конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс, полученный по п. 9; -!- дЭПО-нс; -Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).

Фиг. 12. Определение функциональной активности конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo). -ξ- Конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс -, полученный по п.9; -7- Конъюгат ПЭГ40-дЭПО-нс, полученный по п.10, -!- Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1; -Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).

Фиг. 13. Фармакокинетика конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО-альфа и дЭПО-нс) при однократном подкожном введении мышам. -ξ- Конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс -, полученный по п.9; -7- Конъюгат ПЭГ40-дЭПО-нс, полученный по п.10, -!- Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1; -Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).

Примеры конкретного выполнения способа получения конъюгатов ПЭГ30-ДЭПО-нс формулы (I) и ПЭГ40-дЭПО-нс формулы (II) и исследования их свойств приведены ниже.

Конъюгаты ПЭГ-дЭПО формулы (I и II), являющиеся объектом настоящего изобретения, могут быть использованы для получения лекарственных средств для профилактики и/или лечения различных анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, в частности анемии, ассоциированной с хронической почечной недостаточностью или цитостатической химиотерапией; анемии, ассоциированной с сердечно-сосудистыми нарушениями; анемии, вызванной массивными кровопотерями различного генеза; анемии у пациентов с вирусным гепатитом С после противовирусной терапии. Также объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента эффективное количество конъюгатов формулы (I) или формулы (II), которые могут использоваться как отдельно, так и совместно с другими терапевтическими средствами для профилактики и/или лечения анемий, вызванных недостаточной продукцией эндогенного ЭПО.

Конъюгаты формулы (I) формулы (II) с необязательным фармакологически приемлемым наполнителем, разбавителем и/или фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами вводят внутривенно или подкожно. Путь введения варьирует в зависимости, например, от симптомов и возраста, частота введения и интервал между введениями варьируют в зависимости от заболевания и его тяжести или от цели (терапевтическое или профилактическое использование), эффективное количество активного начала конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс формулы (I) или формулы (II) выбирается с учетом вышеизложенных факторов.

В качестве фармацевтически приемлемых вспомогательных компонентов, которые могут входить в фармацевтическую композицию, содежащую заявляемые конъюгаты ПЭГ30-дЭПО-нс формулы (I) или ПЭГ40-дЭПО-нс формулы (II), могут быть использованы: буферные соли (например, ацетатный, цитратный, водород-карбонатный, фосфатный, гистидиновый буферы), стабилизаторы (например, полисорбаты, ЭДТА, поливинилпирролидоны, декстраны, ЧСА, эфиры параоксибензойной кислоты, спирты (например, бензиловый спирт), фенолы, сорбиновая кислота), обеззараживающий компонент (например, бензиловый спирт), регулятор осмотического давления (например, хлорид натрия, хлорид калия, полиолы, например, глицерин, арабитол, сорбитол, маннитол, лактоза, декстран), аминокислоты (например, метионин, глицин, лейцин, изо-лейцин, треонин, глютаминовпая кислота, фенилаланин), сурфактанты (например, ЧСА, поливинилпирролидон, лецитин, Твин 80, Твин-20, полоксамер 188, полиоксиэтилен-полиоксипропилен сополимер, казеин), поверхностно-активные вещества (например, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, пропиленоксида и этиленоксида, сорбитанмонолаурат, сложный эфир сорбита, сложный эфир жирной кислоты полиглицирина, кокамид DEA лаурилсульфат, алканоламид, стеарит полиоксиэтилен пропилен гликоля, лауриновый эфир полиоксиэтилена, цетиловый эфир полиоксиэтилена, полисорбат, моностеарат глицерина, дистеарат глицерина, монопальмитат сорбита, сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена, сорбитанмонолаурат полиоксиэтилена и моностеарат пропиленгликоля), антиоксиданты (например, Трилон Б, L-цистеин, сульфит натрия, аскорбат натрия, глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотриитол, цистеингидрохлорид моногидрат, аскорбиновая кислота) и разбавители (например, вода).

ПРИМЕРЫ

Пример 1.

Получение очищенного низкосиалированного дарбепоетина (дЭПО-нс)

Для выделения дЭПО-нс использовали культральную жидкость (КЖ) генетически модифицированных клеток яичника китайского хомячка (CHO), трансформированных геном дЭПО. Через 6 дней культивирования 20 л КЖ фильтровали черезг лубинный фильтр с варьирующим размером пор. Осветленную КЖ концентрировали до 1 л, проводили тангенциальную диафильтрацию на мембранах с пределом отсечения 10 кДа против 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,6 и полученный концентрат наносили на колонку (5x30 см) с сорбентом “Blue sepharose” (270 мл). Колонку промывали 10 объемами 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,6. Элюцию связавшегося с сорбентом дЭПО-нс проводили 20 мМ Трис-НСI, рН 7,3, содержащим 0,3 М NaCI. Полученный элюат концентрировали в 10 раз и наносили на колонку с аффинным сорбентом (200 мл), содержащим моноклональные антитела к ЭПО-альфа. Колонку промывали 10 объемами 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,0, содержащего 1М NaCI. Элюцию связавшегося белка дЭПО-нс проводили 10 мМ Трис-ОН, содержащим 3М MgCI2, рН 7,2. Далее проводили диафильтрацию полученного белкового раствора на мембранах с пределом отсечения 10 кДа против буфера 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,5 и наносили на колонку с анионообменным сорбентом 40Q (100 мл). Сорбент промывали 20 мМ ацетатом натрия, рН 4. Элюцию дЭПО-нс проводили 20 объемами 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,5, содержащим градиент концентрации NaCI от 0 до 300 мМ. Фракции, содержащие дЭПО-нс, объединяли, концентрировали и диализовали против 50 мМ ацетата Na, рН 5.0. Полученный пул (400 мг, 3,6 мг/мл) анализировали и использовали для реакции ПЭГилирования.

Пример 2.

Анализ распределения изоформ в препарате дЭПО-нс методом изоэлектрофокусирования в сравнении с дЭПО-альфа и ЭПО-альфа.

Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1, препарат дЭПО-альфа и ЭПО-альфа (препарат Эпрекс) концентрировали при помощи центрифужных пробирок Amicon Ultra до концентрации 10-12 мг/мл и диализовали против воды. Изоэлектрофокусирование полученных образцов проводили в пластинах 4.5% полиакриламидного геля (ПААГ), содержащего смесь амфолитов 3-7 и 2-4 в соотношении 1:8, 4,8М мочевины и 4,9 % сахарозы с использованием прибора . 111 Mini IEF Cell (BioRad). Анализируемые пробы смешивали с буфером для образцов, содержащим растворы амфолитов и мочевину, в соотношении 1:1 и 2 мкл полученных образцов наносили на пластину ПААГ. ИЭФ проводили в течение 15 мин при 100 В, 15 мин при 200В и 60 мин при 450 В. После завершения процесса ИЭФ пластину ПААГ отделяли от стекла и выдерживали в течение 30 мин в фиксирующем растворе, содержащем 4% сульфосалициловой к-ты, 12,5 % трихлоруксусной кислоты и 30% этанола. Окрашивание белковых полос проводили раствором, содержащим 0,04% Кумасси R-250, 27% этанола, 10% уксусной к-ты и 0,5% CuSO4, в течении 60 мин. .После окрашивания гель обесцвечивали раствором, содержащим 12% этанола, 7% уксусной к-ты и 0,5% CuSO4, высушивали при комнатной температуре и сканировали. Результаты анализа распределения изоформ в исследуемых пробах (дЭПО-нс, дЭПО-альфа и ЭПО-альфа) представлены на фиг.1.

Пример 3.

Определение содержания сиаловых кислот в препарате дЭПО-нс методом изоэлектрофокусирования в сравнении с дЭПО-альфа и ЭПО-альфа

Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1, препараты дЭПО-альфа (ЗАО «Биокад»), дЭПО-альфа (Аранесп, Amgen) и ЭПО-альфа (препарат Эпрекс) диализовали против буферного раствора (1,5 мМ КН₂РО₄, 8,1 мМ Na₂HPO₄, 0,4 M NaCl, pH 7,4) и разбавляли указанным буфером до концентраций 0,3 и 0,15 мг/мл. К полученным пробам, объемом 100 мкл, добавили 1 мл раствора реагента резорцинола, инкубировали в кипящей водяной бане в течение 30 минут. Пробы охладили во льду, добавили 2 мл смеси бутанола/бутилацетата (1:4), интенсивно перемешали и затем инкубировали в течение 10 минут для разделения фаз. Отобрали верхнюю органическую фазу и измерили поглощение всех образцов при 580 нм. Содержание сиаловых кислот определяли по калибровочной кривой приготовленных стандартных образцов с концентрациями 0,1, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02 и 0 мг/мл. Содержание сиаловых кислот в исследуемых образцах представлено в табл. 1.

Таблица 1. Содержание сиаловых кислот в исследуемых образцах

Пример 4.

Анализ олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами, в препарате дЭПО-нс в сравнении с дЭПО-альфа

Для анализа олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами, использовали метод анионообменной ВЭЖХ при высоких рН (HPAEC) с использованием импульсного амперометрического детектора с золотым электродом. В раствор образца дЭПО-нс, полученного по п.1, и образца дЭПО-альфа (ЗАО «Биокад»), содержащих 50 мкг белка/20 мкл, добавили 2 U PNGase F (N-гликозидазы), довели объем смеси до 30 мкл водой и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 20 часов. После инкубации к раствору добавили 90 мкл охлажденного этанола (-20°С), инкубировали реакционные смеси в течение 30 минут при температуре -20°С. После инкубации раствор отцентрифугировали 10 минут (10000 оборотов) при 4°С. Полученные супернатанты инкубировали 20 часов при температуре 37°С до полного высушивания. Высушенные образцы растворили в 50 мкл воды дистиллированной. Анализ полученных проб (10 мкл) проводили на хроматографе Waters Aliance с электрохимическим детектором с использованием колонки CarboPac PA-100 (4×250 мм) при температура 25°С. Результаты исследования представлены в табл. 2. и на фиг. 2.

Таблица 2. Содержание олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами

Пример 5

Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО-альфа на in vitro

Функциональную активность дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vitro определяли по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1 (Human erythroleukaemia cells). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10 % инактивированной бычьей сыворотки с добавлением 2 нг/мл GM-CSF. Полготовленные клетки отмыли (центрифугированием) от ростовой среды с сывороткой и фактора GM-CSF, развели в среде RPMI-1640 с 0,5 % инактивированной сыворотки в концентрации 0,2×106 кл./мл. Приготовили разведения дЭПО-нс, полученному по п.1, дЭПО- альфа и препарата Аранесп в диапазоне 100000-0 нг/мл. В 96-луночный планшет внесли по 50 мкл/лунку подготовленных разведений исследуемых препаратов в трех повторах. Добавили к растворам по 50 мкл/лунку подготовленных клеток TF-1. Планшеты инкубировали при 37°С, 5 % СО2 в течение 72 часа. Количество живых пролиферирующих клеток измеряли с помощью витального красителя AlamarBlue по интенсивности флюоресценции.

Для определения пролиферирующей активности препаратов строили стандартную кривую зависимости уровня пролиферации клеток TF1 от дозы добавленных к клеткам препаратов. Построение кривых проводили в полулогарифмических координатах (логарифм концентрации добавленных препаратов - уровень флюоресценции). Статистический анализ кривых проводили при помощи программы “Origin 7.0” методом аппроксимации экспериментальных данных четырехпараметрическому логистическому уравнению сигмоидальной кривой:

У_х = A₂ + (A₁-A₂)/(1 + (Х/Х₀)^p

где У_х - интенсивность флюоресценции в зависимости от дозы препарата Х;

- А₂ - максимальный уровень флюоресценции;

- A₁ - минимальный уровень флюоресценции;

- Х - концентрация препарата;

- Х₀ - среднеэффективная доза (ЕС50) препарата, обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 от максимально возможной величины;

- р - коэффициент, определяющий угол наклона кривой.

Полученные результаты, представленые на фиг. 3 и табл.3, свидетельствуют о том, что среднеэффективная доза (ЕС50), обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1, для дЭПО-нс в 4,6 раза ниже, чем аналогичная доза для дЭПО-альфа.

Таблица 3. Cреднеэффективная доза (ЕС50) исследуемых препаратов, обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 от максимально возможной величины

Пример 6

Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo

Определение проводили методом биологического теста в нормоцитемической модели на мышах линии CBA. Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1, препарат дЭПО-альфа («ЗАО Биокад») и препарат дЭПО-альфа(Аранесп, Амджен) вводили мышам однократно в дозе 0,5 мкг/мышь подкожно в объеме 0,5 мл. Препараты разводили фосфатным буфером На 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 16 и 20 сутки у животных забирали кровь из орбитального синуса в пробирки с содержанием 1 % ЭДТА. Общее количество эритроцитов подсчитывали на гематологическом анализаторе «Exigo». Процентное содержание ретикулоцитов определяли на цитометре FC 500 Beckman Coulter. Результаты представлены на фиг. 4. Через 5 дней после введения активность дЭПО-нс составляла 82% от дЭПО-альфа.

Пример 7

Получение конъюгата ПЭГ-ДЭПО 1а с использованием линейного мПЭГ-бутиральдегид с молекулярной массой 30 000 Да

К 113мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, pH 5.0±0.2), содержащего 403 мг очищенного дЭПО-нс, полученного по п.1, добавляли 2,54 мл 1 М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 2 г сухого бутиральдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 30 000 дальтон (Laysan Bio Inc (M-PEG-BALD Lot#123-121). Пробу инкубировали 24 часа при постоянном перемешивании при температуре (20±2)°С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования конъюгата ПЭГ-ДЭПО при помощи метода электрофореза (ЭФ) в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС) в редуцирующих условиях. Для этого к отобранной пробе добавляли 1/3 объема буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20 % глицерин, 3 % ДДС, 15% 2-меркаптоэтанола, 0,005% бромфенолового синего, и нагревали 3 мин на кипящей водяной бане. Пробы в объеме 5 мкл вносили в лунки подготовленных пластин ПААГ и проводили ЭФ в 12,5 % ПААГ в присутствии ДДС. По окончании электрофореза гель окрашивали при помощи Кумасси R-250. Кинетика образования конъюгата ПЭГ-дЭПО-нс представлена на фиг. 5. В момент времени, когда содержание ПЭГ-дЭПО-нс составляло более 70 %, реакционную смесь в 10 раз разводили дистиллированной водой, доводили рН до 6.8 раствором 0.1М NaOH и проводили стерильную фильтрацию через фильтры 0.22 мкм.

Пример 8

Получение конъюгата ПЭГ-ДЭПО-нс с использованием разветвленного мПЭГ-NHS с молекулярной массой 40 000 Да

Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1, диализовали против 50 мМ боратного буфера рН 9.0. Концентрация дЭПО составляла 1,55 мг/мл. К 15.5 мл белкового раствора (24 мг) добавляли 73 мг мПЭГ-NHS с молекулярной массой 40000 дальтон (SUNBRIGHT(LY-400NS Lot№ M12D541), предварительно растворенного в 3 мл 1мМ соляной кислоты, охлажденной до 0°С во льду. Пробу инкубировали 4 часа при постоянном перемешивании при температуре (0÷4)°С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования конъюгата ПЭГ-дЭПО при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС как описано в п.7. Реакцию останавливали разведением в 10 раз очищенной водой и переводили рН до 6.8 разбавленной уксусной кислотой.

Пример 9

Очистка конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс при помощи ионообменной хроматографии на анионообменном сорбенте.

Разбавленный раствор ПЭГ-дЭПО-нс, полученный по п.7 или по п.8, наносили на колонку с анионообменным сорбентом (40Q-сефароза Work Beads, BioWorks, Cat№ 40 100 210), уравновешенным 20 мМ Na-фосфатным буфером pH7,4 (буфер А. После нанесения раствора белка, сорбент промывали буфером А до базовой линии (10-12 объемов колонки). Элюцию связавшегося моно-ПЭГ-дЭПО-нс проводили буфером А, содержащим градиент концентрации NaCl (0-0,5 М NaCl (40 объемов колонки) со скоростью 30 см/час. В полученных фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм и 260 нм, определяли концентрацию белка и проводили анализ при помощи SDS-электрофореза в 8% ПААГе, как описано в п. 7. Фракции, содержащие моноПЭГилированный конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс с чистотой более 95%, объединяли, диализовали против 10 объемов буфера А, рН 6.2±0.2, проводили стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2°С.

Пример 10

Очистка конъюгата ПЭГ40-дЭПО-нс при помощи ионообменной хроматографии на анионообменном сорбенте

Разбавленный раствор ПЭГ-дЭПО-нс, полученный по п.8, наносили на колонку с анионообменным сорбентом (40Q-сефароза Work Beads, BioWorks, Cat№ 40 100 210), уравновешенным 20 мМ Na-фосфатным буфером pH7,4 (буфер А). Хроматографию проводили, как описано в п. 9. Фракции, содержащие моноПЭГилированный конъюгат ПЭГ40-дЭПО-нс с чистотой более 95%, объединяли, диализовали против 10 объемов буфера А, рН 6.2±0.2, проводили стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2°С.

Пример 11

Анализ чистоты полученных конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС

Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1, конъюгаты ПЭГ-дЭПО-нс, полученные по п.9 или 10, анализировали при помощи ЭФ в 8% ПААГ в присутствии 2-меркаптоэтанола и ДДС, как описано в п.7. Нагрузка на трек составляла 10 мкг белка. Результаты представлены на фиг. 6.

Пример 12

Анализ гомогенности конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс при помощи метода обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс, полученный по п.9, разводили 20 мМ Na-фосфатным буфером, pH6,2 до концентрации 0,1 мг/мл и 100 мкл полученной пробы вносили на колонку Symmetry300 C4 (4.6×150 mm). Исследование проводили на хроматографе «Breeze» фирмы "Waters" при 214 нм. Из результатов, представленных на фиг. 7 следует, что по данным ОФ ВЭЖХ чистота заявляемого конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс составляет более 99 %.

Пример 13

Анализ гомогенности конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс при помощи метода эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Конъюгат ПЭГ-дЭПО-нс, полученный по п.9, разводили 20 мМ NaФосфатным pH6,2 буфером до концентрации 0,7 мг/мл и 40 мкл полученной пробы вносили на колонку TSK Gel 4000 SW ХL (Tosoh bioscience, 7.8 mm × 300 mm). Анализ проводили на хроматографе Agilent 1100 series. Скорость потока составляла - 0,4 мл/мин, время хроматографирования - 60 мин. Детекцию проводили на длине волны 214 нм. Результаты исследования представлены на фиг.8. Видно, что исследуемый образец ПЭГ-ДЭПО выходит с колонки одним, четко выраженным симметричным пиком, составляющим >97%.

Пример 14

Определение молекулярной массы конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс при помощи метода эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Конъюгат ПЭГ-дЭПО-нс, полученному по п.9 (10 мкг), сконцентрировали и отдиализовали с использованием микроколонки ZipTip C18 (Millipore, США). На мишень наносили обессоленный раствор конъюгата ПЭГ-дЭП-нс и элюировали раствором матрицы (2 мг синапиновой кислоты в 100 мкл 75 % раствора ацетонитрила в 0,1 % растворе трифтроуксусной кислоты). Образец, нанесенный на мишень, высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на Масс-спектрометре MALDI-TOF-TOF ABSciex 4800 (Канада). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов, в линейном режиме, погрешность измерения средней массы не превышает 10-15 Да.

Результаты по масс-спектрометрическому анализу конъюгата ПЭГ-дЭПО-нс, полученного по п.9, в диапазоне m/z от 15000-90000 приведены на фиг.9. Видно, что масс-спектр конъюгата ПЭГ-дЭПО-нс представлен размытым пиком в области 60000-70000 Да, соответствующим однозарядному иону [M]+ с молекулярной массой 65450±5000 Да. Размытость пика обусловлена гетерогенностью препарата монометоксиПЭГ, используемого для получения ПЭГилированного белка. Измеренное значение m/z в максимуме пика (65450±5000) Да совпадает с расчетными данными по сумме молекулярных масс дЭПО-нс (36-37 000 Да) и присоединенного ПЭГ (30000 Да).

Пример 15

Влияние конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс на уровень глюкозы в крови в сравнении с дЭПО-нс и дЭПО-альфа

Животным (беспородные крысы) вводили конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс, полученный по п.9, 1 раз в 6 дней в течение 30 суток в различных дозах (4, 8 и 20 мкг/кг). Параллельно другим группам животных вводили препараты немодифицированных дарбепоетинов (дЭПО-альфа и дЭПО-нс) 1 раз в день в течение 30 сут в дозе 20 мкг/кг. На 30 сутки исследования проводили определение эритроцитов в крови (как описано в п. 6) и определение глюкозы в сыворотке крови подопытных животных. Концентрацию глюкозы определяли при помощи полуавтоматического биохимического анализатора Humalyzer 3000 (Human GmbH, Германия) с предварительной пробоподготовкой согласно инструкции по применению набора реагентов на анализ глюкозы крови (ЗАО «Аналитика», Россия). Результаты исследования представлены на фиг. 10 и табл.4 . Введение конъюгата ПЭГ-дЭПО-нс, также как и введение препаратов немодифицированных дарбепоетинов (дЭПО-альфа и дЭПО-нс), приводило к стимуляции эритропоэза у подопытных животных (табл. 4). Однако, следует отметить тот факт, что при введении препаратов немодифицированных дарбепоетинов, наряду с увеличением числа эритроцитов в крови, у животных наблюдалась также резко выраженная гипогликемия, при этом концентрация глюкозы в крови животных снижалась в 2.6 -5.2 раза по сравнению с контролем. Ввведение конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п.9, вызывало стимуляцию эритропоэза практически без гипогликемии. По сравнению с контролем, концентрация глюкозы в крови снижалась незначительно в 1,1-1,25 раза в зависимости от дозы введенного конюгата ПЭГ30-дЭПО-нс (табл. 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что присоединение ПЭГ к молекуле дЭПО-нс предотвращает развитие резко выраженной гипогликемии при сохраненной эритропоэз-стимулирующей активности конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс. Применение заявляемого конъюгата в клинике для стимуляции эритропоэза является более безопасным, так как не приводит к резкому снижению уровня глюкозы в крови, в отличие от препаратов немодифицированных дарбепоетинов.

Таблица 4. Содержание эритроцитов и глюкозы в крови подопытных животных при многократном введении конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс в различных дозах в сравнении с препаратами немодифицированных дЭПО (дЭПО-альфа и дЭПО-нс)

Пример 16

Определение функциональной активности конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс in vitro в сравнении с дЭПО-нс и дЭПО-альфа

Функциональную активность in vitro конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п. 9, определяли по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1 (Human erythroleukaemia cells) как описано в п. 5, в сравнении с дЭПО-нс, полученному по п. 1, и дЭПО-альфа. Результаты, представленные на фиг. 11 и табл. 5, свидетельствуют о том, что среднеэффективная доза (ЕС50), обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1, для ПЭГ-дЭПО-нс примерно в 17 раз выше, чем аналогичная доза для дЭПО-нс и в 4 раз выше, чем дЭПО-альфа.

Таблица 5. Cреднеэффективная доза (ЕС50) исследуемых препаратов, обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 от максимально возможной величины

Пример 17

Определение функциональной активности конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс

в сравнении с дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo

Определение проводили методом биологического теста в нормоцитемической модели на мышах линии CBA. Конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс (полученный по п. 9) или конъюгат ПЭГ40-дЭПО-нс (полученный по. п.10 ), препарат дЭПО-нс (полученный по п.1, и препарат дЭПО-альфа вводили разным группам мышей однократно в дозе 0,5 мкг/мышь подкожно в объеме 0,5 мл. Препараты разводили фосфатным буфером. Через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 и 12 суток после введения у животных забирали кровь из орбитального синуса. Содержание ретикулоцитов определяли, как описано в п.6. Результаты представлены на рис. 12. Длительность ответа на введение конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс, полученных по п.9 и п.10, была на несколько дней выше, чем при введении дЭПО-нс и дЭПО-альфа. Введение конъюгата ПЭГ30-дЭПО-нс, полученного по п. 9, приводило к более значительному увеличению числа ретикулоцитов, чем введение конъюгата ПЭГ40-дЭПО, приготовленного по п.10, препарата дЭПО-нс (приготовленного по п. 1) и дЭПО-альфа. Конъюгат ПЭГ40-дЭПО, приготовленный по п.10, обеспечивал самый длительный ответ.

Пример 18

Исследование фармакокинетики конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс при однократном подкожном введении мышам.

Пробы конъюгатов ПЭГ-дЭПО-нс, полученных по п.9 или по п.10, вводили однократно подкожно мышам в дозе 400 нг/животное. Параллельно другим группам мышей вводили подкожно препарат немодифицированного дЭПО-нс, полученного по п.1, и препарат дЭПО-альфа в той же дозе. Пробы крови отбирали через 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 и 240 часов после ведения препаратов. Сыворотки отделяли центрифугированием и хранили при температуре минус 20°С до проведения анализа. Для определения уровня ПЭГ-дЭПО, дЭПО-нс, и дЭПО-альфа в сыворотке крови мышей была использована тест-система, разработанная в ОП ЗАО «Биокад». Уровень исследуемых препаратов в сыворотке крови оценивался с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Лунки 96-луночного микропланшета для микротитрования (“Costar”, Cat. N 3590) сенсибилизировали поликлональными антителами кролика против дЭПО из расчета 500 нг/100 мкл 20 мМ карбонатного буфера (рН 9.0-9.5) на лунку и инкубировали 16-18 часов при 4°С. Не связавшиеся иммуноглобулины удаляли из лунок. Для блокирования неспецифических участков связывания, в лунки вносили по 200 мкл 20 мМ Трис-НСI буфера, рН 7.2-7.4 (ТБ), содержащего 0.14 М NaCI и 0,5% NFDM (блокирующий буфер - ББ) и инкубировали 30 минут при 37°С. Раствор ББ удаляли, в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки, разведенной в 2-1000 раз ББ. Параллельно в лунки вносили 100 мкл ББ, содержащего различные концентрации ПЭГ30-дЭПО-нс или ПЭГ40-дЭПО-нс (в диапазоне 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 0 нг/мл) или дЭПО-нс (в диапазоне 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 и 0 нг/мл) или дЭПО-альфа ( в диапазоне 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 и 0 нг/мл. Планшеты инкубировали 30 минут при 37°С. Содержимое лунок удаляли, лунки промывали 3 раза по 200 мкл ТБ, содержащего 0.05 Твина-20 в лунки вносили по 100 мкл ББ, содержащего поликлональные антитела кролика против дЭПО, меченые биотином в рабочем разведении и инкубировали 30 минут при 37⁰С. После инкубации содержимое лунок отсасывали и в лунки вносили авидин, конъюгированный с пероксидазой по 100 мкл/лунку в рабочем разведении и инкубировали 30 минут при 37°С. Содержимое лунок отсасывали, лунки промывали 4 раза по 200 мкл ТБ, содержащим 0.05 Твина-20, и в лунки вносили по 100 мкл 0.1 М Na-ацетатного буфера, рН 5.0, содержащего 0.1 мг/мл тетраметилбензидина и 0.003% Н₂О₂. Для остановки реакции в лунки вносили по 50 мкл 2М Н₂SO₄ и оптическую плотность в лунках измеряли при помощи планшетного спектрофотометра Tecan при 450 нм. Для определения концентрации препаратов в исследуемых образцах сыворотки, строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартных разведений препаратов в полулогарифмических координатах и по оптической плотности тестируемого образца находили концентрацию исследуемого препарата. Результаты исследования фармакокинетики представлены на фиг. 13.

Из результатов следует, что заявляемые конъюгаты ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс обладают значительным пролонгированным эффектом по сравнению с немодифицированными препаратами дарбепоетина (дЭПО-нс и дЭПО-альфа). При введении немодифицированных препаратов дЭПО-нс и дЭПО-альфа, их содержание в крови животных достигало максимума через 12 часов после введения и затем очень быстро снижалось. При введении конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс, максимальное содержание дЭПО в крови животных наблюдалось через 24 и 36 часов, соответственно. Для ПЭГ30-дЭПО-нс этот уровень сохранялся в течение 150 часов и только затем происходило медленное снижение содержания дЭПО. Конъюгат ПЭГ40-дЭПО-нс характеризовался более медленным выведением из организма, чем конъюгат ПЭГ30-дЭПО-нс. Исходя из полученных результатов (фиг. 13) были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для заявляемых конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс при однократном подкожном введении мышам (табл. 6). Из представленных результатов видно, что клиренс (Cl) заявляемых конъюгатов ПЭГ40-дЭПО-нс и ПЭГ30-дЭПО-нс значительно замедлен по сравнению с немодифицированными препаратами дарбепоетина (дЭПО-нс и дЭПО-альфа). Значения клиренса составляли 2,45±2,04; 7,68±2,80; 37,83±16,76 и 47,69±18,87 мл/час/кг для ПЭГ40-дЭПО-нс, ПЭГ30-дЭПО-нс, дЭПО-альфа и дЭПО-нс, соответственно. Снижение клиренса заявляемых конъюгатов ПЭГ40-дЭПО-нс и ПЭГ30-дЭПО-нс обеспечило их длительную циркуляцию в крови. Время полувыведения (Т_1/2) для конъюгатов ПЭГ40-дЭПО-нс и ПЭГ30-дЭПО составило 93,55±37,73 и 56,50±32,76 часов, соответственно. Для препаратов дЭПО-альфа и дЭПО-нс время полувыведения (Т_1/2) составило 6,20±2,09 и 9,00±3,14 часов, соответственно. Площадь под кривой (AUC) для заявляемых конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс превышала соответствующее значение для немодифицированных дЭПО-нс и дЭПО-альфа в 6-20 раз.

Таблица 6. Усредненные фармакокинетические параметры исследуемых препаратов при однократном подкожном введении мышам в дозе 400 нг/мышь

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об улучшенных фармакокинетических параметрах заявляемых конъюгатов в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО-альфа и дЭПО-нс). Использование дЭПО-нс в составе заявляемых конъюгатов позволит значительно снизить себестоимость их получения.

На основании полученных данных по фармакокинетике и фармакодинамике полученных конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс можно сделать рекомендации по снижению частоты введения лекарственного средства на основе заявляемых конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс с сохранением эквивалентного уровня биологического ответа по сравнению с немодифицированными препаратами на основе немодифицированного дЭПО-альфа.

Пример 19

Примеры фармацевтических композиций на основе заявляемых конъюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс

(А)

(Б)

(В)

(Г)

(Д)

(Е)

(Ж)

(З)

(И)

(К)

(Л)

(М)

Пример 20

Упаковка в контейнер лекарственного средства, содержащего ПЭГ30-дЭПО-нс или ПЭГ40-дЭПО-нс

Лекарственное средство, включающее эффективное количество заявляемого ПЭГ-ДЭПО 1а (Пример 17), разливают в стерильных условиях по 0,5, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 5-50 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 100-300 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 500-1000 мкг/мл) в шприцы из нейтрального стекла I гидролитического класса, с впаянными иглами, покрытыми колпачками защитными эластичными или жесткими, укупоренные наконечниками на поршни из бутилкаучука, ламинированного фторполимером.

Пример 21

Упаковка в контейнер лекарственного средства, содержащего ПЭГ30-дЭПО-нс или ПЭГ40-дЭПО-нс

Лекарственное средство, включающее эффективное количество ПЭГ30-дЭПО-нс или ПЭГ30-дЭПО-нс (Пример 17), разливают в стерильных условиях по 0,5, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 5-10 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 100-300 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 500-1000 мкг/мл) во флаконы из нейтрального стекла I гидролитического класса, укупоренные фторрезиновыми или бутилрезиновыми пробками с тефлоновым покрытием, обжатых алюминиевыми колпачками.

Пример 22

Набор, включающий упакованное в контейнеры лекарственное средство, содержащее ПЭГ30-ДЭПО-нс, 0,5, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 5-10 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 100-300 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 мл (для дозировки 500-1000 мкг/мл) Набор содержит по 1 или 4 шприца в комплекте с поршнем (1 или 4 соответственно) /флакона в контурной ячейковой упаковке из пленки полимерной вместе с инструкцией по применению, которые помещают в пачку из картона.

Литература

1 Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. et al. (1986) «Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin». Immunobiology, v. 172, p.213-224.

2. Egrie J.C., Grant J.R., Gillies D.K., Aoki K.H., Strickland T.W. (1993), «The role of carbohydrate on the biological activity of erythropoietin». Glycoconjugate Journal, v. 10, p. 263-269.

3. Storring P.L., Tiplady R.J., Gaines Das R.E., Stenning B.E.et al. (1998), « Epoetin alfa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and biological properties». Br. J. Haematol. , v.100, p.79-89.

4. Yuen C.T., Storring P.L., Tiplady R.J. et al. (2003), «Relationships between the N-glycan structures and biological activities of recombinant human erythropoietins producedusing different culture conditions and purification procedures», Br. J. Haematol., v. 121, p. 511-526.

5. Kim J.Y.,, Kim Y.G., Lee G.M. (2012), «CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential», Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 93(3), p. 917-930.

6. Briggs D.W., Fisher J.W., George W.J. (1974), «Hepatic clearance of intact and desialylated erythropoietin», . Am. J. Physiol., v. 227, p. 1385-1388.

7 Goldwasser E, Kung CK, Eliason J. (1974). «On the mechanism of erythropoietin-induced differentiation. The role of sialic acid in erythropoietin action». J. Biol. Chem., v. 249, p. 4202-4206.

8. Egrie J.C., Browne J.K. (2001), «Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP)». Br. J. Cancer, v. 84 Suppl 1:3-10.

9. Brown J.N., Kemp D.W., Brice K. R. (2009) «Class Effect of Erythropoietin Therapy on Hemoglobin A1c in a Patient with Diabetes Mellitus and Chronic Kidney Disease Not Undergoing Hemodialysis», Pharmacotherapy, v. 29, N. 4, p. 468-472.

10. Katz O., StuibleM., Golishevski N., Lifshitz L., TremblayM.L., Gassmann M., Mittelman M. and Neumann D. (2010). «Erythropoietin treatment leads to reduced blood glucose levels and body mass: insights from murine models», J. Endocrinology, v. 205, p. 87-95.

11. Mikolás E. , Cseh J., Pap M., Szijárto I. A., Balogh A., Laczy B., Bekő V., Fisi V., Molnár G. A. Mérei Á., Szeberényi J., Wittmann I. (2012), «Effects of Erythropoietin on Glucose Metabolism», Horm. Metab. Res., v. 44, p. 279-285.

12. Woo M. and Hawkins M. «Beyond Erythropoiesis: Emerging Metabolic Roles of Erythropoietin» (2014), Diabetes, v. 63, p.2229-2231.

13. Патент RU 2232163.

14 Патент RU 2433134.

15. Патент RU 2318004.

16. Патент RU 2409389.

17. Патент EA 018116.

18. Патент RU 2356909.

19. Jevsevar S., Kunstelj M., Gaberc P. (2010), «PEGylation of therapeutic proteins», Biotechnology Journal, v. 5, (1), p. 113-128.

20. Delgado C., Francis G.E., Fisher D. (1992), «The uses and properties of PEG-linked proteins», Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.t, v. 9, р. 249-304.

21. Mehvar R. (2003), «Modulation of pharmacokinetics and pharmacodynamics of protein by polyethetelene glycol conjugate», J. Pharm. Pharmaceut. Sci., v. 3, (1), p. 125-136.

22. Bailon P., Won C.Y. (2009), «PEG-modified biopharmaceuticals», Expert Opin. Drug Deliv. , v. 6(1), p.1-16.

23. González-Valdez J., Rito-Palomares M., Benavides J. (2012), «Advances and trends in the design, analysis, and characterization of polymer-protein conjugates for “PEGylaided” bioprocesses», Anal. Bioana. l Chem., v. 403, p. 2225-2235.

24. Патент RU 2439091.

25. Патент RU 2476439.

26. Патент US 889837.

27. Патент US 8765924.

28. Патент US 6583272.

29. Патент ЕАПО 003777.

30. Патент RU 2006122540.

31. Патент US 8916360.

32. Патент EAPO 007812.

33. Патент RU 2437675.

34. Ikeda Y., Nagasaki Y. (2012), «PEGylation Technology in Nanomedicine», Adv. Polym. Sci., v. 247, p. 115-140.

35. Патент WO 2003029291.

36. Заявка на изобретение WO 2000032772.

37. Заявка на изобретение WO 2003029291.

38. Патент US 6,586,398.

39. Заявка на изобретение WO 2001076640.