[2]Настоящее изобретение относится к твердофазному носителю для иммобилизации и последующего длительного хранения в комнатных условиях биологических материалов, содержащих нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), представляющему собой пористую основу, обработанную композицией, содержащей набор реагентов.
[4]Использование твердофазных носителей для сохранения образцов биологического материала в целях последующего выделения и анализа биомолекул широко известно с 1960х гг., когда были созданы первые карты такого рода - т.н. карты Гатри [1, 2], предназначенные для скрининга новорожденных с целью выявления генетического заболевания - фенилкетонурии. Впоследствии были разработаны многочисленные варианты таких твердофазных носителей, в частности, носителей на основе целлюлозы, обеспечивающих длительную сохранность образцов биологических материалов, содержащих ДНК или РНК, при комнатной температуре [3, 4], и требования к таким носителям, включая критерии их стандартизации [5].
[5]Известны карты для хранения образцов Whatman® 903 Specimen Collection Paper [6-9], позволяющие в течение длительного времени сохранять ДНК- или РНК-содержащие образцы биологического материала (такие как образцы крови и др.) при температуре -20°С в герметично запаянном контейнере совместно с влагопоглотителем [9].
[6]Известен предлагаемый в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения твердофазный носитель для длительного хранения образцов биологического материала, содержащих ДНК или РНК, в т.ч., образцов генетического материала, выделенных из крови, включающий твердую матрицу, выполненную из твердой целлюлозы (предпочтительно, из фильтровальной бумаги) или из полимера, где указанная матрица содержит соединение или композицию, нанесенные на матрицу или абсорбированные на матрице и защищающие ДНК или РНК от деградации [10]. В качестве соединения, защищающего ДНК или РНК от деградации, твердофазный носитель согласно [10] использует мочевую кислоту совместно со слабым основанием, с получением соли мочевой кислоты - урата и с обеспечением щелочного рН в диапазоне от 8,0 до 9,5.
[7]Дополнительно твердофазный носитель [10] может содержать хелатирующий агент, такой как ЭДТА, анионный детергент, такой как натрий лаурилсульфат (натрий додецилсульфат, SDS), и слабощелочной буфер, такой как трис-ЭДТА буфер. К недостаткам твердофазного носителя [10] относится то, что он требует импрегнирования в полистирол для последующего долгосрочного хранения при комнатной температуре, либо хранения в рефрижераторе при температуре -15°С в присутствии влагопоглотителя и нескольких кристаллов сухого натрия карбоната, что увеличивает себестоимость хранения образцов на таком носителе.
[8]Кроме того, носитель в соответствии с прототипом [10], как и многие другие аналогичные носители, сталкивается с проблемой присутствия контаминирующей ДНК или РНК бактериального, вирусного и др. происхождения. Твердофазный носитель для хранения биологических образцов с целью последующего выделения ДНК или РНК, обладающий оптимальными характеристиками, должен не только обеспечивать возможность долгосрочного хранения ДНК-содержащих биологических образцов, но и предоставлять возможность стерилизационной предобработки с целью разрушения контаминирующей ДНК или РНК.
[9]В связи с указанными недостатками прототипа [10] остается актуальной задача создания твердофазного носителя на основе пористого целлюлозного материала, позволяющего осуществлять длительное хранение биологических образцов, содержащих ДНК или РНК, при комнатной температуре, без использования дополнительных мер средств, который, однако, не утрачивал бы своих свойств в результате стерилизационной предобработки.
[10]В рамках настоящего изобретения неожиданно было показано, что твердофазный носитель на основе пористой целлюлозы, пропитанный или покрытый композицией, содержащей слабое основание, анионный детергент и хелатообразующий агент, отличается тем, что дополнительно содержит дисахарид, эффективно защищает ДНК или РНК, содержащиеся в биологических образцах, от деградации под действием ионизирующего излучения или этиленоксида, в то же время позволяя осуществить стерилизационную обработку носителя от «примесной» ДНК или РНК, в чем и заключается неожиданный технический результат настоящего изобретения.
[11]В предпочтительном варианте изобретения дисахарид представляет собой трегалозу, сахарозу, мальтозу или их комбинацию; в наиболее предпочтительном воплощении, дисахарид представляет собой комбинацию трегалозы и сахарозы в массовом соотношении от 1:1 до 1:4 или смесь трегалозы и мальтозы в массовом соотношении от 1:1 до 1:4.
[12]В предпочтительном варианте изобретения рН упомянутой композиции составляет от 7,0 до 9,0.
[13]В более предпочтительном варианте изобретения, упомянутая композиция содержит от 0,2 до 0,4% детергента, от 0,1 до 0,2% слабого основания, от 0,02 до 0,04% хелатообразующего агента и от 0,3 до 0,5% дисахарида.
[14]В предпочтительном варианте слабое основание выбрано из группы, включающей трис(гидроксиметил)аминометан, N-(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)глицин, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)глицин и натриевую соль 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты.
[15]В предпочтительном варианте анионный детергент выбран из гуанидина гидрохлорида, гуанидина изоционата, мочевины, лаурилсульфата натрия (SDS), полиоксиэтилен сорбитан монолаурата (Tween 20 или др.), октилфенокси-полиэтоксиэтанола (Nonidet Р40 или др.) и т-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (Triton Х-100 или др.).
[16]В предпочтительном варианте хелатообразующий агент выбран из группы, включающей тринатриевую соль нитрилтриуксусной кислоты, динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, тринатриевую соль N-(гидроксиэтил)этилен-диаминтетрауксусной кислоты и пентатриевую соль диэтилентетраминпентауксусной кислоты.
[17]Твердофазный носитель в соответствии с изобретением обеспечивает возможность длительного хранения биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) при комнатной температуре без использования дополнительных средств (таких, как импрегнирование карт в полистирол, использование рефрижератора и т.п.), а также возможность эффективной стерилизационной предобработки без утраты полезных свойств носителя.
[18]Стерилизационная предобработка может осуществляться ионизирующим излучением [11], например гамма-излучением. Наиболее предпочтительно, стерилизующая доза гамма-излучения составляет от 10 до 25 кГр, В альтернативном варианте стерилизация может осуществляться газовой смесью, содержащей этиленоксид [12]. В наиболее предпочтительном варианте количество этиленоксида в газовой смеси составляет от 5 до 15%, при этом в самом предпочтительном варианте обработку газовой смесью, содержащей этиленоксид, осуществляют по крайней мере на протяжении от 4 до 8 часов.
[19]Ниже приведены примеры осуществления изобретения, наглядно демонстрирующие возможность достижения заявленного технического результата, не ограничивая при этом объема притязаний.
[20]Примеры осуществления изобретения
[21]Пример 1. Приготовление твердофазного носителя.
[22]40 г лаурилсульфата натрия, 38,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и 5,8 г ЭДТА смешали с 50 г смеси трегалоза: сахароза (в массовом соотношении 1:3), растворили в дистиллированной воде, затем добавили при перемешивании концентрированную соляную кислоту до рН 8,5, и затем довели объем полученного раствора до 1 л. Обеззоленную фильтровальную бумагу типа Whatman® 903 пропитали полученной композицией и сушили при температуре 70°С в течение 4 часов. Полученный твердофазный носитель нарезали на карты размером 5,0×5,0 см. Аналогичным образом получили твердофазные носители с использованием 50 г трегалозы, 50 г сахарозы или 50 г мальтозы и 50 г смеси трегалозы и мальтозы в массовом соотношении 1:3 вместо 50 г смеси трегалоза:сахароза в массовом соотношении 1:3.
[23]Аналогичным образом готовили контрольные твердофазные носители, не содержащие дисахарида.
[24]Пример 2. Исследование хранения ДНК на твердофазных носителях.
[25]Для исследования хранения ДНК-карт использовали метод «ускоренного старения».
[26]На исследуемые и контрольные носители, а также на носители сравнения (FTA™ Mini Card производства GE Healthcare, кат. № WB120055) поместили по 85 мкл образца капиллярной крови и сушили при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем часть носителей поместили в сушильный шкаф с постоянной температурой 60°С. Вторую часть носителей оставили при комнатной температуре.
[27]Образцы носителей, хранящихся при температуре 60°С, исследовали через каждые 7 дней хранения, а образцы носителей, хранящихся при комнатной температуре, исследовали через каждый 21 день хранения.
[28]Для этого из носителей с помощью перфоратора вырезали диски диаметром 2 мм. Диски помещали в пробирки типа «Эппендорф» и встряхивали с 0,2 мкл трис-ЭДТА буфером (рН 8,5) на лабораторном шейкере типа «Вортекс» в течение 5 минут, затем трис-ЭДТА буфер удалили декантацией. Процедуру повторили дважды. Диски сушили при 60°С в течение 30 минут и помещали в пробирки для ПЦР. В пробирки добавили по 25 мкл реакционной смеси, приготовленной согласно инструкции для набора реагентов «АмплиСенс® М. hominis-скрин-титр-FL». Пробирки помещали в автоматический амплификатор и проводили амплификацию методом ПЦР в реальном времени по следующей программе (Таблица 1):
[29]
[30]Флуоресцентный сигнал детектировали, начиная с шестого цикла. Детекцию вели по каналу для флуорофора JOE (канал детекции для внутреннего контрольного образца, специфичного к ДНК человека).
[31]Результаты представлены в таблице 2, где Т60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием трегалозы в качестве дисахарида, хранящийся при температуре 60°С;
[32]S60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием сахарозы в качестве дисахарида и хранящийся при 60°С;
[33]М60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием мальтозы в качестве дисахарида и хранящийся при 60°С;
[34]TS60 - карта, приготовленная с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3) в качестве дисахарида и хранящаяся при 60°С;
[35]ТМ60 - карта, приготовленная с использованием комбинации трегалозы и мальтозы (в массовом соотношении 1:3) в качестве дисахарида и хранящаяся при 60°С;
[36]О60 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный без использования дисахарида и хранящийся при 60°С;
[37]F60 - твердофазный носитель сравнения FTA™ Mini Card, хранящийся при 60°С;
[38]Т25 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный с использованием трегалозы в качестве дисахарида и хранящийся при комнатной температуре (20-25°С);
[39]О25 - твердофазный носитель по изобретению на целлюлозной основе, приготовленный без использования дисахарида и хранящийся при комнатной температуре (20-25°С);
[40]F25 - твердофазный носитель сравнения FTA™ Mini Card, хранящийся при комнатной температуре (20-25°С).
[41]Из Таблицы 2 следует, что при комнатной температуре образцы ДНК одинаково хорошо хранятся на носителях как с дисахаридами, так и без дисахаридов (результаты в опытной группе и в группе сравнения были сопоставимы), однако при повышенной температуре ДНК значительно лучше сохраняется на твердофазных носителях по изобретению; напротив, на картах без дисахарида, в том числе и на носителях сравнения, ДНК подвергалась полной деструкции после 63 дней хранения при 60°С.
[42]
[43]Пример 3. Стерилизационная предобработка носителей газовой смесью, содержащей этиленоксид, и гамма-излучением.
[44]С целью имитации контаминации на твердофазные носители по примеру 1, содержащие смесь трегалозы с сахарозой (в массовом соотношении 1:3), а также аналогичные носители без дисахаридов нанесли отмытые лейкоциты крови человека или раствор ДНК, выделенной из лейкоцитов крови человека. Для выделения ДНК из лейкоцитов использовали набор реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп». После нанесения лейкоцитов и раствора ДНК карты сушили в течение 4 часов при комнатной температуре, затем запаковали в бумажные конверты и отправили на обработку. Часть карт обрабатывали смесью 10% этиленоксида и углекислого газа в течение 4 и 8 часов, часть - гамма-облучением (10 и 25 кГр). Контрольные карты оставили запечатанными в конверте без обработки. После обработки карты извлекли из конвертов и из областей, куда были нанесены образцы лейкоцитов и ДНК, панчером вырезали диски диаметром 2 мм. Остаточное содержание ДНК измеряли методом ПЦР в реальном времени согласно примеру 2. Результаты представлены в таблице 3.
[45]
[46]
[47]где ЭО4-ЛК - образцы с дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;
[48]ОЭО4-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;
[49]ЭО4-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;
[50]ОЭО4-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 4 часов;
[51]ЭО8-ЛК - образцы с дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 часов;
[52]ОЭО8-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 часов;
[53]ЭО8-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 ч;
[54]ОЭО8-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенным раствором ДНК, обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, в течение 8 ч;
[55]ГР10-ЛК - образцы дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;
[56]ОГР10-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;
[57]ГР10-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;
[58]ОГР10-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 10 кГр;
[59]ГР25-ЛК - образцы с дисахаридами и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 25 кГр;
[60]ОГР25-ЛК - образцы без дисахаридов и с нанесенными лейкоцитами, обработанные гамма-радиацией с дозой 25 кГр;
[61]ГР25-ДНК - образцы с дисахаридами и с нанесенным раствором ДНК, обработанные ионизирующим излучением (гамма-излучением) с дозой 25 кГр;
[62]ОГР25-ДНК - образцы без дисахаридов и с нанесенным раствором ДНК, обработанные ионизирующим излучением (гамма-излучением) с дозой 25 кГр;
[63]К-ЛК - контрольные образцы с нанесенными лейкоцитами;
[64]К-ДНК - контрольные образцы с нанесенным раствором ДНК.
[65]Пример 4. Хранение ДНК на картах, обработанных газовой смесью, содержащей этиленоксид, и гамма-излучением.
[66]Твердофазные носители по изобретению, приготовленные согласно примеру 1 с использованием смеси трегалозы с сахарозой (1:3) в качестве дисахарида, а также аналогичные носители без дисахаридов, дополнительно обрабатывали смесью 10% этиленоксида в течение 4 часов или гамма-излучением в дозе 25 кГр. Затем на карты нанесли образцы крови по 85 мкл и провели исследование хранения ДНК методом ускоренного старения аналогично примеру 2. В качестве образцов сравнения использовали ДНК-карты с трегалозой и сахарозой (в массовом соотношении 1:3), не обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, или гамма-излучением, а также карты, приготовленные без использования дисахаридов, но обработанные газовой смесью, содержащей этиленоксид, или гамма-излучением. Результаты приведены в таблице 4.
[67]
[69]TS60-ЭО - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3), в качестве дисахарида, дополнительно обработанный газовой смесью, содержащей этиленоксид, и хранящийся при 60°С;
[70]TS60-ГР - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3), в качестве дисахарида, дополнительно обработанный гамма-излучением и хранящийся при 60°С;
[71]О60-ЭО - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный без использования дисахаридов, дополнительно обработанный газовой смесью, содержащей этиленоксид, и хранящийся при 60°С;
[72]О60-ГР - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный без использования дисахаридов, дополнительно обработанный гамма-излучением и хранящийся при 60°С;
[73]TS60 - твердофазный носитель по изобретению, приготовленный с использованием комбинации трегалозы и сахарозы (в массовом соотношении 1:3) в качестве дисахарида и хранящийся при 60°С.
[74]Таким образом, предложенный твердофазный носитель для иммобилизации и хранения образцов нуклеиновых кислот, представляющий из себя пористую целлюлозную основу, обработанную композицией, содержащей детергент, слабое основание, хелатообразующий агент и содержащий дисахарид или смесь дисахаридов, обеспечивает неожиданно высокую стабильность иммобилизованных биологических образцов, содержащих нуклеиновые кислоты, включая ДНК и РНК, в то же время предоставляя возможность эффективной стерилизующей предобработки с помощью этиленоксида или ионизирующей радиации (без утраты полезных свойств носителя).
[76]1. R. Guthrie, A. Susi. A simple method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. // Pediatrics 32: 338-343, 1963. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: http://pediatrics.aappublications.org/content./pediatrics/32/3/338.full.pdf.
[77]2. Julia A. McMillan, Ralph D. Feigin, Catherine DeAngelis, M. Douglas Jones (1 April 2006). Oski's pediatrics: principles & practice. Lippincott Williams & Wilkins. pp. 162. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: https://books.google.ru/books?id=VbjFQiz8aR0C&pg=PA162&hl=ru#v=onepage&q&f=false.
[78]3. М.С.Kline, D.L. Duewer. Polymerase chain reaction amplification of DNA from aged blood stains: quantitative evaluation of the "suitability for purpose" of four filter papers as archival media. //Analytical Chemistry, 2002, volume 74, №8, 1863-1869.
[79]4. G.S. Makowski, F.L. Nadeau. Single tube multiplex PCR detection of 27 cystic fibrosis mutations and 4 polymorphisms using neonatal blood samples collected on Guthrie cards. // Annals of Clinical and Laboratory Science Journal, volume 33, №3, 243-250 (2003).
[80]5. J.V. Mei, J.R. Alexander, et al. Use of Filter Paper for the Collection and Analysis of Human Whole Blood Specimens. //Journal of Nutrition, May 1, 2001, vol. 131, №5, 1631S-1636S. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: http://jn.nutrition.org/content/131/5/1631S.full.
[81]6. Pak Yang Chum, Chas Andre. Direct PCR from Blood Preserved on Whatman FTA and 903 Cards using Thermo Scientific Phusion Blood Direct PCR Kit (2013). Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/brands/Documents/1114/app-note-direct-pcr-from-blood-preserved-on-whatman-fta-903-cards.pdf.
[82]7. М.А. Harvey et al. Impregnated 903(™) Blood Collection Paper: A Tool for DNA Prepartion from Dried Blood Spots for PCR Amplification. // Clinical Chemistry, 1995, volume 41, №6, S108.
[83]8. M.A. Harvey, T.A. King, et al. Impregnated sample collection paper: A tool for preparation of DNA and RNA from dried blood spots for PCR amplification. //Clinical Chemistry, 1995, volume 41, №11, p.1686, abstract #041.
[84]9. Whatman™ Neonatal Screening cards. // GE Healthcare LifeSciences. Опубликовано: 01/2013. Доступно посредством сети Интернет (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/136076 4947442/litdoc28984424_20130214002441.pdf.
[85]10. Патент США №5496562 А, опубликован 05.03.1996; МПК C12N 15/10, C12Q 1/68.
[86]11. 
Aparecida da Silva Aquino. Sterilization by Gamma Irradiation, Gamma Radiation (Edited by Prof. Feriz Adrovic), pp. 171-206. Дата публикации: 2012. Доступно (по состоянию на 16.03.2016); режим доступа: http://www.intechopen.com/books/gamma-radiation/sterilization-by-gamma-irradiation.
[87]12. Патент США №2075845 А, опубликован 06.04.1937; МПК A61L 2/20.
